張鵬 陳弘林 伍子賢 余思瑤 招文華 尚奇 何嘉輝 陳桂鋒 余富勇 梁德 江曉兵 任輝* 余翔,4*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510260

4.廣東省中醫(yī)臨床研究院,廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OF)作為骨質(zhì)疏松癥最嚴重的并發(fā)癥,其發(fā)病率逐年升高,預(yù)計2035年我國髖部、椎體以及腕部OF約有483萬例,至2050年將達599萬例[1]。臨床多使用骨吸收抑制劑來治療OF,但這些藥物的臨床運用由于其使用過程中存在的并發(fā)癥而受到限制[2]。近年來,中醫(yī)藥在治療OF上展現(xiàn)出良好的療效,國內(nèi)外專家學(xué)者也逐漸開始關(guān)注這一領(lǐng)域[3-4]。

龜板(plastrum testudinis,PT)具有補腎強骨的功效,近年來對龜板抗OF的研究越來越多,但多集中在PT促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化方面,研究表明龜板提取物及含藥血清對大鼠BMSCs有促增殖作用,在臨床上有較好的實際運用和發(fā)展前景[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從多分子、多靶點、多途徑的角度闡述藥物干預(yù)疾病的治療原理[6]。因此,本文擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探討PT治療OF的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 龜板化合物及靶點信息的獲取

借助BATMAN數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)尋找龜板的相關(guān)活性物質(zhì)及其對應(yīng)靶點,將閥值“Score cutoff”設(shè)置為10[7]。

1.2 骨質(zhì)疏松性骨折靶點集及龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點獲取

在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫檢索得到OF靶點集,并借助R軟件將其與1.1中得到的靶點交集映射獲取兩者的交集靶點。

1.3 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),去除孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息,并將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),借助網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析進一步篩選核心靶點。

1.4 龜板-活性成分-靶標-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

組建“龜板-活性成分-靶標-骨質(zhì)疏松性骨折”四者之間的對應(yīng)信息,將其導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2 軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.5 GO生物過程富集分析

交集靶點的GO生物過程(biological process,BP)富集分析通過R軟件完成,以點狀圖的形式展示顯著性排在前20的富集條目。此外,將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中進行GO.BP富集分析,篩選出主要與OF相關(guān)的生物學(xué)過程(P<0.05),可視化展示上述生物學(xué)過程及其對應(yīng)的交集靶點。

1.6 KEGG通路富集分析

同樣利用R軟件對交集靶點進行KEGG分析,將富集得到的信號通路(P<0.05)按照顯著性進行排序展示,并構(gòu)建“通路-靶標”之間的對應(yīng)關(guān)系,通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化展示[8]。

1.7 實驗驗證

1.7.1實驗動物:SPF級雌性SD大鼠30只,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有動物實驗均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(No.TCMF1-2021068)。

1.7.2實驗試劑:重組人RANKL(6449-TEC)購于美國R&D Systems公司,重組人M-CSF(11792-H08Y)購于北京義翹神州科技股份有限公司,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購于美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)、α-MEM培養(yǎng)基購于賽業(yè)生物科技有限公司,CCK8試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,龜板購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(批號:KG37243537)。

1.7.3龜板水提液的制備:參照本課題組前期研究基礎(chǔ)[9]。100 g龜板粉碎后,加1 L純水,微沸1 h,獲得提取液,剩余藥渣重復(fù)操作微沸2次后獲得提取液。所有提取液0.22 μm過濾除菌,分裝并密封后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.7.4OF大鼠模型的構(gòu)建及龜板的干預(yù):將30只雌性SD大鼠隨機分為3組:假手術(shù)組、OF組和OF+PT組,每組10只。其中假手術(shù)組僅予術(shù)口切開,生理鹽水灌胃;根據(jù)既往報道的方法[10],OF組大鼠去除雙側(cè)卵巢3個月后,于L6椎體側(cè)造一直徑為3 mm、深度為3 mm的圓形骨缺損,以模擬骨質(zhì)疏松性椎體骨折后局部骨缺損狀態(tài);OF+PT組予構(gòu)建大鼠L6椎體OF模型,龜板水提液灌胃,灌胃濃度按照人和動物間體表面積折算的等效劑量比值換算為:3.15 g/(kg·d)。造模成功后,灌胃治療4周后處死各組大鼠并取材,取L6傷椎行micro-CT、HE染色評估OF模型大鼠骨缺損愈合的情況。

