米麗娟，閆競(jìng)宇，郭珊珊，賈 妮，逄金柱,

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司全球研發(fā)創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116001；3.首都兒科研究所，北京 100020）

母乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是人類母乳中的第三大固體成分，其含量?jī)H次于乳糖和脂肪[1]。HMOs在初乳中的質(zhì)量濃度高達(dá)20～25 g/L[2]。HMOs的結(jié)構(gòu)通常由3～22 個(gè)單糖組成[3]，以葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸5 種單糖為基本組成單位[4]；以乳糖-N-四糖（lacto-Ntetraose，LNT）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）、乳糖-N-六糖（lacto-N-hexaose，LNH）和乳糖-N-新六糖（lacto-N-neohexaose，LNnH）為核心糖骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步以直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)再度延伸或進(jìn)行巖藻糖基化和唾液酸化，從而形成各種不同的HMOs（例如2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、3-FL、LNT、乳糖-N-巖藻糖基五糖I（lacto-N-fucopentaose I，LNFP-I）等）[5-6]。目前已經(jīng)鑒定出的HMOs大約有200多種[2,7]，其中包含中性寡糖和酸性寡糖；中性寡糖又可分為無(wú)巖藻糖基及含巖藻糖基的寡糖，占HMOs含量約75%～85%；酸性寡糖是包含唾液酸及硫酸鹽結(jié)構(gòu)的寡糖，占HMOs含量約10%～15%[1,8-9]。HMOs在人體中具有多種重要的生物學(xué)功能[2,4,10-11]：調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)有益菌的增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)[12]；作為抗黏附型抗菌劑，以誘餌型受體方式，防止病原體黏附到嬰兒的黏膜表面，降低感染風(fēng)險(xiǎn)[13]；調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞應(yīng)答，減少黏膜白細(xì)胞的過度浸潤(rùn)和過度激活；此外，能夠降低壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[14-15]；為嬰兒提供唾液酸作為大腦發(fā)育和認(rèn)知力提高的潛在必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16-17]。

HMOs的種類和含量受多種因素的影響，如地域、泌乳階段、乳母基因多態(tài)性等[18-22]。有關(guān)母乳寡糖的含量研究多采用橫斷面采樣法搜集母乳樣本進(jìn)行分析檢測(cè)，而對(duì)于HMOs來說，乳母基因多態(tài)性是影響其組成和含量的重要因素，因此橫斷面法易造成多因素交互影響檢測(cè)結(jié)果。故本研究采用縱向隊(duì)列研究方式搜集母乳樣本并進(jìn)行HMOs分析，真實(shí)客觀反映泌乳階段、地域?qū)MOs的影響，并分析中國(guó)代表性地區(qū)乳母基因多態(tài)性的呈現(xiàn)趨勢(shì)，概述中國(guó)代表性地區(qū)母乳寡糖的構(gòu)成特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 志愿者招募

2012 年6 月 至2013 年12 月，在我國(guó)6個(gè)城市（北京、包頭、西寧、昆明、濟(jì)南和深圳）募集足月分娩健康嬰兒和乳母，乳母年齡在35 周歲以下，身體健康，無(wú)慢性疾病和乳腺疾病，母乳喂養(yǎng)嬰兒至12 月齡。所有參與者在入組前都已簽署知情同意書。本研究得到首都兒科研究所科學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：SHERLL2013007）。

1.1.2 母乳采集

由科研人員上午9∶00—11∶00在醫(yī)院或入戶采集母乳，采用吸奶器采集單側(cè)乳房的全部乳汁。隨訪每名入組母親至嬰兒1 周歲左右，累計(jì)每人次縱向采集母乳共10 次。采集量為初乳10 mL，成熟乳60 mL，分裝至離心管。采集后樣本低溫冷鏈轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，－80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。本研究主要分析初乳? 月齡和4 月齡3 個(gè)階段的母乳樣本。

