楊從影,唐莉華,孫龍華,羅 江,黃學(xué)娣

(1.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室,江西 南昌 330002;2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,江西 南昌 330006)

胃癌(gastric cancer,GC)起源于黏膜上皮細(xì)胞,是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,是全球第四大常見(jiàn)癌癥,我國(guó)發(fā)病率位居世界第二[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為,胃癌是素體脾胃虧虛,復(fù)加外感六淫,飲食失調(diào)、情志紊亂等多種因素,導(dǎo)致氣血痰濕毒等多種病理產(chǎn)物夾雜的結(jié)果,歸納為痰氣瘀滯、胃熱傷陰、寒凝氣滯[3];治療多以化痰解毒、健脾益氣、溫中散寒為主,且不良反應(yīng)少,契合胃癌復(fù)雜的病情特點(diǎn)[4-6]。

參芪白石湯(SBD)由黨參、黃芪、白術(shù)、白英、白花蛇舌草等中草藥組成,有健脾利濕、清熱解毒之功效,用于晚期胃癌、正虛邪實(shí)者,可隨癥加減[7]。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和分子對(duì)接的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探討SBD治療胃癌GC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 SBD有效成分及靶點(diǎn)挖掘 通過(guò)查閱文獻(xiàn)[8]可知,SBD由白花蛇舌草、白術(shù)、黃芪、黨參、七葉一枝花、仙鶴草、石見(jiàn)穿、薏仁、白英9味中藥組成,利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái) TCMSP( http: // lsp. nwu. edu. cn / tcmsp. Php)設(shè)置口服生物利用度 ( OB) ≥ 30% 、類藥性 (DL) ≥0.18篩選,并結(jié)合《中藥大辭典》進(jìn)行補(bǔ)充,最后利用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù) Pubchem ( https: // pubchem. ncbi. nlm. nih. gov / ) ,查詢篩選出的化合物結(jié)構(gòu)式,并復(fù)制化合物的 SMILES 表達(dá)式,通過(guò)SIB分子構(gòu)效相似性分析平臺(tái)(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白,然后使用Uniprot(http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)將所得靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 GC差異表達(dá)基因的篩選 從 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索組織來(lái)源為人,同時(shí)含有胃癌組織和正常胃組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集,篩選出 GSE118916探針芯片數(shù)據(jù)集,包含15個(gè)胃癌組織和 15個(gè)正常胃組織樣本基因表達(dá)譜,并利用 R語(yǔ)言的Limma 軟件包對(duì)芯片進(jìn)行基因差異分析,用python軟件繪制火山圖,根據(jù)相關(guān)參數(shù)P.adjust<0.05和差異倍數(shù)logFC>1或<-1作為篩選條件。

1.3 交集靶點(diǎn)獲取及核心基因的篩選 為進(jìn)一步明確藥物作用靶點(diǎn)與GC差異表達(dá)基因之間的關(guān)系,本研究將上述藥物與疾病靶點(diǎn)信息輸入在線Venn分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),繪制韋恩圖,獲得藥物與疾病的交集靶點(diǎn),然后將交集靶點(diǎn)輸入蛋白互作和預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING(https://string-db.org/),生物種類選擇“Homo sapiens”,閾值設(shè)置為“medium confidence”(>0.4),其他參數(shù)選擇默認(rèn)值,得到交集靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。并獲取其tsv格式,將其導(dǎo)入Cytoscape軟件中“Network Analyzer”插件分析網(wǎng)絡(luò)中各靶點(diǎn)的度中心性(DC)、中介中心性(BC)和緊密中心性(CC)3種拓?fù)鋵傩浴?/p>

1.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用蛋白互作和預(yù)測(cè)STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)( https: // string-db.org / ) 構(gòu)建核心靶點(diǎn)的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)即PPI網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape v 3.9.1構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖,并利用“Network Analyzer”插件根據(jù)DC、BC、CC值繪制核心靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO和KEGG功能富集分析 將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入在線分析平臺(tái)Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),以“Homo sapiens”背景,設(shè)置閾值為,P Value Cutoff<0.01、Min Overlap(最小計(jì)數(shù)為3)、Min Enrichment(富集因子)>1.5, 對(duì)核心基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。

1.6 核心基因的數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 通過(guò)THPA(The Human Proterin Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)獲得核心基因的蛋白表達(dá)情況,分析核心基因的蛋白免疫組化結(jié)果。

