裴 沛, 湯正權(quán)

(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 230601)

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,由胞體、樹突和軸突構(gòu)成。1個神經(jīng)元可以有1個或多個樹突,樹突接受來自其他神經(jīng)元的信息輸入,隨后傳輸給胞體,再到軸突,可起到聯(lián)絡(luò)神經(jīng)的作用。樹突分支的大小、密度和幾何形狀決定了與傳入軸突形成的突觸連接類型和數(shù)量[1]。小腦浦肯野神經(jīng)元胞體呈梨形,頂端發(fā)出2～3條粗大的主樹突。浦肯野細胞樹突形態(tài)是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最顯眼的神經(jīng)元樹突形態(tài),因其具有特征性的平面扇形枝晶,枝晶分支廣泛且?guī)缀跆顫M空間沒有重疊。這種樹突形態(tài)非常適合接收來自十萬多個平行纖維興奮性突觸輸入,并與平行纖維呈正交形態(tài)分布[2]。浦肯野細胞樹突的特殊形狀分布為分析神經(jīng)元樹突的形態(tài)和發(fā)育提供了最佳模型[3]。小鼠浦肯野細胞在胚胎時第10至13天從心室區(qū)出現(xiàn),在16至17天時遷移至小腦皮層。遷移后的浦肯野細胞呈現(xiàn)梭形形狀,并帶有一些原始的頂端樹突。出生后小鼠浦肯野細胞形態(tài)發(fā)育具有3個特征階段:從P0到P9的快速體細胞生長期,從P9到P18的快速樹突生長期,以及P18之后的緩慢樹突生長期直至成年[4]。浦肯野細胞樹突在出生后3周內(nèi)延伸、分支并與平行纖維、攀緣纖維中間神經(jīng)元形成突觸。浦肯野細胞樹突形態(tài)發(fā)生的特征之一是初級樹突的延伸和收縮。與成熟的浦肯野細胞相比,未成熟的浦肯野細胞在小鼠出生后第1周有幾個初級樹突。在出生后第2周,大多數(shù)浦肯野細胞失去初級樹突。因此,浦肯野細胞樹突的形態(tài)在出生后小腦發(fā)育過程中發(fā)生了顯著變化[5]。浦肯野細胞似乎對衰老相當敏感,在衰老過程中表現(xiàn)出形態(tài)和功能的顯著變化,如細胞數(shù)量減少、體細胞萎縮、樹枝狀樹突收縮、亞細胞器退化、突觸密度下降、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂和電生理特性的改變[6]。浦肯野細胞廣泛分布于小腦皮層區(qū)域,在小腦4&5cb、Sim、Crus1和Crus2區(qū)域皆存在表達。此分區(qū)方式參考文獻[7]。Crus 1和Crus 2區(qū)域在小腦后半球中占很大比例,在認知、記憶、詞匯習得和言語檢索、大腦執(zhí)行控制環(huán)路等方面發(fā)揮作用[8]。盡管目前已知浦肯野細胞形態(tài)在發(fā)育階段存在變化,但隨年齡段變化時其形態(tài)功能變化尚不完全清楚。本文旨在研究浦肯野細胞在不同年齡段小鼠小腦內(nèi)的形態(tài)變化,利用小白蛋白(parvalbumin, PV)作為浦肯野細胞標記物,對不同年齡段小鼠小腦中小白蛋白進行免疫熒光染色,觀察浦肯野細胞胞體和樹突形態(tài)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠購自合肥青源生物科技有限公司,共20只,雌雄各半。隨機挑選14天齡、1月齡、2月齡、1年齡共4組年齡段小鼠,每組5只,每組小鼠體重差別在5 g以內(nèi)。實驗動物飼養(yǎng)于安徽大學(xué)動物房,其飼養(yǎng)遵循小鼠正常生長所需條件,恒溫20 ℃,光照12 h與黑暗12 h交替。所有動物程序均符合安徽大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定(2020—039)。

1.2 方法

1.2.1 心臟灌注

戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射于小鼠體內(nèi)使其深度麻醉,用鑷子夾腳趾沒有收縮反應(yīng)后,剪開小鼠胸腔與腹腔,暴露其心臟。將吸有1×PBS的針管從小鼠左心室中插入,緩慢將1×PBS灌入心臟,剪開右心房使1×PBS排出。持續(xù)灌注1×PBS直至小鼠肝臟完全變白,隨后將1×PBS換成4% PFA繼續(xù)灌注,待小鼠尾巴與四肢僵硬后停止灌注,隨后分離腦組織。

1.2.2 組織處理

將心臟灌注后分離的腦組織用4% PFA于4 ℃固定過夜,隨后用15%蔗糖溶液(50 mL)于4 ℃脫水48 h,繼續(xù)用30%蔗糖溶液(50 mL)于4 ℃脫水72 h。固定脫水完成后放置冷凍切片機(CM1900,Leica)中切片,切片厚度為40 μm,收集Bregma -6.72至Bregma -5.68之間的小腦切片。