1.7.5實驗細胞培養(yǎng):所有臨床實驗均通過本院倫理委員會的批準(No.K[2019]129)。在本研究中,從確診為OF[11-12]的男性患者(n=3)中取外周靜脈血10 mL,均經(jīng)患者知情同意。根據(jù)文獻報道的方法[13],從血液樣本中提取人外周血單核細胞(human peripheral blood monocytes,HPBMs)進行培養(yǎng)。

1.7.6CCK8法檢測龜板對HPBMs活性的影響:取HPBMs以1×104/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后分為對照組和龜板干預(yù)組,對照組加入含25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基,龜板干預(yù)組加入含不同濃度梯度的龜板水提液和25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基,共設(shè)置5、10、20、30 μg/mL 4個濃度梯度,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),分別于給藥后0、1、3、5、7 d取出1塊培養(yǎng)板,檢測HPBMs的吸光度值(OD 450 nm)。

1.7.7TRAP染色鑒定龜板對HPBMs破骨分化的影響:取HPBMs以2×105個/cm2的密度接種于24孔板中,選取CCK8法檢測得到對HPBMs無細胞毒性的龜板水提液濃度進行干預(yù),即用含25 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL及不同濃度龜板水提液的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天換液。干預(yù)10 d后進行TRAP染色,將具有3個以上細胞核,且細胞質(zhì)染成酒紅色的細胞定義為TRAP染色陽性(TRAP+)的成熟破骨細胞。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 龜板成分及作用靶點信息

通過BATMAN數(shù)據(jù)庫檢索去重后得到龜板6個活性成分,包括苯丙氨酸(Phenylalanine)、甲硫氨酸(Methionine)、蘇氨酸(Threonine)、碳酸鈣(Calcium Carbonate)、亮氨酸(Leucine)、天冬氨酸(Aspartic Acid),以及342個作用靶標。

2.2 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點獲取

共獲得OF相關(guān)靶點840個,與 342個PT靶點交集映射得到34個交集靶點。交集靶點信息見表1。

表1 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點基因

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和龜板-活性成分-靶標-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

交集靶點構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共涉及32個節(jié)點,126條邊。該網(wǎng)絡(luò)中有17個靶點蛋白的度值超過平均值(7.875),視其為核心靶點,詳見表2。龜板-活性成分-靶標-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)圖由42個節(jié)點和79條邊組成,線條代表龜板、活性成分、作用靶點和骨質(zhì)疏松性骨折之間的對應(yīng)關(guān)系,網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析提示度值排名前3位的核心活性成分為苯丙氨酸(Phenylalanine,度值=21)、甲硫氨酸(Methionine,度值=9)、蘇氨酸(Threonine,度值=4)。

表2 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的核心靶點

2.4 GO.BP富集分析

GO.BP富集分析共獲得802個結(jié)果,主要涉及破骨分化的調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、NF-κB信號的正向調(diào)控、雌激素反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控等。此外,利用Cytoscape 3.7.2進行交集靶點的GO.BP富集分析并篩選與OF密切相關(guān)的結(jié)果,主要涉及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激素代謝及細胞周期等生物過程。

2.5 KEGG分析

使用R軟件對34個靶點基因進行KEGG分析,共得到67個結(jié)果,主要涉及與破骨分化、炎癥反應(yīng)、激素代謝密切相關(guān)的通路。篩選得到相關(guān)信號通路共有22條,詳見表3。

表3 富集的信號通路

2.6 Micro-CT及HE染色檢測龜板對OF模型大鼠骨缺損愈合的影響

如圖1所示,micro-CT結(jié)果提示龜板可有效治療大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折骨缺損,HE染色結(jié)果顯示龜板干預(yù)4周后可有更多骨形成,促進OF大鼠椎體骨折骨缺損愈合。