1.7 核心基因與主要化合物分子對(duì)接 通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載SBD中主要成分的2D結(jié)構(gòu),利用Chem3D21.0將小分子化合物的2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu),在PDB數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.rcsb.org/)中獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)并保存為PDB格式,用Pymol對(duì)蛋白去水及官能團(tuán),并用AutoDock加氫,保存為pdbqt格式作為分子對(duì)接受體,采用Vina1.2.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接,調(diào)整對(duì)接盒子大小到剛好包含蛋白的結(jié)合位點(diǎn),并選取對(duì)接最佳構(gòu)象作為分子對(duì)接結(jié)果,對(duì)結(jié)合能 (affinity) 評(píng)分并進(jìn)行排序,結(jié)合能數(shù)值越低,表明結(jié)合越好,最后使用Pymol軟件對(duì)所得對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 SBD活性成分篩選及靶點(diǎn) 通過(guò)查閱文獻(xiàn)得到SBD由9味中藥組成,在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)篩選條件OB≥30%和 DL≥0.18,共獲得63種有效成分,見(jiàn)表1,通過(guò)SIB分子構(gòu)效相似性分析平臺(tái),去重后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將所得靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行規(guī)范化處理,結(jié)果共獲得930個(gè)有效靶點(diǎn)。

表1 SBD有效成分信息

2.2 GC差異表達(dá)基因獲取 使用 R語(yǔ)言Limma軟件包對(duì)GSE118916探針芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因差異分析,去重后獲得1 933個(gè)GC差異表達(dá)基因,其中上調(diào)759 個(gè),下調(diào)有1 174個(gè),結(jié)果用生信繪制火山圖,如圖1所示。

圖1 GC差異表達(dá)基因火山圖

2.3 交集靶點(diǎn)獲取及核心基因的篩選 將SBD對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與GC差異表達(dá)基因?qū)隫enn分析工具,共獲得交集靶點(diǎn)142個(gè),將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖2,去除未參與相互作用靶點(diǎn),共有133個(gè)節(jié)點(diǎn),534條邊,平均度值8.03,采用DC、BC、CC 3個(gè)參數(shù)來(lái)選擇節(jié)點(diǎn),通過(guò)第一輪篩選閾值DC≥11、BC≥0.368、CC≥0.024,得到25條邊和110個(gè)節(jié)點(diǎn);第二輪篩選閾值為DC≥17、BC≥0.015、CC≥0.447,共10條邊,41個(gè)節(jié)點(diǎn)。核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)信息見(jiàn)表2。

注:A.交集靶點(diǎn)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,線的粗細(xì)表示置信度大小;B.采用DC、BC、CC 3個(gè)參數(shù)來(lái)選擇節(jié)點(diǎn),DC值越高的節(jié)點(diǎn)顏色越鮮艷、越大。

表2 SBD治療GC的核心靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?/p>

2.4 GO和KEGG功能富集分析 在Metascape在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)對(duì)10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過(guò)程富集分析,經(jīng)過(guò)篩選共涉及14個(gè)生物過(guò)程條目,包括平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、對(duì)肽的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、血管相關(guān)平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)等。見(jiàn)表3。

表3 14個(gè)GO生物過(guò)程的聚類條目富集分析結(jié)果

為了進(jìn)一步分析GO條目間的關(guān)系,選取子集豐富的條目,其中相似性為> 0.3的條目由邊連接,選擇P值最好的條目,限定每個(gè)聚類中的條目不超過(guò)15個(gè),總數(shù)不超過(guò)250個(gè),使用Cytoscape對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化,見(jiàn)圖3,其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)GO條目。

注:A.按富集分析結(jié)果集群分類著色,具有相同集群的節(jié)點(diǎn)通常彼此靠近;B.根據(jù)P值大小,顏色越淺P值越大,P值越顯著富集的基因越多。

KEGG通路富集分析,設(shè)置閾值為:P Value Cutoff<0.01,Min Overlap(最小計(jì)數(shù)為3)、Min Enrichment(富集因子)>1.5。經(jīng)過(guò)篩選,核心基因顯著富集在15條通路上(FDR<0.05),涉及癌癥通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等,見(jiàn)表4、圖4。

表4 排名前4個(gè)KEGG聚類條目富集分析結(jié)果

2.5 核心靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 通過(guò)THPA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心基因的蛋白免疫組化結(jié)果,如封三圖2所示,ICAM1、PTGS2、PPARG在GC組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),PTGS2在正常組織中不表達(dá),PPARG在正常組織中呈高表達(dá),ICAM1在正常組織中呈中等表達(dá);MMP9在GC組織中呈中等表達(dá),在正常組織中不表達(dá)。

