王忠瑜,季艷霞,趙艷爭(zhēng),張偉光,楊慧敏

(邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056008)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)全球病死率和發(fā)病率分別位居惡性腫瘤的第二位和第三位[1-2]。我國(guó)CRC病死率和發(fā)病率在惡性腫瘤中均位居第五位,且發(fā)病率逐年上升[3-5]。近年來(lái),CRC的診治取得了很大進(jìn)展,但CRC患者預(yù)后仍不理想。發(fā)達(dá)國(guó)家患者5年生存率約65%,欠發(fā)達(dá)國(guó)家5年生存率不足50%[6-8]。因此,尋找可以預(yù)測(cè)CRC患病風(fēng)險(xiǎn)、癌癥進(jìn)展及預(yù)后的生物標(biāo)志物對(duì)于CRC早期診斷、病情進(jìn)展監(jiān)測(cè)及治療方案調(diào)整具有非常重要的意義。環(huán)狀RNA是一類普遍存在于哺乳動(dòng)物中的具有穩(wěn)定閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄、沉默微小RNA(microRNA,miR)或直接與蛋白結(jié)合等方式來(lái)廣泛參與多種生理及病理活動(dòng)[9-11]。環(huán)狀RNA ciRS-7因靶向結(jié)合miR-7而得名,通過與miR-7競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合上調(diào)miR-7靶基因,如血管表皮生長(zhǎng)因子受體和G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白E1,從而廣泛參與多種癌癥的病理活動(dòng)。已證實(shí)ciRS-7在食管癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌等患者中高表達(dá)且與患者預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)[12-15]。然而,ciRS-7在CRC發(fā)生和發(fā)展中的作用鮮有研究報(bào)道。因此,本研究探討ciRS-7在CRC患者中的表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究前瞻性納入2019年1月至2020年12月接受手術(shù)治療的CRC患者120例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性CRC;年齡≥18周歲;無(wú)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移;接受定期隨訪;患者及家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):接受新輔助治療;合并其他惡性腫瘤;孕婦或哺乳期婦女。入組患者中,男性66例,女性54例;平均年齡(66.04±11.87)歲;高分化18例,中分化84例,低分化18例;腫瘤直徑5.02[3.96,5.53] cm;T1期6例,T2期17例,T3期95例,T4期2例;N0期71例,N1期32例,N2期17例;TNM Ⅰ期18例,Ⅱ期52例,Ⅲ期50例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)組織ciRS-7表達(dá):通過手術(shù)獲取患者癌組織和癌旁組織,液氮急凍后于-80 ℃保存。取凍存的組織樣本在研缽中加液氮充分研磨,加入TRIzol 試劑依據(jù)說明書提取總RNA。使用Nanodrop檢測(cè)濃度和純度,RNase R消化線性RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):RR047A,中國(guó)大連寶生物工程有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min、98 ℃ 5 min。隨后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(批號(hào):RR003A,中國(guó)大連寶生物工程有限公司)和ABI 7900熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法分析患者癌組織和癌旁組織中ciRS-7相對(duì)表達(dá)量。ciRS-7正向引物序列為5’-CTTGACACAGGTGCCATC-3’,反向引物序列為5’-ACGTCTC-CAGTGTGCTGA-3’。GAPDH正向引物序列為5’-TGACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,反向引物序列為5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’。

1.2.2 隨訪:所有患者隨訪至2022年11月30日,中位隨訪時(shí)間30.5個(gè)月?？傮w生存期(OS)定義為患者從開始手術(shù)治療到最終病死的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M[P25,P75]表示,癌和癌旁組織ciRS-7相對(duì)表達(dá)量比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn);ciRS-7與患者臨床病理特征的關(guān)系采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn);繪制Kaplan-Meier曲線并采用Log-Rank檢驗(yàn)分析ciRS-7高低表達(dá)水平與患者OS的關(guān)系;采用Cox回歸分析CRC患者OS的影響因素;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織ciRS-7表達(dá)水平比較 癌組織中ciRS-7表達(dá)水平為2.80[1.78,4.27],癌旁組織中為0.88[0.27,1.52]。癌組織中ciRS-7表達(dá)水平高于癌旁組織(Z=-5.073,P<0.001)。

2.2 ciRS-7表達(dá)水平與患者不同臨床病理特征的關(guān)系 見表1。ciRS-7表達(dá)水平與腫瘤直徑、T分期、N分期、TNM分期有關(guān)(均P<0.001)。

表1 ciRS-7表達(dá)水平與患者不同臨床病理特征比較

2.3 ciRS-7不同表達(dá)水平與患者OS的關(guān)系 見圖1。ciRS-7低表達(dá)患者中位OS為41.0個(gè)月(95%CI:39.0～43.0個(gè)月),ciRS-7高表達(dá)患者中位OS為37.0個(gè)月(95%CI:33.8～40.2個(gè)月)。Kaplan-Meier曲線和Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示,ciRS-7表達(dá)水平與患者OS呈負(fù)相關(guān)(P=0.001)。

