萬(wàn)傳科,王曉霞,張彥青,李守霞,閆建軍,王志剛

(1.邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北 邯鄲 056000;2.邯鄲市中心醫(yī)院中醫(yī)科,河北 邯鄲 056000)

食管癌在組織病理學(xué)上主要分為腺癌和鱗狀細(xì)胞癌兩種類型[1-2]。食管腺癌在西方國(guó)家迅速增長(zhǎng),但我國(guó)大多數(shù)患者被診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌[3-4]。目前的外科手術(shù)和藥物治療很少能有效治療晚期食管癌,故患者5年生存率極低[5]。食管癌通常對(duì)化學(xué)治療藥物不敏感,且不良反應(yīng)較多。植物來(lái)源的天然產(chǎn)物在癌癥治療研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用,如長(zhǎng)春新堿、紫杉醇和喜樹堿衍生物等,是目前許多抗癌藥物的來(lái)源[6]。作為一種從陳皮中分離出來(lái)的多甲氧基黃酮類化合物,川陳皮素可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生和發(fā)展[7]。川陳皮素對(duì)癌細(xì)胞(如結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等)的增殖均有較好的抑制作用[8],但對(duì)食管癌細(xì)胞作用的研究較少。研究[9-10]表明,Ras同源基因家族成員A(Ras homologous gene family member A,RhoA)/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(Rho associated curly helix protein kinase,ROCK)是與細(xì)胞形態(tài)維持、平滑肌收縮相關(guān)的信號(hào)通路。ROCK有ROCK1和ROCK2兩種亞型,均為RhoA下游效應(yīng)器,在細(xì)胞增殖、凋亡和分裂中發(fā)揮重要作用[11]。本研究擬基于RhoA/ROCK信號(hào)通路探究川陳皮素對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞存活、凋亡和侵襲的影響,為川陳皮素的應(yīng)用和食管癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人食管癌KYSE150細(xì)胞(批號(hào):KH40219)購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 川陳皮素(批號(hào):HA18202,原料藥,純度≥98.5%)、順鉑(批號(hào):HA19245,原料藥,純度≥99.15%)購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)公司;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、TRIzol試劑、PCR試劑盒、BCA試劑盒(批號(hào):YM10585、YM25440、YM48450、YM28500、YM21540)購(gòu)自廣州益滿生物科技公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、結(jié)晶紫染液、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白裂解液、ECL試劑(批號(hào):DS34788、DS12628、DS23551、DS33701、DS15210、DS41175)購(gòu)自廣州東盛生物科技公司;兔源RhoA、ROCK1、ROCK2、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批號(hào):AT11589、AT24900、AT25480、AT35819、AT42881)購(gòu)自深圳安提生物科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞。每24 h更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液,選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE150細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 分組與處理:將KYSE150細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種于96孔板中(200 μl/孔),分為對(duì)照組、順鉑組、川陳皮素低、中、高濃度組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞。順鉑組在含KYSE150細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入0.5 μg/ml順鉑[12]。川陳皮素低、中、高濃度組在含KYSE150細(xì)胞的培養(yǎng)基中分別加入10、20、40 μg/ml川陳皮素[13]。上述各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3.3 KYSE150細(xì)胞存活率檢測(cè):將各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種在96孔板中,培養(yǎng)48 h后加入MTT,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心棄上清,加入二甲基亞砜200 μl/孔,振蕩10 min。酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度(OD),計(jì)算各組KYSE150細(xì)胞的存活率。KYSE150細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD490/對(duì)照組OD490×100%。

1.3.4 KYSE150細(xì)胞侵襲能力檢測(cè):在Transwell小室的上室中添加基質(zhì)膠,常溫下固化4 h。在上室中添加1×105個(gè)KYSE150細(xì)胞,下室中添加RPMI1640培養(yǎng)基。孵育48 h后,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察并拍照(隨機(jī)選6個(gè)視野),計(jì)算KYSE150細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.3.5 KYSE150細(xì)胞凋亡率檢測(cè):將各組KYSE150細(xì)胞重懸為1×104個(gè)/ml,加入Annexin V-FITC和PI,避光孵育25 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)KYSE150細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)檢測(cè):使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,引物由江西瑞威爾生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)條件:96 ℃預(yù)變性4 min;96 ℃變性16 s,68 ℃退火19 s,73 ℃延伸27 s,共33個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法分析RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列

1.3.7 KYSE150細(xì)胞中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)檢測(cè):將各組細(xì)胞用蛋白裂解液裂解,BCA試劑盒定量總蛋白。電泳分離各組中等量蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,加入兔源RhoA(1∶570稀釋)、ROCK1(1∶660稀釋)、ROCK2(1∶800稀釋)、GAPDH(1∶1250稀釋)一抗,4 ℃下孵育過(guò)夜。加入羊抗兔二抗(1∶2450稀釋),室溫下孵育1 h,加入ECL試劑顯色。蛋白條帶灰度值采用Image J軟件分析,然后計(jì)算RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白相對(duì)表達(dá)量(以GAPDH為內(nèi)參)。

