周耀林, 孫登岳,2, 曾志雄, 李 霞,2

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)部, 濟(jì)南 250000; 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物基材料與綠色造紙國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 濟(jì)南 250000)

多巴胺(3,4-二羥基苯乙胺,DOPA) 是一種廣泛存在于人類和動物腦中的重要神經(jīng)遞質(zhì),在哺乳動物大腦中含量最為豐富,其約占大腦中兒茶酚胺總量的80%[1]。多巴胺生理功能在60多年前被發(fā)現(xiàn)[2],此后人們一直在努力揭示多巴胺在生物體中的作用及其相關(guān)的分子作用機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn),多巴胺參與調(diào)節(jié)一系列的機(jī)體行為調(diào)節(jié)過程,包括運(yùn)動、藥物成癮、長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)、食物攝入和激素分泌等[3-9];多巴胺還與生理過程的調(diào)節(jié)有關(guān),如在大腦外周作為心血功能、血管張力、胃和胃腸道功能的調(diào)節(jié)劑[10]。此外,多巴胺濃度的變化與一些疾病密切相關(guān),如帕金森病、精神分裂癥、阿爾茨海默病和朊病毒病等[11-13]。

多巴脫羧酶(DODC)于1938年首次在哺乳動物腎臟組織中被發(fā)現(xiàn)[14],是酪氨酸合成黑色素代謝途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶[12],可以催化左旋多巴(L-DOPA)脫羧生成多巴胺[15-16]。多巴脫羧酶廣泛存在于哺乳動物、昆蟲和植物中。在哺乳動物中,多巴脫羧酶常見于中樞及外圍組織的神經(jīng)元內(nèi),在肺部、肝部、腎、腎上腺和胃腸道等組織內(nèi)也有較高的表達(dá),參與機(jī)體調(diào)節(jié)。在昆蟲中,多巴脫羧酶合成的多巴胺和5-羥基色氨作為一種幫助角質(zhì)層硬化的前體物質(zhì),對昆蟲的行為和發(fā)育起著重要的作用[17-18]。在植物中,多巴脫羧酶與植物的激素合成和成熟相關(guān),此外,還能產(chǎn)生作為藥物活性分子前體的芳香族生物堿[19]。

本研究對來源于Pseudomonas的DODC蛋白進(jìn)行異源表達(dá)、純化,對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,通過同源序列對比和系統(tǒng)發(fā)育樹對DODC的家族屬性進(jìn)行分析,確定了催化活性的關(guān)鍵位點(diǎn),為以后該酶的利用及其改造提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α和CV6-pGEX-6P-1質(zhì)粒(N-端帶GST標(biāo)簽)等都是本實(shí)驗(yàn)室保藏。酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl等耗材均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海,中國);質(zhì)粒提取試劑盒購自賽默飛公司;Glutathione Sepharose 4B樹脂、離子交換色譜柱購自美國GE公司;限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ、EcoRⅠ、連接酶SolutionⅠ和DNA Polymerase Prime STAR Max均購自Takara Bio公司(北京,中國);超濾管購自Millipore公司。

凝膠成像系統(tǒng)(Analytik Jena公司),SDS-PAGE系統(tǒng)(Hitachi公司),高速冷凍離心機(jī)(Hitachi公司),超聲波破碎儀(美國SONICS公司),蛋白純化儀(美國GE公司),高效液相色譜儀(日本島津公司),PCR儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 DODC載體構(gòu)建

DODC蛋白的基因序列(GeneBank No.WP 010953480.1)在金唯智公司(天津,中國)合成,以該基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物Primer F:CCGGAATTCATGGCCACCCCGGAACAGTTC;Primer R:TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACCTAGCCCTTAATAACATCTTGCAG。通過PCR擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增體系為25 μL,循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸5 s,運(yùn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增的目的基因和載體CV6-pGEX-6P-1用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切,然后進(jìn)行切膠回收,用SolutionⅠ在16 ℃連接25 min。再用熱激法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑單菌落,分別進(jìn)行菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證,最后送樣進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 重組蛋白表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中過夜培養(yǎng),挑取轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到5 mL試管LB培養(yǎng),再轉(zhuǎn)接到1 L搖瓶LB中培養(yǎng),待OD值達(dá)到0.6～0.8,加入異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1 mmol/L,誘導(dǎo)蛋白表達(dá),16 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h,4 ℃條件下4 000 r/min,離心15 min收集菌體。菌體置于裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,10%(體積比)甘油,0.4 mol/L氯化鈉]中,并加入80 μL 50 mg/mL的溶菌酶,40 μL 1 mol/L的PMSF和10 μL β-巰基乙醇混勻。隨后用超聲波破碎儀在低溫條件下破碎細(xì)胞,設(shè)置條件:超聲破碎3 s,間隔5 s,功率40%(總500 W),時(shí)間10 min。破碎液于4 ℃、13 000 r/min離心60 min。取上清液與已平衡好的Glutathione Sepharose 4B樹脂在混合儀上4 ℃溫育2 h,隨后將結(jié)合目的蛋白的樹脂加入一次性層析柱中,用裂解緩沖液洗去雜蛋白,最后用洗脫緩沖液洗掉目的蛋白。用本實(shí)驗(yàn)室純化3C蛋白酶于4 ℃過夜酶切去除GST標(biāo)簽蛋白,最后通過Source Q柱進(jìn)一步純化。