圖1 ciRS-7相對(duì)表達(dá)量與患者OS的關(guān)系

2.4 影響患者OS的單因素Cox回歸分析 見表2。以患者OS為因變量(OS>41.0個(gè)月=0,OS≤41.0個(gè)月=1),以ciRS-7表達(dá)(高表達(dá)=1,低表達(dá)=0)、年齡(≥60歲=1,<60歲=0)、性別(男性=1,女性=0)、病理分化等級(jí)(低/中分化=1,高分化=0)、腫瘤直徑(≥5 cm=1,<5 cm=0)、T分期(T3、T4期=1,T1、T2期=0)、N分期(N1、N2期=1,N0期=0)、TNM分期(Ⅲ期=1,Ⅰ-Ⅱ期=0)為自變量行單因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示,ciRS-7表達(dá)水平、病理分化等級(jí)、腫瘤直徑、T分期、N分期、TNM分期與患者OS有關(guān)。

表2 影響患者OS的單因素Cox回歸分析

2.5 影響患者OS的多因素Cox回歸分析 見表3。以單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量(賦值相同),以患者OS為因變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示,ciRS-7高表達(dá)、病理低/中分化、T3和T4分期是患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。

表3 影響患者OS的多因素Cox回歸分析

3 討 論

ciRS-7在多種癌癥中高表達(dá)并通過各種機(jī)制參與癌癥病理過程,加重癌癥進(jìn)展[16-20]。有研究[21]發(fā)現(xiàn),ciRS-7在年齡小于40歲,甲胎蛋白水平高于400 ng/μl或出現(xiàn)微血管侵犯的肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平顯著升高,可以作為出現(xiàn)微血管侵犯的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,表明ciRS-7表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌疾病進(jìn)展顯著正相關(guān);同時(shí),在出現(xiàn)微血管侵犯的肝細(xì)胞癌組織中,ciRS-7表達(dá)水平與miR-7表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)而與miR-7靶基因PIK3CD和p70S6K表達(dá)水平顯著正相關(guān)。ciRS-7也被發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中顯著高表達(dá)且與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)成正比,表明ciRS-7與肺癌疾病進(jìn)展正相關(guān)[13]。在另一個(gè)研究[12]中,ciRS-7在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明ciRS-7可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞(KYSE150細(xì)胞系和Eca9706細(xì)胞系)的轉(zhuǎn)移和侵襲,而加入核因子(NF)-κB拮抗劑BAY 11-7082可以抑制ciRS-7介導(dǎo)的食管癌細(xì)胞侵襲。此外,ciRS-7在乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-453細(xì)胞系)中表達(dá)顯著上調(diào),而下調(diào)ciRS-7表達(dá)則抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。進(jìn)一步研究[22]表明乳腺癌組織中ciRS-7表達(dá)水平和miR-1299表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān),且上調(diào)miR-1299表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。以上研究表明ciRS-7可能通過抑制miR-7功能、NF-κB通路或miR-1299功能來(lái)參與多種癌癥病理活動(dòng)并和癌癥進(jìn)展正相關(guān),然而ciRS-7與CRC的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn),ciRS-7表達(dá)水平在CRC患者癌組織中顯著升高并與患者腫瘤直徑,T分期,N分期和TNM分期有關(guān),提示ciRS-7表達(dá)水平與CRC患者癌癥進(jìn)展有關(guān)。分析可能原因,文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-7可以通過調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等來(lái)誘導(dǎo)包括CRC細(xì)胞在內(nèi)的多種癌細(xì)胞凋亡。而ciRS-7作為miR-7的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)能夠阻斷miR-7的抑癌功能從而促進(jìn)多種癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。因此ciRS-7可能通過抑制miR-7促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。miR-1299能夠通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子通路抑制CRC細(xì)胞的增殖,ciRS-7可能通過抑制CRC細(xì)胞中miR-1299的正常功能從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖進(jìn)而加重CRC癌癥進(jìn)展[23]。ciRS-7還有可能通過其他機(jī)制如和下游mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合或直接和RNA結(jié)合蛋白相互作用從而參與CRC病理過程,然而這一假設(shè)需進(jìn)一步深入研究[24]。

本研究發(fā)現(xiàn),ciRS-7表達(dá)水平與CRC患者OS顯著負(fù)相關(guān),ciRS-7高表達(dá)是患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這與之前已報(bào)道的ciRS-7表達(dá)水平與其他癌癥患者OS相關(guān)的結(jié)果一致。在非小細(xì)胞肺癌患者中,ciRS-7表達(dá)水平與患者OS顯著負(fù)相關(guān),且其可作為患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[12]。在胃癌患者中,ciRS-7高表達(dá)者其OS顯著低于ciRS-7低表達(dá)者,且ciRS-7高表達(dá)是胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[14]。在肝細(xì)胞癌患者中,ciRS-7表達(dá)水平與患者無(wú)病生存期(DFS)負(fù)相關(guān)[20]。在食管癌患者中,ciRS-7高表達(dá)患者其DFS和OS均顯著低于ciRS-7低表達(dá)患者[25]。ciRS-7表達(dá)水平和CRC患者OS顯著負(fù)相關(guān)并可以作為患者更短OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,可能與ciRS-7作為抗癌基因(如miR-7、miR-1299)的ceRNA來(lái)抑制其介導(dǎo)的抑癌作用,從而促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。因此,上調(diào)ciRS-7表達(dá)水平將促進(jìn)癌癥進(jìn)展,縮短患者OS。

綜上所述,ciRS-7在CRC患者中高表達(dá),與癌癥進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān),ciRS-7高表達(dá)是患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究仍存在不足:樣本量較少有可能降低統(tǒng)計(jì)效能;只探討了ciRS-7與CRC患者癌癥進(jìn)展與預(yù)后的關(guān)系,而ciRS-7影響CRC患者癌癥進(jìn)展與預(yù)后的分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。