張鵬 陳弘林 伍子賢 余思瑤 招文華 尚奇 何嘉輝 陳桂鋒 余富勇 梁德 江曉兵 任輝* 余翔,4*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510260

4.廣東省中醫(yī)臨床研究院,廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OF)作為骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥,其發(fā)病率逐年升高,預(yù)計(jì)2035年我國(guó)髖部、椎體以及腕部OF約有483萬(wàn)例,至2050年將達(dá)599萬(wàn)例[1]。臨床多使用骨吸收抑制劑來(lái)治療OF,但這些藥物的臨床運(yùn)用由于其使用過(guò)程中存在的并發(fā)癥而受到限制[2]。近年來(lái),中醫(yī)藥在治療OF上展現(xiàn)出良好的療效,國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者也逐漸開(kāi)始關(guān)注這一領(lǐng)域[3-4]。

龜板(plastrum testudinis,PT)具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效,近年來(lái)對(duì)龜板抗OF的研究越來(lái)越多,但多集中在PT促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化方面,研究表明龜板提取物及含藥血清對(duì)大鼠BMSCs有促增殖作用,在臨床上有較好的實(shí)際運(yùn)用和發(fā)展前景[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從多分子、多靶點(diǎn)、多途徑的角度闡述藥物干預(yù)疾病的治療原理[6]。因此,本文擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討PT治療OF的潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 龜板化合物及靶點(diǎn)信息的獲取

借助BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)尋找龜板的相關(guān)活性物質(zhì)及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),將閥值“Score cutoff”設(shè)置為10[7]。

1.2 骨質(zhì)疏松性骨折靶點(diǎn)集及龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點(diǎn)獲取

在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到OF靶點(diǎn)集,并借助R軟件將其與1.1中得到的靶點(diǎn)交集映射獲取兩者的交集靶點(diǎn)。

1.3 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/),去除孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息,并將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

組建“龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折”四者之間的對(duì)應(yīng)信息,將其導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.5 GO生物過(guò)程富集分析

交集靶點(diǎn)的GO生物過(guò)程(biological process,BP)富集分析通過(guò)R軟件完成,以點(diǎn)狀圖的形式展示顯著性排在前20的富集條目。此外,將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中進(jìn)行GO.BP富集分析,篩選出主要與OF相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程(P<0.05),可視化展示上述生物學(xué)過(guò)程及其對(duì)應(yīng)的交集靶點(diǎn)。

1.6 KEGG通路富集分析

同樣利用R軟件對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析,將富集得到的信號(hào)通路(P<0.05)按照顯著性進(jìn)行排序展示,并構(gòu)建“通路-靶標(biāo)”之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示[8]。

1.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雌性SD大鼠30只,購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.TCMF1-2021068)。

1.7.2實(shí)驗(yàn)試劑:重組人RANKL(6449-TEC)購(gòu)于美國(guó)R&D Systems公司,重組人M-CSF(11792-H08Y)購(gòu)于北京義翹神州科技股份有限公司,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,胎牛血清(FBS)、α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)于賽業(yè)生物科技有限公司,CCK8試劑購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,龜板購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(批號(hào):KG37243537)。

1.7.3龜板水提液的制備:參照本課題組前期研究基礎(chǔ)[9]。100 g龜板粉碎后,加1 L純水,微沸1 h,獲得提取液,剩余藥渣重復(fù)操作微沸2次后獲得提取液。所有提取液0.22 μm過(guò)濾除菌,分裝并密封后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.7.4OF大鼠模型的構(gòu)建及龜板的干預(yù):將30只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、OF組和OF+PT組,每組10只。其中假手術(shù)組僅予術(shù)口切開(kāi),生理鹽水灌胃;根據(jù)既往報(bào)道的方法[10],OF組大鼠去除雙側(cè)卵巢3個(gè)月后,于L6椎體側(cè)造一直徑為3 mm、深度為3 mm的圓形骨缺損,以模擬骨質(zhì)疏松性椎體骨折后局部骨缺損狀態(tài);OF+PT組予構(gòu)建大鼠L6椎體OF模型,龜板水提液灌胃,灌胃濃度按照人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值換算為:3.15 g/(kg·d)。造模成功后,灌胃治療4周后處死各組大鼠并取材,取L6傷椎行micro-CT、HE染色評(píng)估OF模型大鼠骨缺損愈合的情況。