1.2.3 DODC酶學(xué)性質(zhì)測定

以左旋多巴為底物,采用液相色譜法測定DODC的酶活性。反應(yīng)體系(500 μL):100 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.5),2 mmol/L左旋多巴底物,9.6 nmol/L多巴脫羧酶。在40 ℃條件下反應(yīng)5 min后,于沸水浴孵育5 min終止反應(yīng)。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次,并設(shè)置對照組(將酶液替換成緩沖液,其余條件不變)。高效液相色譜條件:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3 μm,4.6 mm×250 mm),流動相:2%乙酸溶液-甲醇(90∶10);流速0.5 mL/min;柱溫:室溫;檢測波長280 nm;進(jìn)樣量40 μL。單位(U)被確定為每分鐘1 μmol產(chǎn)物的生成量。

(1)最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性。在pH 7.0 PBS緩沖液(100 mmol/L)中,將反應(yīng)體系分別置于20～65 ℃條件下進(jìn)行測定[20]。將酶液分別置于20～65 ℃條件下保溫30 min、1 h和2 h ,然后冰浴10 min,測定殘余酶活性,以4 ℃下酶液活性為100%。

(2)最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性。選擇pH 5.5～9.0(100 mmol/L)的緩沖液;MES緩沖液pH 5.5～6.5;PBS緩沖液pH 6.0～9.0; HEPES緩沖液pH 7.0～9.0;Tris-HCl 緩沖液pH 7.0～9.0。在40 ℃條件下進(jìn)行測定,其中以酶活最高者為100%。將酶置于上述不同pH的緩沖液中,4 ℃條件下保溫1 h后測定酶活,其中酶活最高者為100%。

(3)金屬離子對DODC酶活的影響。選擇Ca2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ni2+和Al3+等8種金屬離子,終濃度為0.5 mmol/L,在4 ℃條件下與酶孵育10 min后加入底物,測定酶活[21-23]。以不加金屬離子組作為對照組。

(4)底物特異性。以多巴、色氨酸、酪氨酸、5-羥基色氨酸作為底物,在40 ℃、 pH 7.0下反應(yīng)5 min,測定酶活。以多巴、酪氨酸、5-羥基色氨酸為底物的檢測波長為280 nm,以色氨酸為底物的檢測波長為275 nm[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建及雙酶切驗(yàn)證

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒,用菌落PCR的方法初步驗(yàn)證,獲得1條單一條帶,結(jié)果見圖1(a),條帶約為1.4 kb,這與目的基因的長度一致;利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅠ對重組質(zhì)粒DODC-CV6進(jìn)行酶切驗(yàn)證,獲得2條大小分別為1.4 kb和5 kb的條帶[圖1(b)],5 kb的條帶與載體的長度一致,1.4 kb的條帶與目的基因的長度一致;經(jīng)驗(yàn)證序列正確,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

(a)1、2: PCR產(chǎn)物;M:DNA Marker;(b)1、2:雙酶切驗(yàn)證;M:DNA Marker。圖1 DODC菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證Figure 1 Enzyme digestion and colony PCR of DODC-CV6

2.2 DODC表達(dá)純化

利用生物信息學(xué)軟件DANMAN分析DODC核酸序列,預(yù)測其分子質(zhì)量約為51.5 ku,GST標(biāo)簽的大小為26 ku,所以GST-DODC融合蛋白理論值為77 ku。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析[圖2(a)],15 mmol/L谷胱甘肽的洗脫緩沖液中含有較多的目標(biāo)蛋白,說明DODC與Glutathione Sepharose 4B樹脂親和力較強(qiáng),且蛋白分子質(zhì)量和預(yù)測值大致一樣。

(a)GST-DODC純化蛋白SDS-PAGE分析[ 1:超聲樣;2:上清樣;3:流穿樣;4、5:洗滌樣;6～8:洗脫樣(15 mmol/L 谷胱甘肽)]。(b) 酶法去掉融合標(biāo)簽GST(1:酶切前;2:酶切后)。(c) GST-DODC離子交換層析及SDS-PAGE結(jié)果。圖2 DODC蛋白純化示意圖Figure 2 Purification of DODC