1.1.3 試劑

乙酸銨、乙腈、甲醇、乙醇 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；HMOs標(biāo)準(zhǔn)品：LNT、LNnT、2’-FL、3-FL、二巖藻糖基乳糖（lactodifucotetraose，LDFT）、LNFP-I、LNFP-III、LNFP-II、乳糖-N-二巖藻糖基新六糖II（lacto-N-neodifucohexaose II，LNnDFH-II）、乳糖-N-二巖藻糖基六糖II（lacto-N-difucohexaose II，LNDFH-II）、LNDFH-I &LNnDFH-I、單巖藻糖基乳糖-N-新六糖（monofucosyllacto-N-neohexaose，MFLNnH）、單巖藻糖基乳糖-N-六糖III（monofucosyllacto-N-hexaose III，MFLNH-III）、MFLNH-I、雙巖藻基-對(duì)-乳糖-N-新六糖（difucosyl-para-lacto-N-neohexaose，DFpLNnH）、二巖藻糖基-乳糖-N-六糖a（difucosyllacto-N-hexaose a，DFLNHa）、3’-唾液酸化乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）、6’-SL、唾液酸化-乳糖-四糖b（sialyllacto-tetrasaccharide b，LSTb）、LSTc、二唾液酸化-乳糖-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）、3’-唾液酸化乳糖-N-巖藻糖基五糖II（3’-sialyllatco-N-fucopentaose II，3’-SLNFP-II）&6’-唾液酸化乳糖-N-巖藻糖基五糖VI（6’-sialyllatco-Nfucopentaose VI，6’-SLNFP-VI）中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HClass-Xevo TQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜、BEH Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 m）沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳樣本前處理

取冷凍母乳樣本于37 ℃水浴超聲5～10 min，取1 mL樣品4 ℃、7000 r/min低溫離心6 min，之后取100 μL中層清液再經(jīng)4 ℃、7000 r/min離心6 min。之后再取50 μL上層清液，加入2 倍體積的色譜級(jí)乙醇溶液，4 ℃、7000 r/min離心6 min，取80 μL上層清液，加入等體積純水，經(jīng)渦旋充分混勻后4 ℃、7000 r/min離心6 min，最后取50 μL離心后的上清液，加入700 μL體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液，等待上機(jī)備用。

1.3.2 母乳寡糖檢測(cè)

母乳樣品均采用超低溫冷鏈運(yùn)輸至中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所進(jìn)行檢測(cè)。具體方法：通過不同濃度的寡糖標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的寡糖含量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)樣品中的含量將標(biāo)準(zhǔn)品分為高含量組（2’-FL、3-FL、3’-SL、6’-SL、LNT、LNnT、LDFT、LNFP-I、LNFP-I、LNFP-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、DSLNT）和低含量組（LNFP-III、LSTb、LSTc、LNnDFH-II、LNDFH-II、3’-SLNFP-II &6’-SLNFP-VI、MFLNnH、MFLNH-III、MFLNH-I、DFpLNnH、DFLNHa），高含量組標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣2 μL、低含量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣5 μL。進(jìn)樣2 針，分別對(duì)高含量組分和低含量組分進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。數(shù)據(jù)采用表示，服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）法進(jìn)行組間差異比較，未知或不服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較；P＜0.05時(shí)，組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 人口學(xué)資料統(tǒng)計(jì)分析

本研究共招募志愿者109 人，其中北京（東經(jīng)116°20’，北緯39°56’）17 人、包頭（東經(jīng)109°84’，北緯40°66’）21 人、西寧（東經(jīng)101°77’，北緯36°62’）20 人、昆明（東經(jīng)102°，北緯24°）11 人、濟(jì)南（東經(jīng)117°，北緯36°40’）20 人、深圳（東經(jīng)114°03’，北緯22°32’）20 人。出生時(shí)乳母和嬰兒的基本情況如表1所示，6 組乳母分娩時(shí)的年齡無(wú)顯著差異。剖宮產(chǎn)54 人，順產(chǎn)55 人，各個(gè)城市2 種分娩方式比例接近1∶1。分娩前昆明的乳母體質(zhì)量略低，其他各城市無(wú)顯著差異，經(jīng)過ANOVA檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其與北京、西寧和深圳無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著低于包頭和濟(jì)南（P＜0.05）。6 個(gè)城市嬰兒出生體質(zhì)量無(wú)顯著差異。嬰兒出生身長(zhǎng)除昆明顯著低于其他城市外（P＜0.05），其他5 個(gè)城市無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 出生時(shí)乳母和嬰兒的基本情況Table 1 Basic information of lactating mothers and infants at birth