1.7.5實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng):所有臨床實(shí)驗(yàn)均通過(guò)本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(No.K[2019]129)。在本研究中,從確診為OF[11-12]的男性患者(n=3)中取外周靜脈血10 mL,均經(jīng)患者知情同意。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13],從血液樣本中提取人外周血單核細(xì)胞(human peripheral blood monocytes,HPBMs)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.7.6CCK8法檢測(cè)龜板對(duì)HPBMs活性的影響:取HPBMs以1×104/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后分為對(duì)照組和龜板干預(yù)組,對(duì)照組加入含25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基,龜板干預(yù)組加入含不同濃度梯度的龜板水提液和25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基,共設(shè)置5、10、20、30 μg/mL 4個(gè)濃度梯度,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),分別于給藥后0、1、3、5、7 d取出1塊培養(yǎng)板,檢測(cè)HPBMs的吸光度值(OD 450 nm)。

1.7.7TRAP染色鑒定龜板對(duì)HPBMs破骨分化的影響:取HPBMs以2×105個(gè)/cm2的密度接種于24孔板中,選取CCK8法檢測(cè)得到對(duì)HPBMs無(wú)細(xì)胞毒性的龜板水提液濃度進(jìn)行干預(yù),即用含25 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL及不同濃度龜板水提液的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天換液。干預(yù)10 d后進(jìn)行TRAP染色,將具有3個(gè)以上細(xì)胞核,且細(xì)胞質(zhì)染成酒紅色的細(xì)胞定義為T(mén)RAP染色陽(yáng)性(TRAP+)的成熟破骨細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 龜板成分及作用靶點(diǎn)信息

通過(guò)BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索去重后得到龜板6個(gè)活性成分,包括苯丙氨酸(Phenylalanine)、甲硫氨酸(Methionine)、蘇氨酸(Threonine)、碳酸鈣(Calcium Carbonate)、亮氨酸(Leucine)、天冬氨酸(Aspartic Acid),以及342個(gè)作用靶標(biāo)。

2.2 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點(diǎn)獲取

共獲得OF相關(guān)靶點(diǎn)840個(gè),與 342個(gè)PT靶點(diǎn)交集映射得到34個(gè)交集靶點(diǎn)。交集靶點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

表1 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點(diǎn)基因

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

交集靶點(diǎn)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共涉及32個(gè)節(jié)點(diǎn),126條邊。該網(wǎng)絡(luò)中有17個(gè)靶點(diǎn)蛋白的度值超過(guò)平均值(7.875),視其為核心靶點(diǎn),詳見(jiàn)表2。龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)圖由42個(gè)節(jié)點(diǎn)和79條邊組成,線條代表龜板、活性成分、作用靶點(diǎn)和骨質(zhì)疏松性骨折之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析提示度值排名前3位的核心活性成分為苯丙氨酸(Phenylalanine,度值=21)、甲硫氨酸(Methionine,度值=9)、蘇氨酸(Threonine,度值=4)。

表2 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的核心靶點(diǎn)

2.4 GO.BP富集分析

GO.BP富集分析共獲得802個(gè)結(jié)果,主要涉及破骨分化的調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、NF-κB信號(hào)的正向調(diào)控、雌激素反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控等。此外,利用Cytoscape 3.7.2進(jìn)行交集靶點(diǎn)的GO.BP富集分析并篩選與OF密切相關(guān)的結(jié)果,主要涉及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激素代謝及細(xì)胞周期等生物過(guò)程。

2.5 KEGG分析

使用R軟件對(duì)34個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG分析,共得到67個(gè)結(jié)果,主要涉及與破骨分化、炎癥反應(yīng)、激素代謝密切相關(guān)的通路。篩選得到相關(guān)信號(hào)通路共有22條,詳見(jiàn)表3。

表3 富集的信號(hào)通路

2.6 Micro-CT及HE染色檢測(cè)龜板對(duì)OF模型大鼠骨缺損愈合的影響

如圖1所示,micro-CT結(jié)果提示龜板可有效治療大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折骨缺損,HE染色結(jié)果顯示龜板干預(yù)4周后可有更多骨形成,促進(jìn)OF大鼠椎體骨折骨缺損愈合。

圖1 龜板干預(yù)4周后micro-CT和HE染色結(jié)果

2.7 CCK8檢測(cè)龜板對(duì)HPBMs增殖的影響

通過(guò)CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),龜板水提液濃度在不超過(guò)10 μg/mL的情況下對(duì)HPBMs無(wú)細(xì)胞毒性,見(jiàn)圖2。

