劉鐵重,高志強,侯德欣,謝希賢,2,吳鶴云,2*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學),天津,300457)

肌苷(inosine),又稱次黃苷、次黃嘌呤核苷等,是復合鮮味劑“I+G”的重要原料,廣泛應用于食品生產(chǎn)領域,另外,肌苷作為抗病毒藥物的前體,以及具有鎮(zhèn)靜、擴張血管等作用在醫(yī)藥領域也發(fā)揮著重要作用[1-2],因此肌苷是一種具有較高經(jīng)濟和社會價值的生物制品。目前微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)肌苷的主要方法,但是目前已有肌苷生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)效率仍舊較低,且存在營養(yǎng)缺陷、副產(chǎn)物積累和攜帶質(zhì)粒等弊端,影響發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷的工業(yè)化應用。

肌苷的生物合成是從5-磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)和谷氨酰胺(glutamine,Gln)開始,首先經(jīng)過十步酶促反應生成肌苷酸(inosinic acid,IMP)[3],IMP在5′-核苷酸酶的催化下生成肌苷(圖1)。IMP作為肌苷合成的直接前體物,也是嘌呤生物合成的中心代謝產(chǎn)物,其生物合成受到嚴格的調(diào)控,另外,腺苷和鳥苷合成支路與肌苷合成競爭碳流,這是限制肌苷大量合成的關鍵因素。因此,為了構(gòu)建肌苷生產(chǎn)菌,常規(guī)的育種策略包括增強IMP的從頭合成途徑,強化前體物供應,解除IMP合成的反饋調(diào)節(jié)機制,阻斷降解途徑和競爭途徑等。ASAHARA等[4]通過敲除枯草芽孢桿菌KMBS436中阻遏蛋白編碼基因purR和嘌呤操縱子核糖開關,優(yōu)化嘌呤操縱子的啟動子序列,解除了嘌呤合成所受的反饋調(diào)節(jié)機制,并加強了嘌呤的從頭合成途徑;并進一步通過敲除腺苷酸琥珀酸合成酶的基因(purA)和IMP脫氫酶基因(guaB),阻斷肌苷合成的競爭途徑,最終使肌苷產(chǎn)量從1.8 g/L 提升至6.0 g/L。SHIMAOKA 等[5]在大腸桿菌突變菌 I-9 m中過表達了purFK326Q和prsD128A突變基因,解除了限速酶受到的反饋抑制并加強了前體物PRPP的合成,使肌苷產(chǎn)量達到了7.5 g/L。LI等[6]通過敲除枯草芽胞桿菌BS017中的purA基因來阻斷腺苷合成支路,肌苷產(chǎn)量從0.15 g/L提升至7.6 g/L。PEIFER等[7]通過阻斷谷氨酸棒桿菌(ATCC13032)中的腺苷和鳥苷合成支路,使IMP產(chǎn)量增加了45倍。WANG等[8]通過對枯草芽孢桿菌定向進化,降低腺苷酸琥珀酸合成酶的活性,使肌苷產(chǎn)量提高了約4.7倍。以往的研究發(fā)現(xiàn),調(diào)整鳥苷和腺苷的合成通量對IMP合成起著非常關鍵的作用,但是直接阻斷鳥苷和腺苷途徑會造成缺陷型,導致菌體生長和肌苷生產(chǎn)受限,雖然補充一定量的鳥嘌呤和腺嘌呤會使生長恢復,但是必須嚴格控制用量,這增加了工藝控制的難度和生產(chǎn)成本。因此如何調(diào)控鳥苷和腺苷的合成通量,協(xié)調(diào)菌體生長和肌苷生產(chǎn)是肌苷生產(chǎn)菌株構(gòu)建的難點。