1.2.3 免疫熒光

將小腦腦片浸泡于1×PBS中,用1×PBS沖洗3次,每次10 min后加入封閉液(5% BSA、0.5% TritonX-100、94.5% PBS)常溫封閉1 h,隨后用PV一抗(1∶600,parvalbumin antibody-195002,synaptic system,德國)4 ℃孵育24 h過夜。一抗孵育完成后用1×PBS沖洗3次,每次10 min,隨后用PV二抗(1∶800,IgG488,A24221,Abbkine,中國武漢)室溫避光孵育1.5 h,后用1×PBS沖洗3次,每次10 min。完成后將小腦腦片置于載玻片上,待1×PBS干透后滴入抗熒光淬滅劑(7 μL),用蓋玻片輕放于載玻片上,避光靜止5 min后用甲油封鎖載玻片邊緣防止空氣進入。

1.2.4 共聚焦顯微鏡拍攝

用Olympus vs200 AW和Olympus spin sr拍攝20×、40×和100×的小腦腦片,固定值為120～40,光源470,曝光強度4 %,曝光時間75 ms。

1.2.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。使用OlyVIA、Origin等軟件進行單因素方差分析與非參數(shù)檢驗分析,統(tǒng)計結(jié)果使用Origin軟件作圖,P<0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡段小鼠小腦4&5cb、Sim、Crus1和Crus2分區(qū)中浦肯野細胞胞體大小和樹突長度的比較

對14天齡、1月齡、2月齡、1年齡小鼠小腦4個分區(qū)4&5cb、Sim、Crus1和Crus2浦肯野細胞表達的小白蛋白(PV)進行免疫熒光染色,檢測并比較浦肯野細胞樹突長度、浦肯野細胞胞體面積[圖1 (a)]。研究發(fā)現(xiàn):4個年齡段中4&5cb區(qū)域樹突長度顯著低于其他3個區(qū)域(P<0.05),見圖1(c)～圖1(f);4&5cb區(qū)域胞體面積顯著小于Sim區(qū)域(P<0.05),見圖1 (c)～圖1(f)。結(jié)果表明4&5cb區(qū)域浦肯野細胞胞體面積及樹突發(fā)育水平較低。

(a)小鼠小腦浦肯野細胞PV免疫熒光染色圖,本圖選取2月齡小鼠為例;(b)小鼠小腦4個分區(qū)浦肯野細胞PV免疫熒光染色情況,年齡段為2月齡,左圖從上至下分區(qū)為4&5cb、sim、Crus1和Crus2,右圖箭頭標注為浦肯野細胞胞體;(c)～(f)小腦4個分區(qū)浦肯野細胞樹突長度與細胞面積統(tǒng)計圖,年齡段從左至右分別為14天齡、1月齡、2月齡和1年齡。* 為P<0.05,** 為P<0.01,*** 為P<0.001。圖1 4組年齡段小鼠小腦不同分區(qū)浦肯野細胞分析Figure 1 Analysis of Purkinje cells in different regions of mice cerebellum in four age groups

2.2 小鼠小腦浦肯野細胞樹突長度及胞體面積隨年齡段變化趨勢

將小鼠小腦浦肯野細胞的樹突長度、胞體面積在不同年齡段之間橫向比較(圖2),發(fā)現(xiàn)2月齡小鼠小腦浦肯野細胞樹突長度顯著高于1月齡與1年齡小鼠(P<0.05),見圖2(d);1年齡小鼠小腦浦肯野細胞樹突長度顯著低于14天齡、1月齡、2月齡小鼠(P<0.05),見圖2(d)。小鼠小腦浦肯野細胞樹突長度從14天至2月齡整體呈上升趨勢,2月齡后整體呈下降趨勢[圖2(b)],揭示浦肯野細胞樹突生長隨年齡存在先升高后下降的變化趨勢。浦肯野細胞胞體面積從14天齡至1年齡則整體呈現(xiàn)下降趨勢[圖2(e)]。

(a) 4組年齡段小鼠小腦4&5cb、sim、Crus1和Crus2 4個區(qū)域浦肯野細胞PV免疫熒光染色;(b)～(e)浦肯野細胞樹突長度和胞體面積隨年齡變化趨勢。* 為P<0.05,** 為P<0.01,*** 為P<0.001。圖2 4組年齡段小鼠小腦浦肯野細胞形態(tài)分析Figure 2 Morphological analysis of Purkinje cells in mice cerebellum of four age groups of mice

2.3 不同年齡段小鼠小腦浦肯野細胞胞體和樹突PV表達水平的比較

分析不同年齡段小鼠小腦4個分區(qū)中浦肯野細胞胞體和樹突中小白蛋白(PV)平均熒光強度,熒光強度結(jié)果如圖3所示。將不同年齡段間浦肯野細胞胞體、樹突熒光強度橫向比較,見圖4,發(fā)現(xiàn)小鼠小腦胞體PV表達水平皆強于樹突PV表達水平(P<0.05),見圖4(a);1年齡小鼠小腦浦肯野細胞樹突PV表達量較其他年齡段顯著性升高(P<0.05),見圖4(c)和(e);但1年齡小鼠小腦浦肯野細胞樹突長度卻顯著性降低,故推測PV在浦肯野細胞樹突的表達可能與浦肯野細胞樹突生長存在拮抗作用。