圖1 龜板干預(yù)4周后micro-CT和HE染色結(jié)果

2.7 CCK8檢測龜板對HPBMs增殖的影響

通過CCK8法檢測發(fā)現(xiàn),龜板水提液濃度在不超過10 μg/mL的情況下對HPBMs無細胞毒性,見圖2。

2.8 TRAP染色鑒定龜板對HPBMs破骨分化的影響

在不影響HPBMs增殖的相應(yīng)濃度龜板水提液干預(yù)下,發(fā)現(xiàn)隨著龜板水提液濃度的增加,成熟破骨細胞的數(shù)量明顯減少(圖3),差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1),這證明龜板能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的HPBMs破骨分化。

圖3 TRAP染色分析及量化

3 討論

3.1 活性成分、靶標與PPI網(wǎng)絡(luò)分析

通過對龜板-活性成分-靶標-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)圖進行分析,發(fā)現(xiàn)龜板6個活性成分分別調(diào)控34個靶點影響其對骨質(zhì)疏松性骨折的治療機制。如血漿苯丙氨酸(Phenylalanine)濃度升高可能會對骨骼狀況有不利影響,降低骨強度,增加骨折的風(fēng)險[14]。蘇氨酸(Threonine)是AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的蛋白底物,活化的AKT磷酸化蘇氨酸等多種底物參與調(diào)節(jié)成骨、破骨細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的PI3K/AKT通路,影響成骨、破骨細胞的增殖、分化及凋亡,進而影響骨密度[15]。碳酸鈣等礦物元素是機體骨代謝平衡的重要底物,可增加骨鈣含量和骨密度,對OF有較好的防治作用[16]。

經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選后得到度值位列前三的作用靶點為FOS、TNF、BDNF,推測它們可能在龜板治療OF過程中起到關(guān)鍵作用。FOS是c-fos基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的蛋白,在調(diào)控細胞分裂、增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[17]。FOS與破骨細胞關(guān)系密切,FOS表達受抑制時破骨細胞數(shù)量隨之減少[18]。此外,FOS可通過影響RANKL-RANK介導(dǎo)的破骨細胞生成信號傳導(dǎo)途徑,抑制破骨細胞生成[19]。因此,FOS對調(diào)節(jié)骨折愈合骨形成和骨吸收起著重要作用[20]。TNF與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),可誘導(dǎo)M-CSF的表達,NF-κB因子可被其激活進而啟動RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞形成過程,增強骨吸收[21]。BDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)與骨的發(fā)育有著密切的聯(lián)系,BDNF能促進破骨細胞增殖分化[22]。另外,BDNF和IGF-1具有協(xié)同作用,它們共同調(diào)節(jié)ERK/p38 MAPK通路活性,促進軟骨細胞增殖和分化[23]。同時,有研究顯示BDNF基因可能通過MAPK通路調(diào)控成骨分化[24]。

3.2 GO和KEGG分析

GO分析結(jié)果所反映的內(nèi)容類似于PPI網(wǎng)絡(luò)規(guī)律,多涉及炎癥反應(yīng)、激素代謝和細胞周期(如破骨細胞分化)的調(diào)節(jié)。而KEGG分析結(jié)果反映的內(nèi)容也印證了PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析及GO分析結(jié)果所展現(xiàn)的規(guī)律。例如,TNF信號通路的相關(guān)研究表明,炎性因子TNF-α可促進RANKL表達,誘導(dǎo)破骨細胞形成[21]。MAPK信號通路可通過促進骨保護素(OPG)表達[25],進而與RANK競爭性結(jié)合RANKL,最終導(dǎo)致破骨細胞的凋亡[26];Estrogen(雌激素)信號通路可以協(xié)同Wnt等多條信號通路共同調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡[27]。

3.3 體內(nèi)外實驗分析

近年來對龜板抗OF的研究越來越多,針對其起效機制的研究也主要集中于促進BMSCs成骨分化方面[5],對于龜板影響破骨分化的機制鮮有報道。而本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對破骨分化的調(diào)節(jié)可能是龜板抗骨質(zhì)疏松性骨折的重要機制。為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的可靠性,本研究開展了動物實驗,證實龜板可有效治療OF模型大鼠的骨缺損,并且通過體外實驗首次探究了龜板干預(yù)下的OF患者HPBMs表型,發(fā)現(xiàn)龜板能顯著抑制HPBMs破骨分化。

綜上所述,本研究結(jié)果提示龜板可能通過多種化合物、靶點和通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激素代謝及細胞周期來治療OF,其中抑制破骨分化可能是龜板抗OF的重要機制。