2 結(jié) 果

2.1 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞存活率及侵襲能力的影響 見表2(圖1)。與對(duì)照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞存活率和侵襲數(shù)目降低(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細(xì)胞存活率和侵襲數(shù)目升高(均P<0.05)。而川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細(xì)胞存活率和侵襲數(shù)目比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞存活率和侵襲數(shù)目依次降低(均P<0.05)。

圖1 各組KYSE150細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果(×200)

表2 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞存活率及侵襲能力的影響

2.2 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞凋亡率的影響 見圖2。對(duì)照組、順鉑組以及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞凋亡率分別為(6.48±1.16)%、(27.69±5.05)%、(12.65±2.61)%、(18.16±2.75)%、(27.35±4.54)%。與對(duì)照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞凋亡率升高(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細(xì)胞凋亡率降低(均P<0.05)。而川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。

圖2 各組KYSE150細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.3 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)的影響 見表3。與對(duì)照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)水平降低(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)水平升高(均P<0.05)。川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。

表3 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)的影響

2.4 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響 見表4。與對(duì)照組比較,順鉑組及川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。與順鉑組比較,川陳皮素低、中濃度組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)。川陳皮素高濃度組與順鉑組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。川陳皮素低、中、高濃度組KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。

表4 川陳皮素對(duì)KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

食管癌是食管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,受遺傳、吸煙及不良飲食習(xí)慣等因素影響。食管癌可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)飲食吞咽困難,引發(fā)一系列并發(fā)癥,甚至死亡[14]。食管癌病死率較高,發(fā)病隱匿,許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于疾病晚期,化療常常成為主要治療措施[15]。同時(shí),由于合成的抗腫瘤藥物對(duì)本病的治療效果較差,許多食管癌患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤耐藥以及腫瘤復(fù)發(fā),因此越來(lái)越多學(xué)者轉(zhuǎn)向天然抗癌活性藥物的研究[16-17]。

川陳皮素具有抗癌、抗血栓、抗炎等方面的作用,在多種腫瘤的治療中具有重要的輔助作用。YOU等[18]報(bào)道,川陳皮素能夠通過(guò)抑制糖原合成酶激酶-3β來(lái)抑制膽管癌的增殖和集落形成。ZHANG等[19]研究表明,川陳皮素能夠降低線粒體膜電位,顯著減弱卵巢癌細(xì)胞增殖活性,促進(jìn)凋亡。SOUSA等[20]發(fā)現(xiàn),川陳皮素能夠單獨(dú)或和順鉑聯(lián)合使用降低間變性甲狀腺癌細(xì)胞的活力,同時(shí)對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞的毒性較小。WANG等[21]研究發(fā)現(xiàn),川陳皮素可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞焦亡,從而抑制乳腺癌腫瘤進(jìn)展,有望成為治療乳腺癌的新藥物。本研究使用川陳皮素處理食管癌KYSE150細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低、中及高濃度川陳皮素處理后的KYSE150細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)目較對(duì)照組顯著降低,凋亡率顯著升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性,與上述報(bào)道結(jié)果一致[18-21]。表明川陳皮素能夠抑制KYSE150細(xì)胞的存活和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,影響KYSE150細(xì)胞生物學(xué)行為。

作為與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切的通路,RhoA/ROCK可影響癌細(xì)胞生物學(xué)行為[22-23]。研究[24]發(fā)現(xiàn),實(shí)肌球蛋白磷酸酶靶亞基1能夠通過(guò)降低RhoA/ROCK信號(hào)通路活性,使得結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低。李登輝等[25]研究表明,激活RhoA/ROCK信號(hào)通路能夠促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。LI等[26]報(bào)道,降低RhoA/ROCK通路活性能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。有研究[27]報(bào)道,RhoA/ ROCK信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致卵巢癌患者不良預(yù)后的發(fā)生,而沉默RhoA/ ROCK信號(hào)通路會(huì)減弱卵巢癌細(xì)胞活性,阻礙卵巢癌的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn),低、中及高濃度川陳皮素處理后的食管癌KYSE150細(xì)胞RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低,且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)合唐軍偉等[24]、LI等[26]和WEI等[27]的研究,我們認(rèn)為川陳皮素抑制KYSE150細(xì)胞的存活和侵襲,促進(jìn)其凋亡的機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路的激活有關(guān)?？赡茉?yàn)榇惼に馗深A(yù)后導(dǎo)致RhoA/ROCK通路活性降低,進(jìn)而影響KYSE150細(xì)胞生物學(xué)行為,抑制其惡性進(jìn)展。

綜上所述,川陳皮素能抑制KYSE150細(xì)胞存活和侵襲,促進(jìn)凋亡,其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。本研究不足之處,在于僅探究了川陳皮素通過(guò)RhoA/ROCK通路對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用,川陳皮素能否通過(guò)其他信號(hào)通路抑制KYSE150細(xì)胞的存活和侵襲,促進(jìn)凋亡,有待進(jìn)一步研究。