朱志剛　姚映芷

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·論著·

化痰活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠的研究

朱志剛姚映芷

210023南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室[朱志剛(碩士研究生)、姚映芷]

【摘要】目的研究化痰活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠的影響。方法通過(guò)建立高脂血癥大鼠模型，灌胃給予化痰活血方(荷葉、海藻、決明子、三七、丹參、姜黃)2659.5 mg/(kg·d)，給藥4周，測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)，計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)和TC/HDL-C，并做肝組織病理切片。結(jié)果化痰活血方能降低血清TC、TG、LDL-C的含量及CRP、AI指數(shù)、TC/HDL-C比值、AST、ALT。結(jié)論化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平具有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)高脂血癥引起的肝功能損傷具有改善作用，且較阿托伐他汀不會(huì)引起肝功能損害。

【關(guān)鍵詞】化痰活血方；高脂血癥；大鼠實(shí)驗(yàn)

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì)，而高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化及心血管疾病的最危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1-2]。高脂血癥是指血清中總膽固醇、甘油三脂或低密度脂蛋白過(guò)高或高密度脂蛋白過(guò)低的一種常見(jiàn)而多發(fā)的全身代謝性疾病[3]。通過(guò)長(zhǎng)期的跟蹤治療，雖然西藥降脂藥功效顯著，但無(wú)論是煙酸類、貝特類、膽酸螯合類，還是現(xiàn)在主流的他汀類降脂藥，都存在著患者耐受性差、個(gè)體差異明顯以及長(zhǎng)期服用可能會(huì)發(fā)生腹瀉、便秘、脫皮、皮疹、血栓性血小板減少性紫癜，并可引起血清轉(zhuǎn)氨酶升高，甚者可發(fā)生橫紋肌溶解等方面的不足，限制其不能長(zhǎng)期使用[4-7]。而經(jīng)過(guò)大量的研究，已證實(shí)中藥可以很好地調(diào)節(jié)血脂，且與西藥相比毒副作用相對(duì)要小[8-11]。因此，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，尋找安全、療效明確的調(diào)脂中藥受到眾多中醫(yī)藥學(xué)者的重視。基于南京中醫(yī)藥大學(xué)與德國(guó)埃爾朗根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的合作項(xiàng)目，本實(shí)驗(yàn)對(duì)臨床“化痰活血方”治療高脂血癥進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其藥效進(jìn)行比較，為進(jìn)一步研發(fā)安全性較高的降脂中藥提供客觀依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料雄性SD大鼠48只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g(蘇州昭衍新藥研究中心有限公司提供，許可證號(hào)：201511643)；化痰活血方免煎沖劑(荷葉顆粒劑1.5 g、海藻顆粒劑6 g、決明子顆粒劑2.5 g、三七粉10 g、丹參顆粒劑8.75 g、姜黃顆粒劑0.8 g，顆粒劑購(gòu)于江陰天江藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1510111)；阿托伐他汀鈣片(商品名：立普妥，輝瑞制藥有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：L36728)。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[12]進(jìn)行劑量換算，采用雙蒸餾水溶解藥物，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。高脂飼?基礎(chǔ)飼料76%、膽固醇1.5%、蛋黃粉10%、豬油7%、膽鹽0.3%、丙基硫氧嘧啶0.2%、黃豆5%)委托青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)加工，送檢江蘇省理化測(cè)試中心檢測(cè)合格，合格報(bào)告編號(hào)：2015XC-0527。高脂飲食組每天上午10～11點(diǎn)給予高脂飼料(20 g/只/天)。

1.1.2試劑總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(批號(hào)：A20022)、甘油三酯(triglyceride，TG)(批號(hào)：A20061)購(gòu)于Autec Diagnostica公司；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(批號(hào)：080301A)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒(批號(hào)：101001A)購(gòu)于Prodia Diagnostics公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(批號(hào)：101001A)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒(批號(hào)：101001A)均購(gòu)于北京萊幫生物技術(shù)有限公司；C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)試劑盒(批號(hào)：A362)購(gòu)于Beckman Coulter公司。

1.1.3儀器SHZ-82水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市新航儀器廠生產(chǎn)；低速常溫離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；電子分析天平，美國(guó)雙杰集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；LED型電子秤，上海大川電子衡器有限公司生產(chǎn)；奧林巴斯AU2700大型全自動(dòng)生化、免疫分析儀，日本OLYMPUS光學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.2動(dòng)物造模、分組給藥及取材