2.2 不同地區(qū)中國(guó)母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的差異

圖1顯示6 個(gè)城市健康母乳成熟乳中總HMOs質(zhì)量濃度、非巖藻糖基中性寡糖、巖藻糖基中性寡糖和酸性寡糖的質(zhì)量濃度差異。北京、包頭和西寧3 個(gè)城市的母乳總HMOs質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05），昆明、濟(jì)南和深圳3 個(gè)城市間母乳總HMOs質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。除深圳和西寧母乳無(wú)顯著差異外（P＞0.05），昆明、濟(jì)南和深圳3 個(gè)城市母乳總HMOs質(zhì)量濃度顯著高于北京、西寧和包頭（P＜0.05）。本研究中非巖藻糖基中性寡糖主要包括LNT和LNnT兩種寡糖單體，二者總質(zhì)量濃度除北京母乳顯著低于昆明、濟(jì)南和深圳母乳外（P＜0.05），其他城市間無(wú)顯著差異。而巖藻糖基中性寡糖（15 種寡糖）質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)與總HMOs質(zhì)量濃度一致，昆明、濟(jì)南和深圳顯著高于北京、西寧和包頭（P＜0.05）；而對(duì)于酸性寡糖（6 種酸性寡糖），6 個(gè)城市間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖1 中國(guó)不同城市母乳寡糖質(zhì)量濃度差異分析Fig.1 Differential analysis of mass concentrations of HMOs among different cities of China

基于巖藻糖基寡糖的顯著差異，對(duì)15 種巖藻糖基中性寡糖單體（2’-FL、3-FL、LDFT、LNnDFH-II、LNDFH-II、LNDFH-I、LNnDFH-I、LNFP-I、LNFP-III、LNFP-II、MFLNnH、MFLNH-III、MFLNH-I、DFpLNnH、DFLNHa）的城市間差異進(jìn)行分析，如圖2所示，7 種寡糖在不同城市母乳間存在顯著差異（P＜0.05），其余8 種均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。深圳母乳3-FL質(zhì)量濃度顯著高于包頭；濟(jì)南和深圳母乳中LDFT質(zhì)量濃度顯著高于包頭；濟(jì)南母乳中LNDFH-I和LNnDFH-I總和質(zhì)量濃度顯著高于西寧；北京、包頭、西寧、昆明母乳中DFLNHa質(zhì)量濃度顯著高于深圳；北京母乳L(zhǎng)NnDFH-II質(zhì)量濃度顯著高于包頭。

圖2 中國(guó)不同城市母乳寡糖中寡糖單體差異分析Fig.2 Differential analysis of concentrations of HMO monomers among different cities of China

2.3 泌乳時(shí)間對(duì)中國(guó)母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的影響

為了考察泌乳時(shí)間對(duì)母乳寡糖的影響，選擇北京地區(qū)初乳、1 月齡和4 月齡成熟乳，分析隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)寡糖質(zhì)量濃度的變化。如圖3所示，總HMOs質(zhì)量濃度在初乳中最高（中位值可達(dá)9000 mg/L），隨著泌乳時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低，到4 月齡時(shí)降低至4000 mg/L；同樣總非巖藻糖基中性寡糖和總酸性寡糖質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)隨月齡增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05）；1 月齡時(shí)總巖藻糖基中性寡糖質(zhì)量濃度與初乳無(wú)顯著差異（P＞0.05），但4 月齡母乳中其質(zhì)量濃度顯著低于初乳和1 月齡成熟乳（P＜0.05）。

同時(shí)本研究分析寡糖單體隨泌乳時(shí)間的變化趨勢(shì)，如圖4所示，2 種非巖藻糖基中性寡糖均隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)。LNT在初乳時(shí)質(zhì)量濃度中位值可達(dá)1000 mg/L，到4 月齡時(shí)中位數(shù)值降低至100 mg/L，但初乳和1 月齡無(wú)顯著差異（P＞0.05）；LNnT在初乳時(shí)質(zhì)量濃度中位數(shù)值約為800 mg/L，隨著月齡延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，到4 月齡也降低至100 mg/L。

圖4 非巖藻糖基中性寡糖單體隨泌乳時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.4 Changes in concentrations of non-fucosylated neutral oligosaccharide monomers with lactation time

對(duì)于15 種巖藻糖基寡糖，3 種寡糖（3-FL、LDFT和LNnDFH-II）呈現(xiàn)隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)升高的趨勢(shì)，經(jīng)差異顯著分析后發(fā)現(xiàn)只有3-FL具有顯著升高趨勢(shì)（圖5）。2 種單巖藻基六糖（MFLNnH和MFLNH-III）隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高再降低趨勢(shì)（圖6）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)1 月齡單巖藻基六糖質(zhì)量濃度最高，顯著高于4 月齡母乳中質(zhì)量濃度（P＜0.05），但與初乳無(wú)顯著差異（P＞0.05）。其余10 種巖藻糖基中性寡糖均呈現(xiàn)隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)，經(jīng)差異分析后發(fā)現(xiàn)LNFP-I、LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、MFLNH-I、DFpLNnH和DFLNHa隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05）。

圖5 3-FL質(zhì)量濃度隨泌乳時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.5 Changes in 3-FL concentration at different lactation stages

圖6 2 種單巖藻糖基六糖隨泌乳時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.6 Changes in concentrations of two monofucosylhexasaccharides at different lactation stages

圖7顯示了7 種酸性寡糖隨泌乳時(shí)間的變化趨勢(shì)，由于3’-SLNFP-II和6’-SLNFP-VI兩種寡糖在檢測(cè)中未分開，故二者以質(zhì)量濃度和的形式呈現(xiàn)。寡糖單體隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，但經(jīng)差異顯著分析后發(fā)現(xiàn)：3’-SL質(zhì)量濃度在120～180 mg/L之間，不同泌乳時(shí)間組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；6’-SL在初乳時(shí)質(zhì)量濃度可達(dá)620 mg/L，但隨著泌乳時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低，到4 月齡時(shí)不足100 mg/L；LSTb 和LSTc 質(zhì)量濃度隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05），尤其LSTb從初乳近400 mg/L降至4 月齡時(shí)的不足50 mg/L；DSLNT在初乳和1 月齡成熟乳中質(zhì)量濃度（220～350 mg/L）無(wú)顯著差異（P＞0.05），但到4 月齡時(shí)顯著降低至100 mg/L以下；3’-SLNFP-II和6’-SLNFP-VI兩種寡糖總和在初乳時(shí)可達(dá)150 mg/L，到1 月齡時(shí)略有降低，但差異不顯著（P＞0.05），到4 月齡時(shí)顯著降低至50 mg/L。

圖7 泌乳時(shí)間對(duì)酸性寡糖質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of lactation time on concentrations of acidic oligosaccharides

2.4 乳母血型狀態(tài)及母乳寡糖構(gòu)成分析

母親的遺傳特征決定了母乳中HMOs 的類型和數(shù)量[2,23-24]：S e基因編碼α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase 2，F(xiàn)UT2）。Se基因型活躍的女性被歸類為分泌型（Se＋），其乳汁中含有α1,2-巖藻糖基低聚糖；反之非Se基因型的女性則為非分泌型，其乳汁中不含有α1,2-巖藻糖基低聚糖。在Lewis血型系統(tǒng)中，Le基因編碼α1,4-FUT3。Le基因決定母乳中是否存在α1,4-巖藻糖基低聚糖。Le基因型活躍的女性被分類為L(zhǎng)ewis陽(yáng)性（Le＋），反之則為L(zhǎng)ewis陰性（Le－）。從而會(huì)產(chǎn)生4 種主要的乳母血型基因型，即Se＋Le＋、Se＋Le－、Se－Le＋和Se－Le－。