通過親和層析后獲得較純蛋白,直接以質(zhì)量比50∶1的比例加入3C蛋白酶,4 ℃過夜酶切,從SDS-PAGE 圖[圖2(b)]可以看出,GST-DODC融合蛋白被切分為51.5 ku的DODC蛋白和26 ku的GST標(biāo)簽。

通過Source Q陰離子吸附層析柱,利用 GE Healthcare的 AKTApure蛋白純化儀對蛋白進(jìn)一步進(jìn)行離子吸附層析純化。從陰離子吸附層析圖[圖2(c)]中可以看出,GST標(biāo)簽在47 mL流出,DODC蛋白在56 mL流出。結(jié)合SDS-PAGE圖分析能夠得到純度較高的目的蛋白,可以用于蛋白濃度的測定和酶活測定。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 溫度對DODC催化活性及穩(wěn)定性的影響

溫度對酶活性具有較大影響。隨著溫度的升高,底物分子熱運(yùn)動加快,分子碰撞的機(jī)會增加,從而提高了酶的活性。但溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性失活。由圖3(a)可得,DODC最適催化溫度為40 ℃。在35～45 ℃時(shí),相對酶活保持70%以上;當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)酶活急劇下降,在65 ℃時(shí)酶活低于40%,因此DODC在體外的最適催化溫度范圍為35～45 ℃。

(a) 溫度對DODC酶活的影響;(b) DODC的熱穩(wěn)定性。圖3 溫度對DODC酶活和熱穩(wěn)定性的影響Figure 3 Effect of temperature on DODC enzyme activity and thermal stability

由圖3(b)可知,隨著保溫時(shí)間增加,酶活性不斷下降,并且溫度越高、保存時(shí)間越長其活性下降程度越大。DODC在20～30 ℃,保溫2 h的情況下,酶活性保留50%以上,當(dāng)保存溫度高于35 ℃時(shí),隨著保存時(shí)間的增加,活性下降幅度越大。因此,DODC對溫度較為敏感。

2.3.2 pH對DODC催化活性及穩(wěn)定性的影響

pH是影響酶活性的另一個(gè)重要因素。當(dāng)酶處于過酸或者過堿的環(huán)境時(shí),都會造成酶不可逆的失活。由圖4(a)可知,DODC催化反應(yīng)的最適 pH 緩沖液為 PBS(pH 7.5),在pH值小于7.5時(shí),酶活性隨著緩沖液pH的增加逐漸升高;當(dāng)pH值大于7.5時(shí),酶活性隨著緩沖液pH增加逐漸降低。在同樣pH條件下,與Tris-HCl和HEPES 緩沖液相比較,PBS緩沖液更適合DODC的催化反應(yīng)。極端pH條件如pH 6.0及以下,DODC的相對酶活低于30%。因此,DODC最適緩沖液是 PBS且最適pH值為7.5。由圖4(b)可知,在pH 6.0～7.5時(shí),酶活仍可以保留80%以上活性,在pH 6.5時(shí),DODC最穩(wěn)定;在pH 8.0～9.5時(shí),酶活性已經(jīng)低于50%。

(a) pH對DODC酶活的影響;(b) DODC的pH穩(wěn)定性。圖4 pH對DODC酶活和催化穩(wěn)定性的影響Figure 4 Effect of pH on the DODC activity and stability

2.3.3 金屬離子對DODC酶活的影響

由圖5可知,在一系列陽離子中,Cu2+、Zn2+、Ni2+、Al3+對DODC酶活均有抑制作用,其中,Cu2+的抑制作用最明顯,相對酶活為80%。Mg2+、Mn2+、Fe2+對DODC酶有促進(jìn)作用,其中,Ca2+在這8種陽離子中對酶活促進(jìn)作用最為明顯,使酶活提高10%。

不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖5 不同陽離子對DODC酶活的影響Figure 5 Effect of different cations on the activity of DODC

2.3.4 酶動力學(xué)參數(shù)和底物特異性

以濃度為0.5～12 mmol/L左旋多巴作為底物測試酶動力學(xué)參數(shù),用GraphPad 8.0.2的Michaelis-Menten方程非線性擬合處理數(shù)據(jù),得到DODC對左旋多巴的動力學(xué)參數(shù)Km為1.013 mmol/L,kcat為37.76 s-1,kcat/Km為37.76 s-1mmol/L-1)。