大鼠實(shí)驗(yàn)環(huán)境由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：SYXK(蘇)2002-0123。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3天后，隨機(jī)選取12只為空白對(duì)照組，飼以普通飼料，其余大鼠飼以高脂飼料，控制飼養(yǎng)溫度為20℃左右，濕度50%～70%，自然光照，自由飲水。每周一及周四更換飲水及墊料,保持動(dòng)物生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周測(cè)一次體質(zhì)量，并觀察大鼠狀態(tài)的變化。4周后，于前一夜禁食12小時(shí)后眼底叢靜脈取血，檢測(cè)血脂四項(xiàng)，采用分層區(qū)組隨機(jī)化的方法，按TC和體質(zhì)量分為3組，每組12只，分別為模型組、阿托伐他汀陽(yáng)性藥對(duì)照組和化痰活血方組。其中，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予阿托伐他汀1.8 mg/(kg·d)；化痰活血方組給予荷葉、海藻、決明子、三七、丹參、姜黃混合制劑2659.5 mg/(kg·d)；空白對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。分別在給藥2、4周后禁食12小時(shí)，眼底叢靜脈采血，測(cè)定各組大鼠血脂指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C及C-反應(yīng)蛋白的含量。同時(shí)給藥4周后，測(cè)定肝功能指標(biāo)AST、ALT。從第29天起，禁食24小時(shí)，自由飲水，眼底靜脈叢采血2.5 mL，在正常溫度下3000 rpm離心10分鐘，分離血清備用。同時(shí)取大鼠新鮮肝臟稱重，取肝左葉組織，切成4～5 mm3小塊，10%中性福爾馬林固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察。

1.3生化指標(biāo)的測(cè)定

TC采用膽固醇氧化酶法測(cè)定；TG采用酶GPO-POD紫外法測(cè)定；HDL-C采用直接一步法法測(cè)定；LDL-C采用免疫化學(xué)比色法測(cè)定；AST，ALT采用速率法測(cè)定；C-反應(yīng)蛋白(CRP)采用速率散射比濁法測(cè)定。計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)，AI=TC-HDL-C/HDL-C。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量

各組大鼠的初始體質(zhì)量在各組間分配均衡，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從造模后到給藥4周，模型組大鼠(飼喂高脂飼料)體質(zhì)量均顯著低于空白組(飼喂基礎(chǔ)飼料)，可能與長(zhǎng)時(shí)間飼喂高脂飼料而導(dǎo)致大鼠厭食有關(guān)，導(dǎo)致體質(zhì)量下降。給藥2、4周后，大鼠的體質(zhì)量在化痰活血方組、阿托伐他汀組與模型組間比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，即所給藥物對(duì)大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯影響。見(jiàn)表1。

2.2化痰活血方對(duì)TC、TG、HDL-C、LDL-C、TC/HDL-C及AI的影響

造模后，模型組大鼠血清的TC、TG含量均高于空白組(均P<0.01)，提示造模成功；給藥組與高脂模型組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)，提示分組合理。與模型組相比，給藥2、4周后，化痰活血方能顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG含量?；祷钛綄?duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血清TC、TG值，具有顯著降低作用。見(jiàn)表2。

造模后，高脂模型組及兩給藥組大鼠血清LDL-C含量與空白組相比具有極顯著性差異(P<0.01)，HDL-C含量與空白組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明本實(shí)驗(yàn)造模方式對(duì)高脂血癥大鼠血清HDL-C無(wú)影響，但是可以升高血清LDL-C含量。給藥2、4周后，化痰活血方組高脂血癥大鼠LDL-C含量顯著降低，與模型組比較，具有極顯著性差異(P<0.01)?；祷钛綄?duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血清LDL-C值，具有顯著降低作用，對(duì)血清HDL-C含量無(wú)影響。見(jiàn)表2。