圖1 肌苷合成途徑及本研究的改造策略

本課題在前期的研究工作中,通過一系列代謝工程策略的組合運用,構(gòu)建了一株肌苷生產(chǎn)菌株[9]。該菌株雖不是缺陷型,但是由于腺苷合成途徑太弱,菌株肌苷生產(chǎn)性能仍受到了一定的限制,為了獲得更高的肌苷生產(chǎn)效率,需要添加一定量的腺嘌呤。本研究在5 L發(fā)酵罐上對腺嘌呤的添加量進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)隨著腺嘌呤添加量的提升,肌苷的產(chǎn)量也顯著提升,但是相應副產(chǎn)物的積累也顯著增加。為此,本研究又繼續(xù)對肌苷酸節(jié)點代謝進行了優(yōu)化,包括進一步強化腺苷代謝途徑,減弱鳥苷合成支路,以及通過5′-核苷酸酶的篩選和強化以進一步增強肌苷的合成(圖1),降低鳥苷酸等副產(chǎn)物的積累,并避免了腺嘌呤的添加,為肌苷的發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白胨10,氯化鈉5,牛肉膏10,葡萄糖5,瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白胨3,KH2PO4·3H2O 1.3,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 10 mg/L,MnSO4·H2O 10 mg/L。維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各2 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉4,蛋白胨5,KH2PO4·3H2O 2,MgSO4·7H2O 3,檸檬酸鈉·2H2O 2,FeSO4·7H2O 10 mg/L,MnSO4·H2O 10 mg/L。維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各2 mg/L。

1.3 菌株構(gòu)建及發(fā)酵方法

1.3.1 基因編輯方法

本研究采用CRISPR/Cas9技術[10-11]對菌株基因組進行改造,該方法中包括pGRB和pREDCas9兩個質(zhì)粒。將含有pGRB同源序列和特定sgRNA序列的雙鏈DNA與線性化pGRB在同源重組酶作用下形成gRNA表達質(zhì)粒;重組片段則通過重疊PCR制備。首先將pREDCas9質(zhì)粒導入大腸桿菌感受態(tài)細胞中,再將pGRB質(zhì)粒和重組片段導入到含有pREDCas9質(zhì)粒的感受態(tài)細胞,然后篩選陽性重組子,最后依次消除pGRB和pREDCas9質(zhì)粒,完成菌株構(gòu)建。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵

將菌株接種至斜面培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h后,將菌體接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)28 h,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加苯酚紅作為指示劑,根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化手動補加氨水以維持培養(yǎng)基pH值為7.0左右。

1.3.3 分批補料發(fā)酵

菌株在裝有種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進行菌體活化,發(fā)酵過程pH為7.0左右,溫度37 ℃,溶氧保持在15%～25%,當OD600達到10～16時,按15%的接種量接入5 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵過程維持pH值為7.0左右,溫度35 ℃,溶氧控制在20%～30%。發(fā)酵過程中流加質(zhì)量濃度為800 g/L的葡萄糖溶液,維持罐中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1～5 g/L。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄水平測定

使用試劑盒Easep?Super RNA kit(Promega,上海)提取總RNA,然后使用試劑盒PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa, 大連)進行反轉(zhuǎn)錄,相關操作參照說明書。通過RT-PCR測定基因相對轉(zhuǎn)錄量,采用嵌合熒光法(TB Green?Premix ExTaqTM Ⅱ,Takara),16S rRNA作為內(nèi)標,RT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進行分析。

1.5 檢測方法

菌體生物量以發(fā)酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表征。

肌苷及其他嘌呤類副產(chǎn)物濃度采用HPLC方法檢測：所用儀器為Thermo U3000;色譜柱為phenomenex Gemini 5u C18 110A(150 mm×4.6 mm);流動相為2%乙腈和0.05%三氟乙酸的混合水溶液;柱溫30 ℃;流速 1 mL/min;檢測波長260 nm。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標準差。利用t檢驗雙尾分布對兩組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。“*”表示P<0.05,表示結(jié)果差異顯著;“**”表示P<0.01,表示結(jié)果差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺嘌呤添加對INO4-5發(fā)酵的影響

