王景霞 周恬恬 朱映黎 王成龍 吳麗 張建軍
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·論著·
芍藥苷對血虛肝郁證大鼠海馬CA1區(qū)sGCβ1和5種PDE亞型蛋白表達的影響
王景霞周恬恬朱映黎王成龍吳麗張建軍
100029北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中藥教研室[王景霞、周恬恬(碩士研究生)、朱映黎(博士研究生)、王成龍(碩士研究生)、吳麗(碩士研究生)、張建軍]
【摘要】目的研究芍藥苷對血虛肝郁證大鼠海馬環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)含量及CA1區(qū)cGMP合成酶即可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclaseβ1,sGCβ1)和水解酶即磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)不同亞型(PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A)蛋白表達的干預(yù)作用。方法56只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、芍藥苷高劑量組、芍藥苷低劑量組,每組14只。采用輻射結(jié)合束縛法建立血虛肝郁證模型,空白組、模型組灌胃等量蒸餾水,給藥組分別灌以40 mg/kg、 20 mg/kg的芍藥苷,共造模21天。治療結(jié)束后,采用放射免疫法測定cGMP含量;免疫組化法檢測sGCβ1、PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A的蛋白表達。 結(jié)果與模型組相比,芍藥苷高劑量組可降低cGMP含量(P<0.01),并下調(diào)PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A的蛋白表達(P<0.05),且上調(diào)PDE10A的蛋白表達(P<0.05)。結(jié)論芍藥苷對于cGMP水解酶不同亞型存在雙向調(diào)控,與抑制合成酶發(fā)揮協(xié)同作用,降低cGMP的含量,下調(diào)NO/cGMP通路,從而改善血虛肝郁證引起的大腦功能損傷。
【關(guān)鍵詞】血虛肝郁證;芍藥苷;環(huán)磷酸鳥苷;磷酸二酯酶;可溶性鳥苷酸環(huán)化酶
白芍為毛茛科植物芍藥PaeoniaLactifloraPall. 的根,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,苦酸微寒,歸肝脾經(jīng),功能養(yǎng)血斂陰,柔肝止痛,平抑肝陽,是臨床治療血虛肝郁證的常用藥物[1]。芍藥苷是白芍的主要有效成分,課題組前期研究表明其對血虛肝郁證候模型大腦功能損傷確有改善作用[2],并發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與調(diào)節(jié)環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)的合成和水解有關(guān)[3-4],但具體作用靶點尚不明確。由于影響cGMP水解的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)存在多種亞型[5],其中PDE1、PDE2、PDE10作為針對cGMP和cAMP兩種底物的水解酶類,又存在著對于cGMP含量調(diào)節(jié)的不一致[6]。故本實驗通過觀察芍藥苷對血虛肝郁模型大鼠海馬cGMP含量及CA1區(qū)cGMP合成酶即可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase β1,sGCβ1)和水解酶即磷酸二酯酶各亞型PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A蛋白表達的干預(yù)作用,探討cGMP與血虛肝郁證的內(nèi)在聯(lián)系,以及芍藥苷影響模型大鼠海馬cGMP動態(tài)平衡的高效靶點。
1材料與方法
1.1實驗動物
雄性SD大鼠56只,清潔級,體質(zhì)量180~200 g,由斯貝福(北京)實驗動物技術(shù)有限公司提供,動物許可證編號:SCXK(京)2011-0004。
1.2實驗藥品
芍藥苷:自制,經(jīng)白芍飲片提取分離精制而成,HPLC法測定純度高達96%;白芍飲片購自安徽亳州,由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中藥教研室鑒定。
1.3試劑與儀器
鳥苷酸環(huán)化酶測試盒(北京華英生物技術(shù)研究所);ab24824兔抗大鼠sGCβ1(批號:GR89594-9,購自Abcam公司);ab14599兔抗大鼠PDE1A(批號:GR86777-8,購自Abcam公司);ab125677兔抗大鼠PDE2A(批號:GR9115-4,購自Abcam公司);ab14672兔抗大鼠PDE5A(批號:GR69387-5,購自Abcam公司);ab125672兔抗大鼠PDE9A(批號:GR168578-1,購自Abcam公司);ab177933兔抗大鼠PDE10(批號:GR141519-3,購自Abcam公司);abSV0002-兔IgG兩步法免疫組化試劑盒(批號:08CD4A,購自武漢博士德公司生物工程有限公司);DAB試劑盒(批號:1309170031,購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。
1.4分組和給藥
雄性SD大鼠56只,隨機分為空白組、模型組、芍藥苷低劑量組(20 mg/kg)和芍藥苷高劑量組(40 mg/kg)分別相當(dāng)于白芍飲片的1 g/kg、2 g/kg,每組14只。從造模第1天開始給藥,正常組和模型組灌胃等量蒸餾水,其余各組灌胃相應(yīng)藥物,共造模21天。
1.5造模方法
不難看出, 有限差分近似式(3)引入了兩類數(shù)值誤差. 數(shù)值色散修正的是波的相速度, 即c*(ξ)=; 數(shù)值耗散修正的是波的振幅, 記作e-λt, 衰減率對應(yīng)于一種特征衰減時間尺度的倒數(shù), 該時間尺度僅當(dāng)時才有意義.
大鼠常規(guī)單籠飼養(yǎng)適應(yīng)數(shù)天后稱重。除正常組外,其余各組每天不定時束縛3小時,于束縛第7天,釆用60Co-γ放射源全身輻照1次,劑量為3.5 Gy,劑量率為191.55 cGy/min,輻照距離4 m。輻照后,各組大鼠繼續(xù)單籠飼養(yǎng),模型組每天不定時束縛3小時,連續(xù)14天[7]。
1.6放射免疫法檢測cGMP含量
于造模結(jié)束后第2天,動物斷頭取海馬組織,勻漿后加入2 mL無水乙醇離心,取上清;用75%乙醇洗沉淀,勻漿后再離心;去上清,于60℃烤箱烘干備用。按試劑盒操作,測定大鼠海馬組織中cGMP含量。以全自動放射免疫-γ-計數(shù)器測定沉淀組織中每分鐘的放射性脈沖數(shù),并采用Log-Logic數(shù)學(xué)模型擬合標準曲線,由計算機讀出測定值。
1.7免疫組化法測定芍藥苷對血虛肝郁證大鼠sGCβ1及5種PDE亞型蛋白表達的影響
于造模結(jié)束后第2天,各組取7只大鼠,用生理鹽水和多聚甲醛進行心臟灌流固定;取大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定24小時后,石蠟包埋切片。經(jīng)常規(guī)脫蠟處理后,置于3%H2O210分鐘滅活內(nèi)源性酶,浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)10分鐘;滴加5% BSA封閉液,37℃滴加一抗,4℃過夜,滴加聚合HRP標記抗兔IgG(SV-0002)。以上各步之間除5%BSA封閉液外均用0.1 mol/L PBS洗3次,每次3分鐘。使用DAB顯色試劑盒室溫顯色,蒸餾水充分洗滌,蘇木精復(fù)染;脫水封片。用Nikon 4500數(shù)碼相機和Nikon E200型顯微鏡組合拍攝圖像,Image pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。每組隨機測試5張切片,每張切片測試一個視野,測定光密度(intergralopt density,IOD)。
1.8統(tǒng)計學(xué)處理
2結(jié)果
經(jīng)過21天的復(fù)合造模,模型組大鼠大腦中第二信使發(fā)生了較大改變。與空白組相比,海馬組織cGMP含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,給予高劑量芍藥苷能降低cGMP含量,差異顯著(P<0.01)。見表1。
2.2芍藥苷對海馬CA1區(qū)sGCβ1及5種PDE亞型蛋白表達的影響
經(jīng)過21天的復(fù)合造模,模型組大鼠海馬中cGMP合成酶與水解酶都發(fā)生了變化,其中sGCβ1蛋白表達較空白組有所升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與空白組相比,PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A蛋白表達顯著升高(P<0.05),PDE10A蛋白表達顯著降低(P<0.05)。
表1 各組大鼠海馬組織cGMP的含量
注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01。
與模型組相比,給予低劑量芍藥苷有降低sGCβ1和PDE1A蛋白表達的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異;并能顯著降低PDE2A、PDE5A、PDE9A蛋白的表達(P<0.05),升高PDE10A蛋白的表達(P<0.05)。
與模型組相比,給予高劑量芍藥苷可以降低sGCβ1蛋白的表達,并能夠降低PDE1A、PDE2A、PDE5A、PDE9A蛋白表達(P<0.05),升高PDE10A蛋白的表達(P<0.05)。見表2,圖1~6。
表2 各組大鼠海馬組織sGCβ1、PDE1A、 PDE2A、PDE5A、PDE9A、PDE10A積分光密度
注: 與空白組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。
A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組
圖1各組大鼠海馬 CA1 區(qū) sGCβ1表達的影響(IHC ×200)
A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組
圖2各組大鼠海馬 CA1 區(qū) PDE1表達的影響(IHC ×200)
A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組
圖3各組大鼠海馬 CA1 區(qū) PDE2表達的影響(IHC ×200)
A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組
圖4各組大鼠海馬 CA1 區(qū) PDE5表達的影響(IHC ×200)
A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組
圖5各組大鼠海馬 CA1 區(qū) PDE9表達的影響(IHC ×200)
A空白組B模型組C芍藥苷低劑量組D芍藥苷高劑量組
圖6各組大鼠海馬 CA1 區(qū) PDE10表達的影響(IHC ×200)
3討論
血虛肝郁證常見于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的慢性心理應(yīng)激引起的多種疾病[8]。而“肝主疏泄”和“肝主藏血”的功能可維持和促進全身氣血的正常運行,調(diào)適各臟器對應(yīng)激的反應(yīng)。由于肝體陰而用陽,喜柔而惡剛,所以治療當(dāng)養(yǎng)血柔肝,以柔制剛,順應(yīng)肝的條達之性[9]。因此,養(yǎng)血柔肝也是中醫(yī)抗慢性應(yīng)激常采用的治療法則。輻照結(jié)合束縛應(yīng)激建立的血虛肝郁證候模型,形成了強烈的刺激,使得模型大鼠處于持續(xù)應(yīng)激狀態(tài),必將導(dǎo)致大腦功能結(jié)構(gòu)的異常。
慢性應(yīng)激中信號通路失調(diào),抗應(yīng)激作用與腦中功能異常的NO/cGMP信號通路的正常化有關(guān)[10]。而cGMP作為新的信使分子,通過激活下游效應(yīng)分子cGMP依賴性蛋白激酶、環(huán)核苷酸門控離子通道和磷酸二酯酶的合成來發(fā)揮多種生物效應(yīng),影響絲氨酸/蘇氨酸磷酸化[11],影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12],以及細胞內(nèi)Ca2+濃度,介導(dǎo)細胞效應(yīng)[13]。前期研究結(jié)果表明[3],芍藥苷可以對抗應(yīng)激產(chǎn)生的海馬區(qū)谷氨酸(glutamic acid,Glu)和NO含量的升高,從而下調(diào)NO/cGMP信號通路,本實驗通過測定海馬組織cGMP含量,也驗證了芍藥苷對cGMP水平的下調(diào)作用。
現(xiàn)代研究表明,sGC作為NO的受體及cGMP合成酶,sGC的活化、失活以及脫敏對于NO信號通路非常重要[14]。NO與sGC結(jié)合后會激活sGC的催化活性, 即催化GTP轉(zhuǎn)化為cGMP。因此,以sGC為靶標的疾病治療手段可以消除過多NO細胞毒性及NO耐受性的缺陷[15],sGC抑制劑ODQ可下調(diào)NO/cGMP通路,增強4 mg/kg(亞有效劑量)芍藥苷的作用[16]。本實驗結(jié)果表明,芍藥苷能顯著減少sGCβ1的蛋白表達,說明芍藥苷能通過發(fā)揮sGC抑制劑樣作用,直接影響合成酶活性,導(dǎo)致cGMP生成減少。而由于cGMP參與調(diào)解抑郁焦慮與學(xué)習(xí)障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,它的含量是由合成酶和水解酶共同調(diào)控的,磷酸二酯酶PDE5、PDE9特異性水解cGMP, PDE1、PDE2、PDE10能同時水解環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和cGMP[17]。研究表明,PDE5和PDE9的抑制劑被認為是改善記憶和增加神經(jīng)發(fā)生的候選藥,并且二者表達和活性的增強影響cGMP濃度的下降[18-19]。而PDE1和PDE2作為雙重底物酶,對cGMP和cAMP含量的影響并不一致;PDE2抑制劑可以選擇性提高興奮性突觸cGMP水平,并提高突出可塑性和記憶功能[20]。本實驗結(jié)果顯示,給予芍藥苷后能顯著下調(diào)PDE5、PDE9的表達,降低PDE1和PDE2的表達,升高PDE10的表達。另一方面,由于PDE2抑制劑具有增加NO活性、反饋調(diào)節(jié)NO/cGMP通路、增加cGMP含量的作用[21],而芍藥苷所引起的PDE10的上調(diào)又對抗了由于PDE抑制劑樣作用反饋引起的cGMP的合成,所以推測芍藥苷是通過作用于多個靶點,相互影響,從而發(fā)揮最終的調(diào)節(jié)效應(yīng)。
綜上,芍藥苷對于血虛肝郁證的干預(yù)作用可能是參與了NO/cGMP通路中影響cGMP含量的多個環(huán)節(jié),不僅通過降低sGC含量進一步下調(diào)NO,還對PDE不同亞型存在雙向調(diào)節(jié)的功能,綜合抵抗機體應(yīng)激引起的cGMP的升高,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。芍藥苷針對sGC和PDE10等高效靶標的調(diào)控作用,有可能就是揭示白芍養(yǎng)血柔肝解郁的作用特點和優(yōu)勢的重要環(huán)節(jié)。但是,作為共同參與情志調(diào)節(jié),影響神經(jīng)細胞興奮性的cAMP,也能被PDE水解,芍藥苷對PDE不同亞型的影響是否同時參與了cAMP含量的調(diào)節(jié),cAMP與cGMP是否存在動態(tài)平衡,兩條通路間是否存在共同的高效靶點,還需要進一步深入的研究。
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(本文編輯: 韓虹娟)
