彭欣欣,張 瑩,潘昱帆,劉慧慧,王思宇,韓齊心,牛旭平(山西醫(yī)科大學第九臨床醫(yī)學院皮膚科,太原 03000;山西醫(yī)科大學附屬太原市中心醫(yī)院皮膚科;通訊作者,E-mail:nnxxpp978@sina.com)

斑禿(alopecia areata,AA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病,可導(dǎo)致非瘢痕性脫發(fā),臨床特征為突發(fā)的局限性斑塊狀脫發(fā),可以發(fā)生在身體的任何部位。AA持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致毛發(fā)全部脫落,稱為全禿,嚴重者頭皮、眉毛、腋毛、陰毛及全身毳毛脫落,稱為普禿[1]。AA終生發(fā)病風險為2%,給患者的心理和生活造成十分嚴重的影響[2]。斑禿的發(fā)病機制尚未明確,主要與遺傳、環(huán)境、免疫、氧化應(yīng)激和情緒因素有關(guān)[3,4],其中,毛囊免疫豁免權(quán)喪失是導(dǎo)致斑禿的關(guān)鍵因素[5]。目前,斑禿的治療包括皮質(zhì)類固醇、外用米諾地爾、蒽林、環(huán)孢素、光化學療法、接觸性免疫療法和靶向免疫治療[6]。然而,實現(xiàn)完全緩解而不復(fù)發(fā)仍然具有挑戰(zhàn)性。所以,尋找AA有效的治療靶點和新的治療方案是目前研究的重要方向。

CeO2納米酶可以模擬一些天然酶的催化活性,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶、