劉 川，李佳佳，吳雪瑩，陳燕秋，石培育，宋 娟,，戴 琴,

（1.成都市食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611130；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（營(yíng)養(yǎng)與健康化學(xué)計(jì)量及應(yīng)用），北京 100029）

為加快動(dòng)物生長(zhǎng)速率、提高肌肉比例、降低疾病發(fā)生率、保證運(yùn)輸順應(yīng)性等，在動(dòng)物飼養(yǎng)、運(yùn)輸、屠宰等環(huán)節(jié)可能存在人為添加或殘留蛋白同化劑、糖皮質(zhì)激素和利尿劑等類型食源性興奮劑的現(xiàn)象[1-3]。消費(fèi)者長(zhǎng)期食用含有該類物質(zhì)的動(dòng)物源性食品可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂、身體抵抗力下降甚至引發(fā)癌癥[4]。運(yùn)動(dòng)員等特殊群體在食用含有該類物質(zhì)的動(dòng)物源性食品后會(huì)暴露食源性興奮劑風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而影響體育成績(jī)和比賽公平[5-6]，以我國(guó)為例，體反興奮劑字〔2021〕584號(hào)中對(duì)60 種食源性興奮劑的限量要求、檢測(cè)方法均提出了嚴(yán)格要求[7]。目前，我國(guó)針對(duì)食源性興奮劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要有農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告—2—2008《動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告—1—2008《動(dòng)物源性食品中11 種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和SN/T 5167—2019《出口動(dòng)物源食品中氫氯噻嗪等10 種利尿劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》等國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。584號(hào)文中規(guī)定的60 種食源性興奮劑分散在以上檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，且適用的基質(zhì)也較少，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可能導(dǎo)致檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)、需要大量檢測(cè)人員、不能完全覆蓋實(shí)際工作的檢測(cè)等問(wèn)題，難以滿足大型體育賽事用食品檢測(cè)的時(shí)效性要求。

現(xiàn)已有部分針對(duì)多種食源性興奮劑的檢測(cè)研究，如Shi Yanjing等[3]使用QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）凈化結(jié)合高分辨質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定牛奶和乳制品中的48 種興奮劑殘留；馮月超等[8]使用QuEChERS凈化，部分同位素內(nèi)標(biāo)法定量檢測(cè)44 種食源性興奮劑和6 種孕激素；張海超等[9]使用QuEChERS凈化，基質(zhì)曲線測(cè)量46 種食源性興奮劑。以上檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法多使用基質(zhì)曲線或少量?jī)?nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)差異較大、難以獲得同類型空白基質(zhì)樣品，且睪酮、氫化可的松等興奮劑屬于內(nèi)源性興奮劑，針對(duì)該類物質(zhì)的檢測(cè)過(guò)程恐難以制得基質(zhì)曲線等問(wèn)題，以上情況導(dǎo)致該類方法在實(shí)際使用過(guò)程中存在檢測(cè)效率較低、結(jié)果不準(zhǔn)確等不足。本研究在對(duì)動(dòng)物源性食品中30 種食源性興奮劑的檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)提取和凈化流程進(jìn)行優(yōu)化，并使用同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，建立普適性強(qiáng)、靈敏度高、檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)10 種蛋白同化劑（美雄酮、司坦唑醇、甲基睪酮、勃地龍、睪酮、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、群勃龍），8 種糖皮質(zhì)激素（潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟氫可的松、氫化可的松）和12 種利尿劑（氫氯噻嗪、乙酰唑胺、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺內(nèi)酯、坎利酮、精磺胺、托拉塞米、布美他尼）的檢測(cè)分析，旨在為保障大型體育賽事的運(yùn)行提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟氫可的松、氫化可的松、美雄酮、司坦唑醇、甲基睪酮、勃地酮、睪酮、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、群勃龍、氫氯噻嗪、乙酰唑胺、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺內(nèi)酯、坎利酮、精磺胺、托拉塞米、布美他尼，美雄酮-D3、司坦唑醇-D3、甲基睪酮-D3、勃地酮-D3、睪酮-D3、丙酸睪酮-D3、諾龍-D3、丙酸諾龍-D3、群勃龍-D3、氨苯蝶啶-D5、坎利酮-D6、托拉塞米-D7、布美他尼-D5、潑尼松-D8、潑尼松龍-D6、甲基潑尼松龍-D3、地塞米松-D5、倍他米松-D5、倍氯米松-D5、氟氫可的松-D5、氫化可的松-D3、氫氯噻嗪-D2、乙酰唑胺-D3、氯噻嗪-13C,15N2、氯噻酮-D4、呋塞米-D5、卞氟噻嗪-D5、精磺胺-15N2均為100～1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 天津阿爾塔科技有限公司。

甲酸、甲醇、乙腈（色譜純）德國(guó)Merck公司；氯化鈉、正己烷（分析純）重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；PRiME HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL）美國(guó)Waters公司；陶瓷均質(zhì)子（50 mL離心管用）上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法》實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。

豬肉、雞肉、蝦、雞蛋、牛奶以及部分相關(guān)制品共50余批次樣品均購(gòu)自于市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

ExionLC-Triple Quad? 6500＋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司；Centrifuge 5810 R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；BP211D型天平 德國(guó)Sartorius公司；ME203型天平 瑞士Mettler Toledo公司；Atlantis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）美國(guó)Waters公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

1.3.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取不同體積的潑尼松、潑尼松龍等標(biāo)準(zhǔn)品溶液于同一棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻得混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（美雄酮、司坦唑醇、甲基睪酮、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、勃地酮、群勃龍、睪酮質(zhì)量濃度為100 ng/mL，潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松質(zhì)量濃度為125 ng/mL，氟氫可的松、精磺胺質(zhì)量濃度為250 ng/mL，氫化可的松、氯噻嗪、氫氯噻嗪質(zhì)量濃度為500 ng/mL，氯噻酮、氨苯蝶啶、乙酰唑胺、螺內(nèi)酯、呋塞米、坎利酮、芐氟噻嗪、托拉塞米、布美他尼質(zhì)量濃度為1250 ng/mL）。

1.3.1.2 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取不同體積的美雄酮-D3、司坦唑醇-D3等標(biāo)準(zhǔn)品溶液至同一棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻得同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（美雄酮-D3、司坦唑醇-D3、甲基睪丸酮-D3、丙酸睪酮-D3、諾龍-D3、丙酸諾龍-D3、勃地酮-D3、群勃龍-D3、睪酮-D3、潑尼松-D8、潑尼松龍-D8、甲基潑尼松龍-D2、地塞米松-D4、倍他米松-D5、倍氯米松-D5質(zhì)量濃度為100 ng/mL，氟氫可的松-D、氫化可的松-D3、精磺胺-15N2、氯噻嗪-13C,15N2、氫氯噻嗪-D2、氯噻酮-D4、氨苯蝶啶-D5、乙酰唑胺-D3、呋塞米-D5、坎利酮-D6、芐氟噻嗪-D5、托拉塞米-D7、布美他尼-D5質(zhì)量濃度為1000 ng/mL）。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液配制

分別吸取10、20、50、100、200、400 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和50 μL同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液于不同1 mL容量瓶中，用30%甲醇溶液（含4%甲酸）定容至刻度，搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中并加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入均質(zhì)子和5 mL水，渦旋混勻5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈，渦旋混勻15 min，超聲30 min，再加入8 g氯化鈉，渦旋混勻5 min，于4 ℃、9500 r/min條件下冷凍離心5 min，取上清液于另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻5 min，于4 ℃、9500 r/min條件下離心5 min，棄去正己烷層，下層溶液待凈化。

1.3.2.2 凈化

取10 mL下層溶液過(guò)PRiME HLB小柱，加入2 mL 5%甲酸-乙腈進(jìn)行洗脫，收集濾液于氮吹管中，45 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL 30%甲醇溶液（含4%甲酸）溶解殘?jiān)瑴u旋混合1 min，超聲2 min，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2.3 條件優(yōu)化

本研究選擇乙腈作為基礎(chǔ)提取溶劑，考察乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈和6%甲酸-乙腈對(duì)不同基質(zhì)中30 種食源性興奮劑的提取效率。同時(shí)對(duì)PRiME HLB（200 mg/6 mL）、PRiME HLB（500 mg/6 mL）、EMR（300 mg/3 mL）、EMR（500 mg/6 mL）、lipono和Nano QuEChERS凈化管與未經(jīng)凈化的提取液對(duì)目標(biāo)物凈化效果進(jìn)行考察。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為0.1%甲酸-甲醇溶液；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源類型：電噴霧電離源；氣簾氣（氮?dú)猓毫Γ?5 psi；噴霧氣（氮?dú)猓毫Γ?5 psi；輔助加熱氣（氮?dú)猓毫Γ?5 psi；離子源溫度：400 ℃；離子化電壓：5000 V/－4500 V；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式。監(jiān)測(cè)離子對(duì)和質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 30 種食源性興奮劑的質(zhì)譜條件與保留時(shí)間Table 2 Mass spectrometric parameters and retention time of 30 foodborne stimulants

1.3.3.3 色譜條件優(yōu)化

選擇超高效液相色譜柱為研究對(duì)象，以提高色譜分離效果并節(jié)約流動(dòng)相?？疾炝薃tlantis C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）4 種色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的分離效果。

以甲醇和乙腈為有機(jī)相，以0.1%甲酸溶液、0.5%甲酸溶液、5 mmol/L甲酸銨溶液、10 mmol/L甲酸銨溶液、5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液、10 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液和20 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液為流動(dòng)相水相，分別考察不同有機(jī)相和流動(dòng)相對(duì)各目標(biāo)物的分離效果和響應(yīng)差異。

1.3.3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在流動(dòng)注射方式下分別對(duì)30 種食源性興奮劑以及同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，根據(jù)對(duì)比各目標(biāo)物母離子響應(yīng)強(qiáng)度選擇各自適宜的正負(fù)離子掃描模式，并確定各目標(biāo)物的m/z。以此為基礎(chǔ)選取該母離子響應(yīng)相對(duì)較高、專屬性較強(qiáng)的2 個(gè)子離子建立MRM通道，并對(duì)去簇電壓和碰撞電壓優(yōu)化，同時(shí)在接入流動(dòng)相后繼續(xù)優(yōu)化氣簾氣、噴霧氣、輔助加熱氣、離子源溫度、離子化電壓等條件。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別稱取不同品種且適量份數(shù)的空白基質(zhì)樣品，除不加入同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液外均按照1.3.2節(jié)獲取空白樣品提取液。分別使用空白樣品提取液和30%甲醇溶液（含4%甲酸）稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值考察30 種興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

乙腈具有沉淀蛋白、與油脂相容性較差等特性，是提取動(dòng)物源性食品中有關(guān)物質(zhì)最為常見(jiàn)的提取溶劑[10]，本研究按照1.3.2.3節(jié)所述分別考察了乙腈和不同比例甲酸-乙腈的提取效率，結(jié)果表明，不同含酸量的乙腈其提取效率表現(xiàn)出較大差異（圖1）。以豬肉為例，不同酸度的甲酸-乙腈對(duì)糖皮質(zhì)激素和大部分利尿劑提取效率差異并不明顯，但對(duì)于司坦唑醇、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、氯噻酮、布美他尼、芐氟噻嗪等極性較小的食源性興奮劑，提取效率與甲酸-乙腈的酸度呈正相關(guān)，且表現(xiàn)出較大差異，5%甲酸-乙腈和6%甲酸-乙腈對(duì)以上幾種物質(zhì)的提取效率差異不大。為兼顧30 種興奮劑的提取效率，本研究選擇5%的甲酸-乙腈作為提取溶劑。

圖1 6 種提取溶劑的提取效率對(duì)比Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of six solvents

2.2 凈化方式考察

由于動(dòng)物源性食品中含有大量脂溶性雜質(zhì)、色素等干擾物，容易干擾儀器檢測(cè)，因此，對(duì)凈化方法進(jìn)行優(yōu)化。目前主流的凈化方式有固相萃取、QuEChERS、液液分散萃取等。而通過(guò)式固相萃取小柱凈化具有免活化、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，本研究按照1.3.2.3節(jié)所述對(duì)不同凈化方式的凈化效果進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表3。PRiME HLB小柱（500 mg/6 mL）凈化后回收率較高，對(duì)去除基質(zhì)效應(yīng)的效果更好，因此選擇PRiME HLB小柱（500 mg/6 mL）為凈化所用。

表3 不同凈化方式的回收率Table 3 Comparison of recoveries of different purification methods

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1 色譜柱選擇

4 種色譜柱在同一流動(dòng)相條件下對(duì)待測(cè)物的色譜保留性能相似，其中ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱對(duì)30 種物質(zhì)的分離效果、峰型和對(duì)稱度更好。

2.3.2 流動(dòng)相選擇

對(duì)流動(dòng)相的有機(jī)相考察研究結(jié)果表明，由于螺內(nèi)酯和坎利酮為同分異構(gòu)體，選擇乙腈作為有機(jī)相時(shí)，化合物不能完全分離；選擇甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)，化合物均可分離且分離度較好。同時(shí)比較了甲醇、0.1%甲酸-甲醇和0.5%甲酸-甲醇對(duì)30 種食源性興奮劑信號(hào)響應(yīng)的差異，有機(jī)相為含酸甲醇時(shí)大部分化合物響應(yīng)均高于甲醇，結(jié)合色譜條件的普適性，選擇0.1%甲酸-甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相[13-14]。

同時(shí)在流動(dòng)相水相考察研究中發(fā)現(xiàn)，群勃龍、甲基睪酮、美雄酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍等蛋白同化劑在甲酸銨溶液作為流動(dòng)相水相時(shí)的響應(yīng)情況明顯高于甲酸溶液，繼續(xù)在甲酸銨溶液中加入甲酸，布美他尼、精磺胺等利尿劑響應(yīng)得到提升。結(jié)合目標(biāo)物響應(yīng)與峰形等因素，選擇5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液作為流動(dòng)相的水相[14]。

30 種興奮劑在使用0.1%甲酸-甲醇和5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液作為流動(dòng)相時(shí)的色譜圖見(jiàn)圖2，地塞米松和倍他米松在該色譜條件下無(wú)法分離，在檢出時(shí)，可通過(guò)調(diào)整色譜條件后進(jìn)行單獨(dú)測(cè)定。

圖2 30 種食源性興奮劑標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 30 foodborne stimulant standard solutions

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

各目標(biāo)物母離子、子離子等相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果表明，蛋白同化劑在正離子掃描模式下響應(yīng)更高[15-16]，氨苯喋啶、螺內(nèi)酯、坎利酮、托拉塞米、布美他尼在正離子模式下響應(yīng)高于負(fù)離子模式；正離子模式下以上物質(zhì)母離子均呈現(xiàn)[M＋H]＋離子峰。而糖皮質(zhì)激素和其余利尿劑在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高[8-9,17-19]，其母離子為[M－H]－離子峰。各目標(biāo)物的定量子離子和定性子離子均在權(quán)衡靈敏度和專屬性等方面后進(jìn)行選擇。

2.5 復(fù)溶溶劑優(yōu)化

在保證其他條件不變的情況下，對(duì)不同比例的甲醇溶液進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)有機(jī)相比例大于30%時(shí)，氨苯蝶啶峰形較差，具有較為明顯的溶劑效應(yīng)。在保證有機(jī)相比例不變的情況下，考察含有不同比例甲酸的復(fù)溶效果，由于丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍等化合物的脂溶性較強(qiáng)，其回收率與復(fù)溶溶劑中甲酸酸度呈正相關(guān)[20]。但當(dāng)甲酸含量大于4%時(shí)，該類化合物的回收率基本不變，因此，選擇30%甲醇溶液（含4%甲酸）作為復(fù)溶溶劑。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的優(yōu)化

使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源性食品過(guò)程中可能帶入不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)的存在直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[21-22]，因此，本研究按照1.3.4節(jié)所述對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。若基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在0.85～1.15之間，則認(rèn)為不存在基質(zhì)效應(yīng)，反之則存在基質(zhì)效應(yīng)。30 種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，檢測(cè)不同基質(zhì)中的食源性興奮劑時(shí)均存在較明顯的基質(zhì)效應(yīng)，且由于部分預(yù)制型動(dòng)物源性食品的基質(zhì)更為復(fù)雜，本研究為減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)際樣品測(cè)定的干擾，采用同位素內(nèi)標(biāo)法做定量分析[13]。

2.7 線性關(guān)系、檢出限與定量限優(yōu)化

對(duì)1.3.1.3節(jié)所配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液進(jìn)行測(cè)試，并建立不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同物質(zhì)的線性范圍和對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)見(jiàn)表4。采取在空白試樣中逐級(jí)稀釋加標(biāo)濃度的方式確定30 種食源性興奮劑的檢出限和定量限[23]。同時(shí)在不同基質(zhì)中加入檢出限和定量限水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，不同基質(zhì)中檢出限水平的各食源性興奮劑其定性離子對(duì)、定量離子對(duì)信噪比均大于3；定量限水平的各食源性興奮劑其定性離子對(duì)、定量離子對(duì)信噪比均大于10[24]。

2.8 方法回收率與精密度

依據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》，分別稱取豬肉、雞肉、蝦、牛奶、雞蛋空白基質(zhì)樣品，按照定量限、兩倍定量限和10 倍定量限進(jìn)行3水平添加實(shí)驗(yàn)（n＝6），按照1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)，考察所確定方法的回收率和精密度[25]。如表5所示，本研究的平均回收率在67.5%～114.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.7%～16.1%。

2.9 實(shí)際樣品測(cè)試

采用本方法對(duì)購(gòu)于市場(chǎng)的豬肉、雞肉、蝦、雞蛋、牛奶以及部分相關(guān)制品共50余批次樣品進(jìn)行30 種食源性興奮劑的檢測(cè)，在1 批次豬肉制品中檢出4.52 μg/kg的氫化可的松，采用農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告—2—2008進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證，氫化可的松的測(cè)定結(jié)果為4.28 μg/kg，兩種方法測(cè)得結(jié)果的RSD為5.20%。另有1 批次牛肉中檢出1.78 μg/kg的睪酮，采用農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告—1—2008對(duì)以上樣品進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證，睪酮的測(cè)定結(jié)果為1.68 μg/kg，兩種方法測(cè)定結(jié)果的RSD為5.88%。綜上，本方法在有效縮減提取凈化步驟、節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間、增加檢測(cè)通路、提高檢驗(yàn)效率的同時(shí)依然能夠保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)動(dòng)物源性食品中30 種食源性興奮劑的檢測(cè)需求，通過(guò)優(yōu)化儀器條件、提取溶劑、凈化方式和定量方法等建立了通過(guò)式固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法。該方法能有效消除不同復(fù)雜基質(zhì)樣品檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)，具有靈敏度高、檢測(cè)通量較大、操作簡(jiǎn)單、普適性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足賽事用動(dòng)物源性食品中10 種蛋白同化劑、8 種糖皮質(zhì)激素和12 種利尿劑的檢測(cè)需求。