造模后，高脂模型組大鼠TC/HDL-C比值及動(dòng)脈硬化指數(shù)AI，與空白組相比具有極顯著性差異(均P<0.01)?；祷钛浇M大鼠給藥2周后，血清TC/HDL-C及動(dòng)脈硬化指數(shù)AI降低，與模型組比較均有顯著性差異(均P<0.05)；給藥4周后，化痰活血方組TC/HDL-C值降低(P<0.05)?；祷钛娇梢越档蛯?shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血清TC/HDL-C比值，在給藥2周后，可以降低AI值，給藥4周后，AI值降低不明顯。見(jiàn)表2。

表1　化痰活血方對(duì)高脂大鼠體質(zhì)量的影響±s，g)

注： 與空白組相比，aP<0.05。

表2　化痰活血方對(duì)高脂大鼠血清TC、TG的影響±s)

注： 與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.3化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠肝功能指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝功能指標(biāo)AST、ALT顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，與模型組比較，阿托伐他汀組不能顯著降低ALT水平，而化痰活血方可以降低AST、ALT水平(均P<0.05)。提示化痰活血方對(duì)高脂血癥引起的肝功能損傷具有一定的改善作用，且治療高脂血癥時(shí)較阿托伐他汀不會(huì)引起肝功能損害。見(jiàn)表3。

表3　化痰活血方對(duì)高脂大鼠肝功能指標(biāo)的影響±s)

注： 與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠C反應(yīng)蛋白的影響

造模后，模型組大鼠CRP指數(shù)與空白組相比，無(wú)顯著性差異。給藥4周后，與模型組間比較，化痰活血方組高脂血癥大鼠CRP指數(shù)降低(P<0.05)，說(shuō)明化痰活血方可以降低高脂血癥大鼠CRP的表達(dá)。見(jiàn)表4。

表4　化痰活血方對(duì)高脂大鼠CRP的影響±s)

注： 與空白組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.5各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查的比較

正常組：肝細(xì)胞排列成單板結(jié)構(gòu)，互相連接吻合。肝細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂肪沉積。模型組：肝細(xì)胞單板結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞變大，肝細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)(溶解呈空泡狀)，部分肝細(xì)胞核被推向一側(cè)，胞漿內(nèi)脂滴大小不一，有輕度的細(xì)胞水樣變性和細(xì)胞壞死，炎癥反應(yīng)劇烈。模型組與空白對(duì)照組比較，脂肪變性明顯。阿托伐他汀組：脂肪變性為主，肝內(nèi)脂肪滴減少，散在分布，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，偶見(jiàn)細(xì)胞壞死和水樣變性?；祷钛浇M：肝臟脂肪變性有不同程度的改善，輕度脂肪變?yōu)橹鳎蝺?nèi)脂肪滴減少，散在分布，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，個(gè)別細(xì)胞壞死和水樣變性。化痰活血方組與模型組相比較肝細(xì)胞脂肪變性均有不同程度的緩解。見(jiàn)圖1。

注：A：空白組；B：模型組；C：阿托伐他汀組；D：化痰活血方組

圖1各組大鼠實(shí)驗(yàn)8周后肝組織結(jié)構(gòu)變化(×400)

3討論

3.1大鼠高脂血癥模型的建立

高脂飲食誘導(dǎo)大鼠高脂血癥模型是目前研究高脂血癥及其并發(fā)癥的理想動(dòng)物模型。經(jīng)研究報(bào)道，其可能的機(jī)制是：血中游離脂肪酸(nonestesterified fatty acid，F(xiàn)FA)增多，肝臟中的FFA也增多，肝臟合成及釋放TG增多；脂蛋白脂酶活性下降，使極低密度脂蛋白(very low densitylipoprotein，VLDL)及TG清除率下降；HDL水平下降的原因可能與載脂蛋白向VLDL轉(zhuǎn)移以及HDL與VLDL交換有關(guān)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飼料造模后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清TG、TC、LDL-C含量均明顯升高，提示造模成功。

3.2化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

脂代謝紊亂是誘發(fā)高脂血癥的關(guān)鍵原因，血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量可在一定程度反映機(jī)體脂肪代謝狀況，是監(jiān)測(cè)血脂變化的重要指標(biāo)[16-18]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)及預(yù)防治療試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TC與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、心血管病的發(fā)病率及死亡率有直接的關(guān)系，而降低TC可使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定化[19-20]。流行病學(xué)研究也證實(shí)，高甘油三酯是冠心病獨(dú)立的危險(xiǎn)因子，LDL-C是血漿中膽固醇的主要載體，CRP參與了血栓形成和動(dòng)脈硬化的病理過(guò)程，是腦卒中的危險(xiǎn)因素之一[21-22]。一般認(rèn)為，脂代謝紊亂是造成肝細(xì)胞脂肪變性的初始環(huán)節(jié)，它既能使體內(nèi)增多的FFA直接損害肝細(xì)胞，又能使甘油三酯在肝臟內(nèi)堆積[23]。因此，降低血脂、清除肝臟中累積的脂肪是治療脂肪肝的重要方法[24]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療高脂血癥的方法頗多，運(yùn)用化痰活血法治療高脂血癥的理論和臨床研究，也取得了一定的成果，中醫(yī)藥治療高脂血癥效果明確，且毒副作用較小，可長(zhǎng)期使用又可作為高脂血癥的一級(jí)預(yù)防用藥[25]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，化痰活血方(荷葉、海藻、決明子、三七、丹參、姜黃)能顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C、AI水平及TC/HDL-C值，提示化痰活血方具有調(diào)節(jié)血脂、脂蛋白——膽固醇代謝的作用。肝功能指標(biāo)顯示，化痰活血方可以降低AST、ALT指標(biāo)的值至正常水平，說(shuō)明化痰活血方可對(duì)高脂血癥引起的肝功能損傷具有改善作用，且治療高脂血癥時(shí)較阿托伐他汀不會(huì)引起肝功能損害。同時(shí)，肝臟病理檢測(cè)顯示，化痰活血方可減輕高脂血癥大鼠肝臟病理?yè)p傷程度，可使脂變肝細(xì)胞數(shù)量明顯減少，脂變面積明顯減小，脂變程度明顯減輕。CRP結(jié)果表明，化痰活血方可以降低感染性炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)CRP含量。整方的藥效學(xué)研究表明，化痰活血方具有改善血脂紊亂、減輕肝臟脂肪性病變的作用，能夠預(yù)防和治療高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝等高脂血癥相關(guān)疾病。

本研究對(duì)化痰活血方的調(diào)脂作用及機(jī)理進(jìn)行了初步地研究和探討，在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步從動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)兩方面，考察化痰活血方的安全性，并就化痰活血方的作用機(jī)理及最佳劑量等展開(kāi)深入研究，以研制開(kāi)發(fā)出適宜血脂異?；颊呤褂玫男滦驼{(diào)脂藥物，滿足臨床和市場(chǎng)需求。

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(本文編輯： 董歷華)

Research ofHuatanHuoxueformula on experimental hyperlipidemia rats

ZHUZhi-gang，YAOYing-zhi.

NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing,Jiangsuprovince, 210023，ChinaCorrespondingauthor：YAOYing-zhi，E-mail： 13851894784 @163.com

【Abstract】ObjectiveTo research the effects ofHuatanHuoxueformula on experimental hyperlipidemia rats. MethodsHyperlipidemia rats model was established and theHuatanHuoxueformula group was given the administration dosage of 2659.5 mg/(kg·d) by gavage for 4 weeks. The serum contents of TC, TG, HDL-C, LDL-C, AST, ALT, CRP were detected and the AI and TC/HDL-C content was figured out. Liver tissue pathological slices was observed. ResultsHuatanHuoxueformula could effectively reduce the contents of TC, TG, LDL-C, AI, AST, ALT figures, CRP and TC/HDL-C percent. ConclusionsHuatanHuoxueformula has a certain regulating effect on blood lipid level in hyperlipidemia rats, and can improve the liver function injury induced by hyperlipidemia, and does not cause liver function damage.

【Key words】HuatanHuoxueformula；Hyperlipidemia；Rat experiment

基金項(xiàng)目：南京中醫(yī)藥大學(xué)與德國(guó)埃爾朗根大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作項(xiàng)目(015009022001)

作者簡(jiǎn)介：朱志剛(1990- )，2013級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：心血管系統(tǒng)疾病中藥配伍研究。E-mail：709804125@qq.com 通訊作者： 姚映芷(1958- )，女，本科，副教授，副主任醫(yī)師。研究方向：心血管系統(tǒng)疾病中藥配伍研究。E-mail：13851894784@163.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.003

(收稿日期：2016-03-11)