INO4-5是實驗室前期構(gòu)建的一株肌苷生產(chǎn)菌,分別對嘌呤從頭合成途徑、肌苷的降解途徑和肌苷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進行了改造。特別是弱化了腺苷酸琥珀酸合成酶(PurA)的活性,在不造成缺陷型的前提下實現(xiàn)了肌苷的積累,但是由于PurA的活性過低,生長還是受到了明顯抑制,添加一定量的腺嘌呤可恢復菌體生長并促進肌苷的生產(chǎn)。本研究在5 L發(fā)酵罐上對腺嘌呤的添加量進行了優(yōu)化。結(jié)果如圖2所示,在不添加腺嘌呤時,菌體生長和肌苷生產(chǎn)性能都比較低,而隨著腺嘌呤添加量的增加,菌體的生長和肌苷的產(chǎn)量在也逐漸增加。當腺嘌呤添加量為3 g/L時,肌苷的最大產(chǎn)量可以達到30.6 g/L,OD600值可達85.8,繼續(xù)增加腺嘌呤的添加量雖然使得最大OD600值提高至92.4,但對肌苷生產(chǎn)影響不大。結(jié)果表明INO4-5中PurA的活性過低,雖然實現(xiàn)了不用額外添加腺嘌呤也能積累一定量的肌苷,但是由于菌體生長受到明顯抑制,需要補充定量的腺嘌呤才能獲得較高的肌苷產(chǎn)量。另外對不同腺嘌呤的添加量下,INO4-5發(fā)酵液中的副產(chǎn)物進行了檢測(圖2-C),發(fā)現(xiàn)有腺苷酸,鳥嘌呤和鳥苷酸等副產(chǎn)物的積累,并且這些副產(chǎn)物的濃度也會隨著腺嘌呤添加量的增加而增加。腺嘌呤的添加會增加發(fā)酵工藝的復雜程度,提高發(fā)酵成本;鳥苷酸等副產(chǎn)物的積累會抑制嘌呤操縱子的表達[8],不利于肌苷的合成,降低碳源的利用率,同時增加了下游的提取難度。為解決這兩個問題則需進一步優(yōu)化IMP節(jié)點的代謝流。

A-肌苷產(chǎn)量曲線;B-菌體生長曲線;C-副產(chǎn)物濃度圖2 腺嘌呤添加量對肌苷發(fā)酵的影響

2.2 優(yōu)化purA基因的轉(zhuǎn)錄表達對肌苷發(fā)酵的影響

肌苷合成的直接前體是肌苷酸,但是肌苷酸除了在5′-核苷酸酶的作用生成肌苷外,還會在腺苷酸琥珀酸合成酶(purA基因編碼)的作用下生成腺苷酸琥珀酸,從而流向腺苷的合成,也會在IMP脫氫酶(guaB編碼)的作用下生成黃苷酸(xanthylic acid,XMP),進而流向鳥苷合成途徑。因此肌苷的過量生產(chǎn)需要適當弱化腺苷和鳥苷合成支路碳流來實現(xiàn)[12],使代謝通量轉(zhuǎn)向肌苷生產(chǎn)。INO4-5中腺苷合成支路的PurA活性太弱,導致菌體內(nèi)的ATP供應不足,抑制了菌體的生長并限制了肌苷生產(chǎn),因此在發(fā)酵過程中仍需要添加腺嘌呤才能獲得較好的發(fā)酵結(jié)果,這無疑增加了肌苷發(fā)酵生產(chǎn)的成本。因此為了避免腺嘌呤的添加,同時滿足菌體生長和肌苷生產(chǎn)的需要,需要對PurA的活性進行適當?shù)膹娀?。為?本研究引入了來源于枯草芽孢桿菌的purAbsu基因,并分別使用了5個表達強度依次增加的啟動子(BBa_J23114、BBa_J23105、BBa_J23110、BBa_J23106和BBa_J23101,啟動子來源于https：//parts.igem.org/Promoters/Catalog/Anderson)來啟動purAbsu基因的表達,構(gòu)建了菌株INO5-1～5。將INO4-5和INO5-1～5六株菌進行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖3-A所示。結(jié)果顯示,強化purAbsu基因后,菌體的生長得以恢復,并且隨著啟動子強度的增強,菌體的生長也越來越好。但是purAbsu的表達過強,會導致代謝流過多流向腺苷支路,從而減少肌苷的生產(chǎn),其中,INO5-2的肌苷產(chǎn)量最高,達到6.4 g/L,最大OD600值可恢復至37。另外,基因的表達也跟核糖體結(jié)合位點(ribosomebinding site,RBS)有關,于是本研究對INO5-2中purAbsu基因的RBS進行了替換,繼續(xù)微調(diào)purAbsu基因的表達強度。選用了RBS03、RBS09和RBS10[13]3個強度依次增強的RBS,分別構(gòu)建了菌株INO5-2a～c。將INO5-2與INO5-2a～c同時進行搖瓶發(fā)酵實驗,結(jié)果如圖3-B所示,RBS的替換對菌體生長的影響不顯著,而INO5-2b的肌苷產(chǎn)量達到了6.9 g/L,相比對照菌INO5-2提高了7.5%。