圖2 CCK8 檢測(cè)結(jié)果

2.8 TRAP染色鑒定龜板對(duì)HPBMs破骨分化的影響

在不影響HPBMs增殖的相應(yīng)濃度龜板水提液干預(yù)下,發(fā)現(xiàn)隨著龜板水提液濃度的增加,成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(圖3),差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1),這證明龜板能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的HPBMs破骨分化。

圖3 TRAP染色分析及量化

3 討論

3.1 活性成分、靶標(biāo)與PPI網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)對(duì)龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)龜板6個(gè)活性成分分別調(diào)控34個(gè)靶點(diǎn)影響其對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的治療機(jī)制。如血漿苯丙氨酸(Phenylalanine)濃度升高可能會(huì)對(duì)骨骼狀況有不利影響,降低骨強(qiáng)度,增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)[14]。蘇氨酸(Threonine)是AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的蛋白底物,活化的AKT磷酸化蘇氨酸等多種底物參與調(diào)節(jié)成骨、破骨細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的PI3K/AKT通路,影響成骨、破骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡,進(jìn)而影響骨密度[15]。碳酸鈣等礦物元素是機(jī)體骨代謝平衡的重要底物,可增加骨鈣含量和骨密度,對(duì)OF有較好的防治作用[16]。

經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選后得到度值位列前三的作用靶點(diǎn)為FOS、TNF、BDNF,推測(cè)它們可能在龜板治療OF過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。FOS是c-fos基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的蛋白,在調(diào)控細(xì)胞分裂、增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[17]。FOS與破骨細(xì)胞關(guān)系密切,FOS表達(dá)受抑制時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量隨之減少[18]。此外,FOS可通過(guò)影響RANKL-RANK介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成信號(hào)傳導(dǎo)途徑,抑制破骨細(xì)胞生成[19]。因此,FOS對(duì)調(diào)節(jié)骨折愈合骨形成和骨吸收起著重要作用[20]。TNF與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),可誘導(dǎo)M-CSF的表達(dá),NF-κB因子可被其激活進(jìn)而啟動(dòng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成過(guò)程,增強(qiáng)骨吸收[21]。BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)與骨的發(fā)育有著密切的聯(lián)系,BDNF能促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化[22]。另外,BDNF和IGF-1具有協(xié)同作用,它們共同調(diào)節(jié)ERK/p38 MAPK通路活性,促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和分化[23]。同時(shí),有研究顯示BDNF基因可能通過(guò)MAPK通路調(diào)控成骨分化[24]。

3.2 GO和KEGG分析

GO分析結(jié)果所反映的內(nèi)容類似于PPI網(wǎng)絡(luò)規(guī)律,多涉及炎癥反應(yīng)、激素代謝和細(xì)胞周期(如破骨細(xì)胞分化)的調(diào)節(jié)。而KEGG分析結(jié)果反映的內(nèi)容也印證了PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析及GO分析結(jié)果所展現(xiàn)的規(guī)律。例如,TNF信號(hào)通路的相關(guān)研究表明,炎性因子TNF-α可促進(jìn)RANKL表達(dá),誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[21]。MAPK信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)骨保護(hù)素(OPG)表達(dá)[25],進(jìn)而與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL,最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞的凋亡[26];Estrogen(雌激素)信號(hào)通路可以協(xié)同Wnt等多條信號(hào)通路共同調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[27]。

3.3 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析

近年來(lái)對(duì)龜板抗OF的研究越來(lái)越多,針對(duì)其起效機(jī)制的研究也主要集中于促進(jìn)BMSCs成骨分化方面[5],對(duì)于龜板影響破骨分化的機(jī)制鮮有報(bào)道。而本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)破骨分化的調(diào)節(jié)可能是龜板抗骨質(zhì)疏松性骨折的重要機(jī)制。為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的可靠性,本研究開(kāi)展了動(dòng)物實(shí)驗(yàn),證實(shí)龜板可有效治療OF模型大鼠的骨缺損,并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)首次探究了龜板干預(yù)下的OF患者HPBMs表型,發(fā)現(xiàn)龜板能顯著抑制HPBMs破骨分化。

綜上所述,本研究結(jié)果提示龜板可能通過(guò)多種化合物、靶點(diǎn)和通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激素代謝及細(xì)胞周期來(lái)治療OF,其中抑制破骨分化可能是龜板抗OF的重要機(jī)制。