乳母的血型基因型是造成母乳中寡糖含量差異的主要原因。本研究采用寡糖類型對(duì)乳母血型分泌型狀態(tài)以及Lewis血型狀態(tài)進(jìn)行了歸屬分析。采用2’-FL和LNFP-I作為指標(biāo)糖判斷分泌型（Se＋）和非分泌型（Se－）；采用LNFP-II作為指標(biāo)糖判斷Lewis陽(yáng)性（Le＋）和Lewis陰性（Le－）。圖8結(jié)果顯示Se＋Le＋是中國(guó)乳母血型的主要基因類型，西寧地區(qū)該基因型的乳母占比最多，為95%；其次為昆明和包頭，分別為81.82%和80.95%。Se＋Le－在包頭和昆明地區(qū)分別有9.52%和9.09%的乳母，其他地區(qū)為6%以下。對(duì)于Se－Le＋，深圳乳母占比最高為25%，西寧和昆明地區(qū)無(wú)此基因型的乳母，包頭、北京和濟(jì)南在9%～20%。西寧和昆明各存在1 人次的弱分泌型Se－/Se w Le＋母乳，故這兩個(gè)地區(qū)Se－/Se w Le＋分型的占比分別為5.00%和9.09%，其他地區(qū)為0%。

圖8 不同城市乳母血型基因型分布圖Fig.8 Distribution of blood group genotypes of lactating mothers in different cities

圖9比較了不同血型基因型的母乳寡糖單體質(zhì)量濃度的差異。結(jié)果表明，相較于其他血型基因型，Se＋Le－型的乳母母乳中2’-FL、LNFP-I、MFLNH-I和DFLNHa的質(zhì)量濃度最高；Se－Le＋型的乳母母乳中3-FL、LNFP-II、MFLNH-III和3’-SL質(zhì)量濃度最高；Se－/Se w Le＋型的乳母母乳中3-FL、LNFP-II、LNT和DSLNT質(zhì)量濃度較高；而分泌所有寡糖單體的Se＋Le＋型，其乳母乳汁中寡糖質(zhì)量濃度并不一定是最高的，由圖9可知，除LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、6’-SL和LSTc質(zhì)量濃度比其他血型基因型高以外，其他寡糖的質(zhì)量濃度都不是最高的。

圖9 HMOs在不同血型基因型乳母母乳中的質(zhì)量濃度比較Fig.9 Comparison of HMO concentrations in breast milk from lactating mothers of different blood group genotypes

3 討論

3.1 地域因素對(duì)母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的影響

地域差異是影響母乳營(yíng)養(yǎng)成分的重要因素。Erney等[25]分析來自10 個(gè)國(guó)家的435 名乳母母乳中9 種中性寡糖的組成差異，發(fā)現(xiàn)156 個(gè)墨西哥母乳樣本中都含有2’-FL，而22 個(gè)菲律賓母乳樣本中僅有46%含有2’-FL。2’-FL既是母乳中質(zhì)量濃度最高的巖藻糖基化寡糖，也是質(zhì)量濃度最高的HMO，因其結(jié)構(gòu)與腸道黏膜細(xì)胞表面的糖蛋白、糖鏈相似，可抑制病原體黏附，促進(jìn)有益菌定殖，降低感染的發(fā)生[26-27]。此外，臨床試驗(yàn)和預(yù)臨床模型證實(shí)2’-FL在促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)功能[13]、促進(jìn)腸道屏障功能和腸道成熟[28]、促進(jìn)大腦發(fā)育和認(rèn)知功能[29]等方面具有潛力。地域因素是造成母乳寡糖構(gòu)成差異的因素之一，可能是由于遺傳特性的不均勻分布造成的。姚文[24]對(duì)中國(guó)和美國(guó)母親母乳中性寡糖濃度差異及相關(guān)基因FUT2的多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)美國(guó)母親母乳中α1,3-和α1,4-巖藻糖濃度遠(yuǎn)高于中國(guó)母親，而中國(guó)母親母乳中α1,2-巖藻糖濃度在總中性寡糖中的比例高于美國(guó)母親。其他涉及地域的研究文獻(xiàn)多是以某地區(qū)母乳樣本為例進(jìn)行母乳寡糖構(gòu)成和變化的影響分析。Asakuma等[30]研究發(fā)現(xiàn)日本母親成熟乳中2’-FL平均質(zhì)量濃度為1480 mg/L；Leo等[31]分析了南太平洋薩摩亞群島母親的初乳，其2’-FL質(zhì)量濃度為330 mg/L；魏遠(yuǎn)安等[21]以中國(guó)廣東江門地區(qū)為例分析中國(guó)母乳中寡糖組分及含量變化；郭文奎等[32]收集了哈爾濱63 位母親的母乳樣品，分析了6 種HMOs的組成和含量變化；張新景[33]檢測(cè)了石家莊地區(qū)母乳中12 種HMOs的含量及其影響因素；Wu Jiayi等[34]檢測(cè)了中國(guó)222 名母親母乳的24 種寡糖，其研究最終顯示2’-FL在分泌型母親中的濃度低于西方人群，但高于非洲人群。

我國(guó)地域遼闊，區(qū)域差異明顯，對(duì)多個(gè)代表地區(qū)母乳中HMOs組成和含量進(jìn)行深入剖析對(duì)于實(shí)現(xiàn)全民營(yíng)養(yǎng)健康有重要意義。本研究比較了我國(guó)東西南北6 個(gè)城市母乳中HMOs的組成和質(zhì)量濃度差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)北京、包頭和西寧的HMOs組成和質(zhì)量濃度接近，昆明、濟(jì)南和深圳HMOs構(gòu)成相近，且總HMOs質(zhì)量濃度和總巖藻糖基中性寡糖前者低于后者；而總非巖藻糖基中性寡糖和總酸性寡糖無(wú)地區(qū)間差異。進(jìn)一步比較了15 種巖藻糖基中性寡糖單體的地區(qū)間差異，發(fā)現(xiàn)包頭地區(qū)的多種寡糖單體顯著低于其他城市，3-FL質(zhì)量濃度顯著低于深圳；LDFT質(zhì)量濃度顯著低于深圳和濟(jì)南；LNnDFH-II質(zhì)量濃度顯著低于北京；這說明包頭地區(qū)母乳中寡糖質(zhì)量濃度整體偏低，在嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)攝入中需重視母乳寡糖的補(bǔ)充。另外，從功能上看母乳寡糖與嬰幼兒腸道菌群和健康直接相關(guān)，應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注該地區(qū)嬰兒腸道發(fā)育與健康狀況。此外，巖藻糖基寡糖和唾液酸性寡糖對(duì)嬰幼兒的神經(jīng)認(rèn)知發(fā)育都有潛在的促進(jìn)作用[35]，對(duì)于因地域因素受到影響的巖藻糖基寡糖和唾液酸性寡糖的單糖，在特定區(qū)域可額外補(bǔ)充或在嬰兒配方粉配方設(shè)計(jì)時(shí)重點(diǎn)考慮。

3.2 泌乳時(shí)間對(duì)母乳寡糖組成和質(zhì)量濃度的影響

泌乳時(shí)間是母乳營(yíng)養(yǎng)成分的重要影響因素。Soyy?lmaz等[7]對(duì)31 個(gè)國(guó)家的HMOs含量進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)初乳中的總HMOs質(zhì)量濃度為17.7 g/L，過渡乳為13.3 g/L，成熟乳為11.3 g/L，并且每種HMOs濃度差異很大，隨著哺乳階段的不同而不同。魏遠(yuǎn)安等[21]研究發(fā)現(xiàn)15 種中性寡糖含量在泌乳初期（初乳）達(dá)到最高值后逐漸減少（成熟乳），但是3-FL質(zhì)量濃度在整個(gè)取樣階段持續(xù)增加；6 種酸性寡糖質(zhì)量濃度在泌乳初期穩(wěn)定但后期隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少。朱婧等[36]研究不同泌乳階段10 種游離寡糖的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2’-FL、3’-SL、6’-SL、LNT、LNnT、LNFP-I與泌乳時(shí)間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，3-FL與泌乳時(shí)間存在正相關(guān)關(guān)系。Thurl等[1]綜述泌乳時(shí)間對(duì)母乳寡糖含量的影響：在母親產(chǎn)后前3 個(gè)月，3-FL隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加（至少2 倍）；在產(chǎn)后前4 個(gè)月，LNFP-III含量呈不顯著的上升趨勢(shì)；在整個(gè)泌乳期LNFP-I（近2 倍）和LSTc（近4 倍）呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)；其他幾種HMOs，如中性寡糖和酸性寡糖在泌乳過程中呈不顯著降低趨勢(shì)；6’-SL和LSTa含量在產(chǎn)后的100 d內(nèi)顯著降低。Elwakiel等[23]的研究表明中國(guó)母乳的總HMOs濃度在20 周內(nèi)隨泌乳期延長(zhǎng)顯著降低，與母親的血型基因型無(wú)關(guān)，總酸性和中性HMOs濃度隨泌乳期延長(zhǎng)也呈下降趨勢(shì)，但是下降水平受母親血型基因型影響。Wu Jiayi等[34]研究表明，酸性HMOs隨哺乳期的延長(zhǎng)顯著降低，且與母親的血型基因型無(wú)關(guān)。

總體來看，本研究與前人報(bào)道基本一致，總HMOs、總酸性HMOs、總中性HMOs的質(zhì)量濃度均隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)；中性寡糖（LNT、LNnT、LNFP-I、LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、MFLNH-I、DFpLNnH和DFLNHa）和酸性寡糖（6’-SL、DSLNT、3’-SLNFP-II &6’-SLNFP-VI）隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著降低趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)除3-FL質(zhì)量濃度隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)外，LDFT和LNnDFH-II也隨泌乳時(shí)間呈上升趨勢(shì)，但差異不顯著。2 種單巖藻基六糖（MFLNnH和MFLNH-III）隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高再降低趨勢(shì)，到1 月齡時(shí)質(zhì)量濃度達(dá)到最高，之后持平或者略降低?？紤]到總HMOs和各大分類的HMOs質(zhì)量濃度均呈下降趨勢(shì)，同時(shí)不同單體又隨泌乳期延長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，嬰幼兒配方食品在配方設(shè)計(jì)時(shí)可考慮面向不同時(shí)期嬰/幼兒進(jìn)行不同含量及不同配比的組合物設(shè)計(jì)。尤其在配方設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注隨泌乳期含量增加的3-FL，其在生理功能上已被廣泛證實(shí)與巖藻糖基化的2’-FL相近，包括益生特性、免疫調(diào)節(jié)作用、抗黏附、抗菌、抗病毒能力和胃腸道保護(hù)等[37]。

3.3 乳母血型狀態(tài)對(duì)母乳寡糖組成和含量的影響

Lewis血型系統(tǒng)中的Se基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT2，該酶控制α1,2-巖藻糖基寡糖的產(chǎn)生；Le基因編碼FUT3，調(diào)控α1,4-巖藻糖基寡糖的產(chǎn)生[9,23]。本研究中分泌型和非分泌型的比例分別為85.32%和14.68%，分泌型的比例略高于國(guó)內(nèi)外研究中報(bào)道的水平。Soyy?lmaz等[7]綜述指出，全球大約有80%的分泌型母親和20%的非分泌型母親。Wu Jiayi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，222 名母親中77%是分泌型，23%是非分泌型。關(guān)于整體的母乳分型，本研究結(jié)果與Elwakiel等[23]報(bào)道一致，同樣發(fā)現(xiàn)了3 種基因組合類型的母乳（Se＋Le＋、Se－Le＋、Se＋Le－），未檢測(cè)到Se－Le－類型，且中國(guó)乳母血型基因型以Se＋Le＋為主，其占比為79.82%，Se－Le＋和Se＋Le－占比分別為12.84%和5.50%。本研究中包頭與Elwakiel等[23]研究城市呼和浩特地理位置非常接近，二者報(bào)道的3 種主要類型乳母比例較接近（包頭Se＋Le＋85%、Se－Le＋10%、Se＋Le－5%；呼和浩特Se＋Le＋73%、Se－Le＋20%、Se＋Le－7%）。同時(shí)本研究進(jìn)一步橫向?qū)Ρ任覈?guó)東西南北不同城市中3 種主要基因類型的乳母比例，發(fā)現(xiàn)西寧和昆明地區(qū)存在弱分泌型Se－/Se w Le＋乳母（5.00%和9.09%），濟(jì)南和深圳地區(qū)非分泌型占比較高（20%和25%）；西寧的Se＋Le＋類型比例是6 個(gè)城市中最高的，超過90%。本研究進(jìn)一步分析不同基因型乳母中寡糖單體含量的差異（圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)2’-FL和LNFP-I在Se＋Le－的乳母母乳中質(zhì)量濃度最高，3-FL和LNFP-II在Se－Le＋母乳中質(zhì)量濃度最高，LNT在Se－/Se w Le＋母乳中質(zhì)量濃度最高，而分泌所有寡糖單體的Se＋Le＋類型母乳中除了LNDFH-II、LNDFH-I &LNnDFH-I、6’-SL和LSTc質(zhì)量濃度比其他血型基因型高以外，其他18 種寡糖質(zhì)量濃度均低于其他血型基因型。對(duì)比城市差異時(shí)發(fā)現(xiàn)包頭地區(qū)總寡糖和多種寡糖單體的質(zhì)量濃度顯著低于其他城市，但該城市Se＋Le＋類型乳母比例達(dá)到80%以上。這也進(jìn)一步說明地域-血型基因型-母乳寡糖組成和含量的人群差異性及特征性。

4 結(jié)論

本研究采用縱向隊(duì)列研究方式對(duì)中國(guó)6 個(gè)代表性地區(qū)母乳樣本中的HMOs進(jìn)行分析，結(jié)果證實(shí)地區(qū)、泌乳階段和乳母血型基因型在一定程度上對(duì)母乳寡糖組成和含量的差異產(chǎn)生影響?？侶MOs含量和總巖藻糖基中性寡糖含量，從地域分布上呈現(xiàn)東南地區(qū)高于西北地區(qū)，而總酸性寡糖在各城市間均無(wú)明顯差異。對(duì)于泌乳期而言，總HMOs含量、非巖藻糖基中性寡糖、巖藻糖基中性寡糖和酸性寡糖含量均隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)；在寡糖單體類型上僅3-FL含量隨泌乳時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著上升趨勢(shì)。以分泌型和非分泌型的數(shù)據(jù)來看，其比例分別為85.32%和14.68%；以整體母乳的血型基因型分布看，我國(guó)主要為占比79.82%的Se＋Le＋，Se－Le＋和Se＋Le－分別占比為12.84%和5.50%。

本研究針對(duì)我國(guó)代表性地區(qū)的HMOs構(gòu)成特征研究，首先對(duì)HMOs的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)參考，為未來我國(guó)嬰幼兒配方食品中HMOs的精準(zhǔn)化添加提供了重要科學(xué)支撐。如嬰幼兒配方粉或原料生產(chǎn)企業(yè)，可考慮針對(duì)特定地域和特定月齡定制HMOs組合物。其次，依托于現(xiàn)有研究對(duì)不同血型基因型乳母乳汁中HMOs的輪廓和含量分析，臨床上可進(jìn)一步探究其與嬰幼兒健康的關(guān)系，如結(jié)合喂養(yǎng)不同血型基因型乳母乳汁的嬰兒腸道菌群，及其生長(zhǎng)發(fā)育、腸道舒適性、疾病等情況，進(jìn)行不同HMOs構(gòu)成、腸道菌群及健康三者之間的關(guān)聯(lián)性或機(jī)制的研究。