A-不同強度啟動子啟動purAbsu對肌苷發(fā)酵的影響;B-替換purAbsu的RBS對肌苷發(fā)酵的影響圖3 改造腺苷合成支路對肌苷發(fā)酵的影響

將本研究中搖瓶肌苷產(chǎn)量最高的INO5-2b在5 L發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵,結(jié)果如圖4-A所示,不用額外添加腺嘌呤,INO5-2b發(fā)酵48 h可以生產(chǎn)肌苷29.5 g/L,與INO4-5的發(fā)酵產(chǎn)量(添加3 g/L腺嘌呤)相當。結(jié)果說明通過合理調(diào)整purAbsu的表達強度可以很好地平衡菌體生長與肌苷生產(chǎn)的平衡,在不造成缺陷型的前提下實現(xiàn)肌苷的高效生產(chǎn)。但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),發(fā)酵結(jié)束時,發(fā)酵液中仍舊積累了鳥苷酸、鳥苷和鳥嘌呤等副產(chǎn)物(圖4-B),未檢測到腺苷酸,INO4-5在添加腺嘌呤的發(fā)酵過程中會積累腺苷酸可能是腺嘌呤通過補救合成途徑生成的。因此,為了降低甚至阻斷這些副產(chǎn)物的合成,本研究接著對INO5-2b的鳥苷合成支路進行了改造。

A-發(fā)酵生產(chǎn)曲線;B-副產(chǎn)物濃度圖4 菌株INO5-2b的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果

2.3 鳥苷合成途徑改造對肌苷發(fā)酵的影響

INO5-2b在發(fā)酵過程中,鳥苷途徑的一些副產(chǎn)物如鳥苷酸、鳥嘌呤和鳥苷均有不同程度積累。有報道指出,上述副產(chǎn)物在胞內(nèi)積累會損害細胞活力,使菌體快速老化[14],還會抑制PRPP合成酶(Prs)的活性[7]以及嘌呤操縱子基因的轉(zhuǎn)錄表達,不利于肌苷的生產(chǎn)。為了驗證這些副產(chǎn)物積累對肌苷生產(chǎn)的影響,本研究將INO5-2b分別在添加不同濃度鳥苷酸、鳥苷或鳥嘌呤的條件下進行發(fā)酵實驗,分別選擇了0、0.2、0.4和0.8 g/L 4個梯度(圖5)。結(jié)果顯示,隨著鳥苷酸和鳥嘌呤的濃度增加,其對肌苷產(chǎn)量和菌體生長的抑制作用也愈發(fā)顯著,而在實驗范圍內(nèi),鳥苷的添加未對肌苷產(chǎn)量和菌體生長產(chǎn)生顯著影響。