2.6 核心靶點(diǎn)與主要有效成分分子對(duì)接 根據(jù)度值排名選取度值較高的槲皮素Quercetin(degree=29)、3-Epioleanolic acid 3-表齊墩果酸(degree=51)、diosgenin,1薯蕷皂苷(degree=23)、Foliosidine單葉蕓香定(degree=20)、Mandenol扁桃醇(degree=17)與11個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接結(jié)果均小于-5.0 kcal/mol,說(shuō)明SBD的主要生物活性成分與靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性結(jié)合能,其中3-表齊墩果酸和槲皮素與核心靶點(diǎn)結(jié)合性最優(yōu)(圖5),IL6、PTGS2與3-表齊墩果酸結(jié)合能分別為-8.1 kcal/mol、-7.9 kcal/mol;MMP-2、MMP-9與槲皮素結(jié)合能分別為-8.8 kcal/mol、-8.0 kcal/mol。

注:A. IL-6&3-Epioleanolic acid;B. MMP-2&Quercetin;C.PTGS2&3-Epioleanolic acid;D. MMP-9&Quercetin。

3 討論

中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)的藥效作用,能整體調(diào)節(jié)機(jī)體的異?；顒?dòng)?；凇胺稣钚?、顧護(hù)胃氣”的總體治療原則,中醫(yī)藥在改善胃癌患者生活質(zhì)量方面有獨(dú)特的作用,如有效改善患者手術(shù)前后及放化療后的生活質(zhì)量,能協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)陰陽(yáng)平衡,糾正腫瘤紊亂的氣機(jī),達(dá)到驅(qū)逐邪氣癌毒、抑制甚至殺死癌細(xì)胞的目的[9-10]。近年來(lái),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為胃癌治療的研究熱點(diǎn),能以科學(xué)的分析全面地闡述中藥復(fù)方潛在的作用機(jī)制[11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,分析參芪白石湯有效成分治療胃癌的基因和通路機(jī)制,并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,以期為SBD治療GC提供理論依據(jù)。

槲皮素(quercetin,QE)是一種廣泛分布在水果、蔬菜及常見(jiàn)中草藥之中的天然黃酮類化合物,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種作用[12-13],其作為一種天然的抗腫瘤藥物,已得到廣泛的認(rèn)可[14]。槲皮素可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲,誘導(dǎo)其發(fā)生自噬、促進(jìn)其凋亡,其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2基因表達(dá)有關(guān)[15-16]。動(dòng)物試驗(yàn)表明斛皮素的抗腫瘤機(jī)制通過(guò)對(duì)GC細(xì)胞G1期的阻斷作用,從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂的延期[17]。這與本研究結(jié)果一致。3-表齊墩果酸是齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)的衍生物,OA是常見(jiàn)的天然產(chǎn)物,屬于五環(huán)三萜類化合物,以游離體及糖苷的形式存在于多種植物中,具有廣泛的生物活性,如保肝、降糖、降脂、抗腫瘤、抗高血壓、抗炎和抗 HIV 感染等[18]。本研究結(jié)果也顯示3-表齊墩果酸為抗GC的主要有效成分?；|(zhì)金屬蛋白(matrix metalloproteinase MMP)家族成員中的 MMP-9和 MMP-2能有效地分解基底膜的主要成分IV型膠原蛋白,是一組鋅離子依賴性肽鏈內(nèi)切酶[19-20],兩者的過(guò)度表達(dá)與人類某些惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21-22],主要由腫瘤細(xì)胞和腫瘤周邊間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑促進(jìn)腫瘤新生血管的生成,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中MMP-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)密切相關(guān)[23-24],這與本研究結(jié)果一致。前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)是前列腺生物合成的限速酶,對(duì)前列腺素的合成起著關(guān)鍵性的調(diào)控,已證實(shí)在許多病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,是腫瘤、癌癥形成的促進(jìn)劑[25],與本研究結(jié)果相符。IL6是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子,在炎癥和 B細(xì)胞成熟中起重要作用,其功能與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如白血病、糖尿病等[26],IL6 基因的基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)增加具有相關(guān)性[27],與本研究結(jié)果相符。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,SBD治療GC的潛在作用機(jī)制除了直接作用于癌癥通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)以及金屬鉑耐藥,還包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子等。流體剪切應(yīng)力可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá),影響著內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、分化、遷移和增殖[28]。

綜上所述,SBD具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路抗GC的特點(diǎn),通過(guò)主要活性成分槲皮素、3-表齊墩果酸協(xié)同作用于GC相關(guān)通路從而發(fā)揮抗癌作用,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了新的理論依據(jù)。但是中藥復(fù)方成分復(fù)雜,本文數(shù)據(jù)是通過(guò)一些數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的,數(shù)據(jù)庫(kù)的信息還需要進(jìn)一步完善且缺乏實(shí)驗(yàn)支持,其機(jī)理有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。