(a)～(d) 4個年齡段小鼠小腦不同區(qū)域浦肯野細胞PV表達情況及其平均熒光強度比較。* 為P<0.05,** 為P<0.01,*** 為P<0.001。圖3 4組年齡段小鼠小腦浦肯野細胞PV熒光強度比較Figure 3 Comparison of PV fluorescence intensity of cerebellar Purkinje cells in mice of four age groups

(a)小鼠小腦不同區(qū)域浦肯野細胞胞體和樹突PV平均熒光強度比較;(b)～(e) 4個年齡段小鼠小腦浦肯野細胞胞體和樹突PV平均熒光強度比較。* 為P<0.05,** 為P<0.01,*** 為P<0.001。圖4 4組年齡段小鼠小腦浦肯野細胞PV熒光強度分析Figure 4 Analysis of PV fluorescence intensity of cerebellar Purkinje cells in mice of four age groups

3 討論

本研究利用PV免疫染色方法,分析不同年齡段小鼠小腦4&5cb、Sim、Crus1和Crus2區(qū)域浦肯野細胞發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)浦肯野細胞在小腦不同分區(qū)存在明顯差異,4&5cb區(qū)域浦肯野細胞樹突長度低于其他區(qū)域,2月齡小鼠浦肯野細胞樹突長度高于其他年齡組,浦肯野細胞面積隨小鼠年齡升高而降低。同時比較PV在小鼠小腦浦肯野細胞內(nèi)的熒光表達,結(jié)果表明PV在浦肯野細胞樹突上表達隨年齡段先降低后升高,1年齡小鼠PV表達最強烈。

已有研究表明浦肯野細胞在小腦堆積密度方面表現(xiàn)出明顯的區(qū)域差異性,小腦葉基部浦肯野細胞比頂端少,前葉的堆積密度大于后葉[10],進一步證實浦肯野細胞發(fā)育的分區(qū)差異。已知浦肯野細胞產(chǎn)生兩種不同類型的動作電位,浦肯野細胞區(qū)域差異性的存在可導(dǎo)致其連接的平行纖維密度存在差異,從而在功能上影響放電程度[11]。后續(xù)可從放電程度方面探究浦肯野細胞在4個分區(qū)上的差異性,以尋求不同分區(qū)上浦肯野細胞功能變化。關(guān)于浦肯野細胞隨年齡段生長所呈現(xiàn)的發(fā)育變化,已有研究表明小腦浦肯野細胞在年齡段中呈現(xiàn)不同生長狀態(tài),浦肯野細胞在出生后第3周經(jīng)歷動態(tài)樹突重塑[12]。另有研究表明浦肯野細胞總分支長度隨年齡段升高而降低,每個浦肯野細胞上的總樹突表面積和樹突棘總數(shù)在20日齡達到高峰后隨年齡的增長而下降[13]。樹突生長受到突觸形成的穩(wěn)態(tài)調(diào)控,突觸的形成在早期促進樹突生長,但在后期抑制樹突的生長[14]。本研究針對浦肯野細胞樹突長度和細胞面積著手研究,對浦肯野細胞突觸和樹突生長之間的關(guān)系有待進一步論證。關(guān)于PV對浦肯野細胞發(fā)育的影響作用,有研究表明PV和鈣結(jié)合蛋白D-28K的缺失導(dǎo)致浦肯野細胞脊柱長度加倍、體積與表面積增加以及更聚集的脊柱分布[15]。這與本研究PV表達升高時浦肯野細胞樹突長度降低吻合,支持PV對浦肯野細胞發(fā)育存在拮抗作用的猜想。另有研究在野生型小鼠和PV敲除鼠的中間神經(jīng)元-浦肯野細胞的配對記錄中發(fā)現(xiàn)PV能有效地調(diào)節(jié)短期突觸可塑性[16]。

目前浦肯野細胞發(fā)育隨年齡段變化的作用機制尚未清晰。研究表明雌二醇通過小腦中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子作用,誘導(dǎo)發(fā)育中的浦肯野細胞樹突生長、樹突棘發(fā)生和突觸發(fā)生[17]。同時星形膠質(zhì)細胞可調(diào)節(jié)浦肯野細胞軸體和軸棘突觸的數(shù)量,誘導(dǎo)浦肯野細胞樹突棘增殖,促進浦肯野細胞結(jié)構(gòu)和功能成熟[18]。另外線粒體途徑可能有助于浦肯野細胞的形態(tài)發(fā)育[19]。

本研究針對浦肯野細胞形態(tài)發(fā)育變化和PV表達變化,闡明小鼠浦肯野細胞樹突隨年齡段增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,浦肯野細胞胞體大小隨年齡段增加逐漸減小。PV表達隨年齡段增加呈現(xiàn)升高趨勢,引發(fā)PV對浦肯野細胞生長存在拮抗作用的猜想,為后續(xù)浦肯野細胞研究奠定基礎(chǔ),但對浦肯野細胞發(fā)育的功能機制研究尚未清晰,需進一步研究論證。