方錦穎　陳琪　國文文　楊德爽　孟州令　陳光耀　吳卓耘　王素梅

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龜板對(duì)多發(fā)性抽動(dòng)癥模型大鼠的干預(yù)作用與對(duì)DA及D2受體的影響

方錦穎陳琪國文文楊德爽孟州令陳光耀吳卓耘王素梅

100029北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[方錦穎、陳琪、國文文、楊德爽、孟州令、陳光耀、吳卓耘(碩士研究生)]；北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院兒科(王素梅)

【摘要】目的探究龜板對(duì)多發(fā)性抽動(dòng)癥(tourette syndrome，TS)模型大鼠的行為學(xué)改變，及其對(duì)紋狀體多巴胺(dopamine，DA)、多巴胺D2受體(dopamine D2receptor，D2R)、血漿中DA的含量的影響。 方法將40只大鼠分為空白組、模型組、硫必利組和龜板組。腹腔注射亞氨基二丙腈(iminodipropionitrile，IDPN)建立TS模型，并給予每組相應(yīng)的生理鹽水或藥物灌胃。造模完成后每周進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，并于造模第4周采用ELISA法檢測(cè)紋狀體DA、D2R、血漿中DA的含量。結(jié)果(1)與模型組比較, 兩周后硫必利組大鼠刻板行為減少(P<0.05)，三周后運(yùn)動(dòng)行為減少(P<0.05)，四周后運(yùn)動(dòng)行為明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，龜板組兩周后大鼠刻板行為與運(yùn)動(dòng)行為均減少(P<0.05)；(2)模型組大鼠較空白組大鼠血漿中DA含量升高(P<0.05)，紋狀體DA含量降低(P<0.05)，紋狀體D2R含量升高(P<0.05)。與模型組比較，龜板組大鼠血漿DA含量減少(P<0.05)，硫必利組血漿DA明顯減少(P<0.01)，紋狀體DA含量兩組均升高(P<0.05)，兩組紋狀體D2R未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。結(jié)論龜板對(duì)TS有良好的治療作用，其原因可能與調(diào)節(jié)DA的代謝有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】多發(fā)性抽動(dòng)癥；龜板；多巴胺；多巴胺D2受體

多發(fā)性抽動(dòng)癥(tourette syndrome，TS)是發(fā)病于兒童時(shí)期的一種以慢性多發(fā)運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)和(或)發(fā)聲性抽動(dòng)為特征的神經(jīng)精神性疾病[1]。其發(fā)病原因尚不明確，可能與遺傳、免疫、心理、神經(jīng)遞質(zhì)失衡等多方面因素相關(guān)。其中以中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類遞質(zhì)失衡造成TS發(fā)病機(jī)制的學(xué)說占據(jù)了主導(dǎo)地位，因此西醫(yī)在TS治療中多選取DA受體阻滯劑[2]。但是由于錐體外系反應(yīng)等一系列的副作用，往往因患者不能夠耐受而依從性較差。相對(duì)比，中醫(yī)藥在治療TS方面具有副作用小以及多系統(tǒng)、多層面、多靶點(diǎn)的的特點(diǎn)，并得到了大量臨床與實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)[3-4]。因此中醫(yī)藥對(duì)抽動(dòng)癥的治療成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

龜板是烏龜?shù)谋臣滓约案辜?，具有潛降肝陽、補(bǔ)心安神的作用，是治療TS的方劑中被運(yùn)用頻率較高的藥物之一[5]。亦有研究表明龜板能夠通過抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡、影響DA及其代謝產(chǎn)物的含量，從而改善帕金森模型大鼠的行為學(xué)并發(fā)揮保護(hù)作用[6-7]。本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究龜板對(duì)TS的確切治療作用，并通過DA及D2R探究治療機(jī)制，為進(jìn)一步的研究以及指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性 SD 大鼠 40只，體質(zhì)量(180±20)g，提前一周購入并進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2011-0004。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品

龜板：由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供并制備成顆粒劑，顆粒劑用蒸餾水配制成懸濁液，生藥含量為0.315 g/mL。硫必利：由江蘇天士力帝益有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào)：201504091)，用蒸餾水配置成3.87 mg/mL的溶液。IDPN：購自美國Sigma公司，使用生理鹽水稀釋成10%的溶液。以上藥物放在4℃冰箱中備用。

1.3實(shí)驗(yàn)材料

大鼠DA酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒、大鼠D2R酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，均購自武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為 4組，分別為空白組、模型組、龜板組、硫必利組，每組10只。灌藥過程中模型組1只大鼠因過度虛弱死亡并剔除數(shù)據(jù)。