Effects of paeoniflorin on the expression of SGCβ1, different subtypes of PDE in the hippocampus CA1 Zone of rats with blood deficiency and liver depression syndrome
WANGJing-xia,ZHOUTian-tian,ZHUYing-li,etal.
SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,ChinaCorrespondingauthor:ZHANGJian-jun,E-mail:zhangjianjun@bucm.edu.cn
【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of paeoniflorin on the content of cGMP and the protein expressions of cGMP synthase namely SGCβ1 and hydrolases PDE1A, PDE2A, PDE5A, PDE9A, PDE10A in the hippocampus CA1 zone of rats with blood deficiency and liver depression syndrome. MethodsThe rat model was established by chronic restraint stress combined with irradiation. From the 1st day of modeling, the normal and model group was treated with same amount of distill water, the treatment group were given corresponding medicines. On the 21th day of modeling, the brain tissue and hippocampus were removed. The content of cGMP was detected by RIA. IHC was used to observe the protein expressions of sGCβ1, PDE1A, PDE2A, PDE5A, PDE9A and PDE10A. ResultsCompared with the model group, the content of cGMP in the dose of 40mg/kg Paeoniflorin was reduced (P<0.01) and the protein expressions of PDE1, PDE2A, PDE5A, PDE9A were reduced (P<0.05), and the protein expressions of PDE10A were increased significantly (P<0.05). ConclusionsPaeoniflorin could play a role of dual-directional regulation effects on the activities of different subtypes of hydrolases, which give play to synergistic effect with the inhibition of synthase, and comprehensively reduce the content of cGMP to relieve the brain damage of the blood deficiency and liver depression syndrome.
【Key words】Blood deficiency and liver depression syndrome;Paeoniflorin;Cyclic guanosinc monophosphate;Phosphodiesterase;Soluble guanylyl cyclase β1
基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目(81173569)
作者簡介:王景霞(1976- ),女,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師。研究方向:中藥藥性基本理論。E-mail: wjx117@sohu.com 通訊作者: 張建軍(1965- ),博士,研究員,博士生導(dǎo)師。研究方向:基于中藥基本理論的藥效機理及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: zhangjianjun@bucm.edu.cn
【中圖分類號】R285.5
【文獻標識碼】A
doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.004
(收稿日期:2015-10-21)