實(shí)驗(yàn)分別測定了DODC對酪氨酸、5-羥基色氨酸、左旋多巴和色氨酸的底物特異性。由圖6(a)可知, DODC對左旋多巴的酶活最高,其次為酪氨酸和5-羥基色氨酸,對色氨酸幾乎沒有活性。從4種底物的結(jié)構(gòu)分析可知,酪氨酸與左旋多巴的結(jié)構(gòu)較為相似,僅苯環(huán)3號C位多了一個(gè)羥基,因此,DODC對酪氨酸的催化活性僅次于左旋多巴,相對酶活可達(dá)79.8%。DODC對色氨酸幾乎沒有活性,5-羥基色氨酸與色氨酸結(jié)構(gòu)較為相似,但在苯環(huán)5號C位多了一個(gè)羥基,故DODC對5-羥基色氨酸的相對酶活也極低,僅為7.2%。因此,DODC的最適底物為左旋多巴。此外,進(jìn)一步分析左旋多巴的催化產(chǎn)物,由圖6(b)液相色譜圖可知,DODC催化左旋多巴的產(chǎn)物峰在6.81 min出現(xiàn),產(chǎn)物為多巴胺。

(a)不同底物DODC的酶活性;(b)高效液相色譜法檢測左旋多巴的催化產(chǎn)物。不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。圖6 DODC的底物特異性Figure 6 Substrate specificity of DODC

2.4 DODC 的序列同源性分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫,通過BLAST功能獲得與DODC氨基酸序列相近的其他來源的多巴脫羧酶氨基酸序列,采用Clustal X 進(jìn)行序列比對,然后用Espript 3.0進(jìn)行著色美化,結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示來源于Pseudomonassp. FW305-E2 、Pseudomonassp. USTB-Z 、Pseudomonassp. BP6 、Pseudomonassp. PNP、Susscrofa的脫羧酶的相似度較高,其中,與來自Pseudomonassp. FW305-E2的多巴脫羧酶相似度為99%。將獲得的不同來源的脫羧酶序列采用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖8所示。結(jié)合序列對比分析,DODC屬于AAT-Ι 超家族,其保守的催化結(jié)合位點(diǎn)為Thr 241,這也與報(bào)道的Pseudomonassp. PNP DOPA decarboxylase是一致的[25-26]。

圖7 DODC氨基酸序列比對Figure 7 Sequence alignment of DODC

圖8 DODC系統(tǒng)樹分析Figure 8 Phylogenetic analysis of DODC

3 結(jié)論

多巴脫羧酶屬于芳香族氨基酸脫羧酶,可以將左旋多巴催化產(chǎn)生多巴胺。多巴胺作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能,預(yù)防高等動物的精神病和神經(jīng)退行性疾病。此外,多巴脫羧酶已被確定為癌細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物。研究表明DODC基因的表達(dá)有助于腫瘤和癌細(xì)胞的鑒別診斷,其酶活性是體外區(qū)分小細(xì)胞肺癌(SCLC)與其他肺癌類型的重要標(biāo)志物。腫瘤患者中DODC蛋白水平高者比水平低者更容易康復(fù)。因此,多巴脫羧酶對癌細(xì)胞類型的鑒別診斷,以及人類癌癥的治療都有重要的意義。

本研究將多巴脫羧酶(DODC)在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá),經(jīng)過GST-樹脂親和層析、3C蛋白酶切和離子交換層析,獲得了純度在95%以上的DODC純化蛋白,這為以后的蛋白結(jié)晶以及結(jié)構(gòu)解析提供了前提條件。與此同時(shí),還測定了DODC蛋白的酶學(xué)性質(zhì),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DODC酶的最適溫度為40 ℃;最適pH 7.5,已報(bào)道DODC(WP 088512758.1)的最適溫度為55 ℃;最適pH 8.0,兩種酶性質(zhì)較為接近[27]。金屬離子Ca2+對DODC酶具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,酶活提高了10%,Cu2+對DODC酶的抑制作用最為明顯,相對酶活為對照組的80%,相較已報(bào)道的DODC(WP 088512758.1),來源于Pseudomonas的DODC酶對金屬離子的耐受性更強(qiáng)。DODC的特異性底物為左旋多巴,催化產(chǎn)物為多巴胺。kcat/Km與酶的催化效率成正比,與酶的活性有直接關(guān)系,而DODC對左旋多巴的kcat/Km為37.76 s-1mmol/L-1,是DODC(WP 088512758.1)的1.76倍,所以DODC比DODC(WP 088512758.1)有更好的應(yīng)用前景[27]。通過序列同源性分析,確定DODC屬于AAT-Ι 超家族,預(yù)測了該酶的催化位點(diǎn)為Thr 241,這為后續(xù)酶的定向改造和催化機(jī)制解析提供了條件。本研究對DODC的理化性質(zhì)進(jìn)行基礎(chǔ)研究,為以后該蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析和催化機(jī)理的解析提供了一定理論基礎(chǔ)。