1.5造模

將配置好的IDPN行大鼠腹腔注射，注射劑量為300 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥7天。

1.6給藥

造模后每天早上7點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，空白組和模型組給予生理鹽水；龜板組和硫必利組分別給予龜板懸濁液和硫必利水溶液。以上各組灌胃劑量均為1 mL/100 g。

表1　各組大鼠治療前后運(yùn)動(dòng)行為變化比較±s)

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2　各組大鼠治療前后刻板行為變化比較±s)

注： 正常組無刻板行為故不參與比較；與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01。

表3　各組大鼠DA以及D2R含量比較

注： 與正常組相比較，aP<0.05；與模型組相比較，bP<0.01，cP<0.05。

1.7監(jiān)測(cè)指標(biāo)

1.7.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)(1)運(yùn)動(dòng)行為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[8]：0分：安靜或正?；顒?dòng)；1分：過度興奮；2分：探究行為增加，不連續(xù)吸鼻；3分：不停跑動(dòng)；4分：不停跑動(dòng)伴有驚跳。(2)刻板行為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：參照Diamond評(píng)分法[9]：0分：無刻板運(yùn)動(dòng)；1分：軀體旋轉(zhuǎn)行為(順時(shí)針或逆時(shí)針的旋轉(zhuǎn)行為)； 2分：頭和頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多(頭頸部和地面垂直方向的一種異常運(yùn)動(dòng))；3分：頭頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多加旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；4分：頭向側(cè)擺，合并頭和頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多。(3)行為學(xué)評(píng)估時(shí)間： 造模后以及灌藥過程中每隔7天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行5次行為學(xué)測(cè)試。

1.7.2DA、D2R含量檢測(cè)末次給藥后夜間禁食不禁水，每組大鼠隨機(jī)選取5只，斷頭后取血放入EDTA抗凝管中，冷凍離心(3000 rpm，10分鐘)，取上清液放于-80℃冰箱保存。并在冰盒上快速剝離大鼠紋狀體并放入凍存管中，置于液氮中保存。測(cè)定時(shí)標(biāo)本保持在2～8℃，加入磷酸緩沖液，用勻漿器勻漿并冷凍離心(3000 rpm，20分鐘)，取上清液對(duì)DA、D2R進(jìn)行檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1對(duì)TS模型大鼠運(yùn)動(dòng)行為積分影響

不同藥物干預(yù)前后TS模型大鼠運(yùn)動(dòng)行為積分變化如表1所示，給藥3周后硫必利組低于模型組(P<0.05)；給藥2周后龜板組低于模型組(P<0.05)。

2.2對(duì)TS模型大鼠運(yùn)動(dòng)刻板行為積分影響

不同藥物干預(yù)前后TS模型大鼠刻板行為積分變化如表2所示，給藥2周后硫必利組低于模型組(P<0.05)；給藥2周后龜板組低于模型組(P<0.05)。

2.3對(duì)TS模型大鼠血漿及紋狀體DA、D2R含量影響

不同藥物干預(yù)前后TS模型大鼠DA、D2R含量變化如表3所示，模型組大鼠較正常組大鼠血漿中DA含量升高(P<0.05)，紋狀體DA含量降低(P<0.05)，紋狀體D2R含量升高(P<0.05)；與模型組相比，龜板組大鼠血漿DA含量減少(P<0.05)，硫必利組血漿DA明顯減少(P<0.01)，紋狀體DA含量兩組均升高(P<0.05)。

3討論

亞氨基二丙腈(iminodipropionitrile，IDPN)是一種神經(jīng)毒素，對(duì)其建立的TS模型大鼠中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均造成了不易改變的持續(xù)性損傷[10]。研究表明IDPN模型通過使DA受體出現(xiàn)超敏感，從而誘發(fā)抽動(dòng)癥狀[11]，表現(xiàn)為過度興奮、點(diǎn)頭、擺頭、旋轉(zhuǎn)、舞蹈樣運(yùn)動(dòng)等一系列類似于抽動(dòng)癥狀的行為。實(shí)驗(yàn)研究表明，作用于DA靶點(diǎn)的藥物能夠改變?cè)撃Ｐ偷男袨閷W(xué)變化[12]，是研究TS較為可靠的模型之一。