A-鳥苷酸對肌苷發(fā)酵的影響;B-鳥嘌呤對肌苷發(fā)酵的影響;C-鳥苷對肌苷發(fā)酵的影響圖5 鳥苷支路副產(chǎn)物對肌苷發(fā)酵的影響

為了減少鳥苷支路副產(chǎn)物的積累,本研究首先將guaB基因自身的啟動子進行替換,以期降低guaB基因的表達,減弱鳥苷合成支路。仍舊選用了強度依次增強的啟動子BBa-J23114、BBa-J23105、BBa-J23110、BBa-J23106和BBa-J23101,分別替換了INO5-2b的guaB自身啟動子,構(gòu)建了菌株INO6-1a～e, 將INO5-2b和INO6-1a～e六株菌進行搖瓶發(fā)酵驗證,結(jié)果顯示(圖6-A),與對照菌株INO5-2b相比,INO6-1a的OD600由39.5降低到了23.7,降低了40%,肌苷產(chǎn)量為5.9 g/L;INO6-1b的OD600相比對照菌株基本無變化,而肌苷產(chǎn)量由6.9 g/L提升至7.5 g/L,提高了8.7%;INO6-1c和INO6-1d同出發(fā)菌株相比,菌體生長和肌苷產(chǎn)量都未發(fā)生明顯變化;INO6-e相比對照菌株,菌體生長無明顯差異,但是肌苷產(chǎn)量下降至5.5 g/L,降低了20%。對發(fā)酵不同階段guaB基因的轉(zhuǎn)錄量進行檢測,結(jié)果顯示(圖6-B)發(fā)酵6 h和12 h時,相比于對照菌株,INO6-1a和INO6-1b的guaB基因的轉(zhuǎn)錄量分別降低了40.1%和15.2%,INO6-1c和INO6-1 d的guaB基因的轉(zhuǎn)錄量與對照菌相當,而INO6-1e的guaB基因轉(zhuǎn)錄量增加了65%。從副產(chǎn)物的檢測情況來看(表2),發(fā)酵結(jié)束時,INO6-1a的發(fā)酵基本檢測不到鳥苷酸和鳥嘌呤,INO6-1b中鳥苷酸、鳥嘌呤和鳥苷的質(zhì)量濃度分別為0.051、0.126和0.167 g/L,較對照菌分別降低了76.4%、52.1%和18.1%;INO6-1c和INO6-1 d中3種副產(chǎn)物的濃度和對照菌株相當;而INO6-1e的鳥苷酸、鳥苷和鳥嘌呤的濃度分別較出發(fā)菌株提高了11.1%、4.6%和19.6%。結(jié)果說明通過啟動子替換,降低guaB基因的轉(zhuǎn)錄量,從而減弱鳥苷合成途徑,不僅有助于肌苷產(chǎn)量的提升,還有效降低了鳥苷酸等副產(chǎn)物的積累,但是guaB基因的轉(zhuǎn)錄強度太弱,則會抑制菌體的生長。綜合比較來看,用啟動子BBa_J23105替換guaB基因原有啟動子的效果最佳,在保證菌體生長的前體下,有效提升了肌苷產(chǎn)量并減低了副產(chǎn)物的積累。

表2 不同工程菌株搖瓶發(fā)酵副產(chǎn)物積累情況Table 2 Byproducts accumulation of different engineered strains in shake flasks

A-搖瓶發(fā)酵結(jié)果;B-guaB基因轉(zhuǎn)錄水平;C-INO6-2的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果;D-INO6-2發(fā)酵過程中副產(chǎn)物濃度圖6 鳥苷支路改造對肌苷發(fā)酵的影響

另外,GMP還原酶(guaC基因編碼)可催化鳥苷酸生成肌苷酸,理論上有助于降低鳥苷合成支路副產(chǎn)物并促進肌苷積累。于是本研究在INO6-1b中對guaC基因進行了過表達,構(gòu)建了菌株INO6-2。搖瓶結(jié)果顯示(圖6-A),相比INO6-1b,INO6-2的肌苷產(chǎn)量由7.5 g/L提升至7.9 g/L,提高了5.3%,副產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示,發(fā)酵液中幾乎檢測不到鳥苷酸和鳥苷,只有少量的鳥嘌呤存在(表2)。將INO6-2在5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵實驗(圖6-C),結(jié)果顯示INO6-2經(jīng)5 L發(fā)酵罐測試,OD600達到了94.2,肌苷的產(chǎn)量達到了35.2 g/L,比INO5-2b提升了19.3%,發(fā)酵過程中鳥苷支路副產(chǎn)物均處于較低的水平(圖6-D)。

2.4 強化5′-核苷酸酶對肌苷發(fā)酵的影響

5′-核苷酸酶作為菌體內(nèi)參與合成肌苷的最后一個酶,水解5′-核苷酸生成核苷和無機磷酸鹽。但是大多數(shù)的5′-核苷酸酶的底物特異性差,可作用于各種嘌呤或嘧啶核苷酸等。因此篩選活性更高、特異性更強的5′-核苷酸酶將有利于肌苷的生產(chǎn)。大腸桿菌中有多種5′-核苷酸酶[15-16],分別由yrfG、ushA、umpH和umpG等基因編碼;目前常用于發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的菌株枯草芽孢桿菌5′-核苷酸酶基因為yfkN[17];在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了催化肌苷酸生成肌苷的特異性5′-核苷酸酶基因ISN1[18]。本研究將上述具有催化肌苷酸生成肌苷的核苷酸酶基因yrfG、ushA、umpH、umpG、yfkN和ISN1,分別整合在了INO6-2基因組的ycgH假基因位點上,并由Ptrc啟動子啟動表達,構(gòu)建了菌株INO7-1～6。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖7-A所示。

A-INO6-2和INO7-1～6的搖瓶發(fā)酵結(jié)果;B-工程菌INO7-6的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果圖7 強化5′-核苷酸酶對肌苷發(fā)酵的影響

結(jié)果顯示,與對照菌INO6-2相比,INO7-1～5這五株菌的生長和肌苷生產(chǎn)基本無差別,說明來源于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的5′-核苷酸酶基因的過表達對菌體生長和肌苷生產(chǎn)量沒有影響。而INO7-6的菌體生長相比對照菌變化不大,但是肌苷產(chǎn)量由7.6 g/L提升至8.8 g/L,相比對照菌株提升了15.8%。說明來源于釀酒酵母的ISN1基因的表達有效促進了肌苷的生產(chǎn)。為測試菌株 INO7-6的放大生產(chǎn)性能,在5 L發(fā)酵罐中進行了分批補料發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果如圖7-B所示,菌株在發(fā)酵初期生長緩慢,28 h OD600逐漸達到穩(wěn)定,并進入穩(wěn)定期。0～12 h,肌苷合成速率較慢;12～32 h,肌苷保持了較高的合成速率,32 h之后肌苷合成速率逐漸減慢。48 h的肌苷的最終產(chǎn)量為41.2 g/L,葡萄糖產(chǎn)率為0.17 g/g葡萄糖,生產(chǎn)強度為0.86 g/(L·h)。

3 結(jié)論與討論

為了解決肌苷生產(chǎn)菌INO4-5在發(fā)酵過程中副產(chǎn)物高、需外源添加腺嘌呤等問題,并進一步提高其肌苷的發(fā)酵效率,本研究對其肌苷酸節(jié)點代謝流進行了優(yōu)化。首先為了強化腺苷合成途徑,表達了來源于枯草芽孢桿菌的腺苷酸琥珀酸合成酶編碼基因purAbsu,并使用不同強度的啟動子和核糖體結(jié)合位點調(diào)整其轉(zhuǎn)錄表達的強度,所得最優(yōu)菌株在不添加腺嘌呤的前提下,5 L罐上的肌苷發(fā)酵產(chǎn)量達到了29.5 g/L;鳥嘌呤和鳥苷酸等副產(chǎn)物的積累會抑制菌體的生長和肌苷生產(chǎn),為了降低這些副產(chǎn)物的積累,本研究對鳥苷合成支路進行了改造,通過啟動子的替換,弱化了IMP脫氫酶編碼基因guaB的轉(zhuǎn)錄表達,并過表達guaC基因,促使鳥苷酸回流至肌苷酸,使鳥苷酸等副產(chǎn)物的含量顯著降低,并有效提高了肌苷產(chǎn)量。最后對5′-核苷酸酶進行了篩選和強化,發(fā)現(xiàn)引入來自釀酒酵母的特異性5′-核苷酸酶基因(ISN1),可有效促進肌苷生產(chǎn)。最終所得菌株INO7-6,搖瓶發(fā)酵28 h肌苷產(chǎn)量為8.8 g/L;在5 L發(fā)酵罐上進行分批補料發(fā)酵48 h,肌苷產(chǎn)量達到41.2 g/L,生產(chǎn)強度為0.86 g/(L·h),葡萄糖的產(chǎn)率為0.17 g/g葡萄糖。菌株INO7-6不含質(zhì)粒,且在發(fā)酵過程不用額外添加腺嘌呤或鳥嘌呤等營養(yǎng)物,可簡化發(fā)酵工藝并降低生產(chǎn)成本,具有良好的工業(yè)化應用前景。為進一步提高肌苷發(fā)酵生產(chǎn)效率,下一步的研究可以針對中心代謝進行改造,比如重新分配糖酵解與磷酸戊糖途徑的碳流,增強前體物PRPP的供應水平,促進葡萄糖向肌苷的轉(zhuǎn)化,提高轉(zhuǎn)化率,以滿足肌苷工業(yè)化生產(chǎn)的需求。