多巴胺系統(tǒng)功能異常被認(rèn)為是TS發(fā)病最為主要的原因，并且得到了許多相關(guān)研究的證實(shí)，西醫(yī)臨床亦采用DA受體阻滯劑硫必利、氟哌啶醇等藥物作為首選藥物對(duì)TS患者進(jìn)行治療[13]。DA神經(jīng)元主要集中在中腦和基底節(jié)部位，80%的DA神經(jīng)元集中在黑質(zhì)—紋狀體系統(tǒng)中，對(duì)該部位進(jìn)行檢測(cè)能較好地反映出DA及其受體的變化[14]。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究均發(fā)現(xiàn)，TS患者與IDPN建立的動(dòng)物模型中，血液中的DA含量較正常組明顯增高，這種差別造成的原因可能與DA代謝有關(guān)[15]。因此對(duì)血漿中DA含量、紋狀體中DA以及其受體的檢測(cè)能夠反映出TS模型大鼠中樞和外周DA系統(tǒng)的變化。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龜板能在一定程度上有效改變TS模型大鼠運(yùn)動(dòng)行為興奮性增強(qiáng)以及刻板行為增多的表現(xiàn)，這可能與龜板的滋陰潛陽作用，進(jìn)一步發(fā)揮鎮(zhèn)驚安神的功效相關(guān)。通過對(duì)大鼠DA含量研究發(fā)現(xiàn)，IDPN能夠降低紋狀體中DA含量、升高血漿中DA的含量，表明IDPN可能是影響了DA的代謝從而使模型大鼠出現(xiàn)抽動(dòng)等一系列的表現(xiàn)。而硫必利與龜板均能在一定程度上升高紋狀體DA含量、降低血液中DA含量，提示了這兩種藥物對(duì)TS治療作用可能與DA的代謝密切相關(guān)。而對(duì)多巴胺受體D2R的含量研究發(fā)現(xiàn)，IDPN能夠使紋狀體D2R含量升高。但硫必利與龜板均未能改變D2R的含量，提示兩種藥物對(duì)TS的治療作用與影響D2R表達(dá)的機(jī)制無關(guān)。綜上，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了龜板對(duì)TS模型的調(diào)節(jié)作用，該調(diào)節(jié)作用與DA代謝密切相關(guān)，宜對(duì)該機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而更加明確龜板對(duì)TS的治療機(jī)制。

通過對(duì)龜板作用于TS的實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了龜板對(duì)TS的治療作用，為臨床用藥提供了依據(jù)。若進(jìn)一步研究能夠確定其有效成份，將為TS相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供新的基礎(chǔ)與思路。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Intervention effect of Plastrum Testudinis on rat model of TS and DA and D2receptor

FANGJin-ying，CHENQi，GUOWen-wen，etal.

ShoolofBasicMedicalSciences，BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029,ChinaCorrespondingauthor:WANGSu-mei，E-mail：wangsumei120@163.com

【Abstact】ObjectiveTo investigate the behavior change of Plastrum Testudinis on Tourette’s syndrome (TS) in a rat model, and the influence of Plastrum Testudinis on striatal dopamine (DA), dopamine D2receptor (D2R) and the content of DA in plasma, and provide neural biochemical basis of Plastrum Testudinis in treatment of TS. Methods40 rats were divided into blank group, model group, Tiapride group and Plastrum Testudinis group. Rats were injected intraperitoneally with iminodipropionitrile (IDPN) to establish the TS model, and the rats weregiven corresponding normal saline and drugs. Behavioral testing was performed weekly after the model was completed, and the contents of DA, D2R and DA in the striatum were detected by ELISA method at fourth weeks after the model was made. Results(1)Compared with model group, stereotyped behavior of Tiapride group was reduced(P<0.05) after 2weeks, motor behavior was reduced after 3weeks (P<0.05), motor behavior was reduced obviously after 4weeks(P<0.01). Compared with model group, stereotyped behavior and motor behavior of Plastrum Testudinis group was reduced (P<0.05). (2)Compared with blank group, DA in plasma of model group was increased (P<0.05); DA in corpus striatum was reduced (P<0.05) and D2R in corpus striatum was increased (P<0.05). Compared with model group, DA in plasma was reduced in Plastrum Testudinis group (P<0.05) and significantly reduced in Tiapride group(P<0.01), DA in corpus striatum were all increased in two group (P<0.05), D2R in corpus striatum did not change obviously (P>0.05). ConclusionsThe influence of Plastrum Testudinis on rat model of TS was significantly, and the reason maybe related to the regulation of DA metabolism.

【Keywords】Tourette syndrome；Plastrum Testudinis；Dopamine；Dopamine D2receptor

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81273799)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510026011)；北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃專項(xiàng)(BJGJ1616)

作者簡介：方錦穎(1995- )，女，2014級(jí)本碩連讀本科階段在讀。研究方向：神經(jīng)精神疾病病證結(jié)合研究。E-mail：fangjinying1@163.com 通訊作者： 王素梅(1950- )，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：小兒肝系疾病。E-mail：wangsumei120@163.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.002

(收稿日期：2015-10-06)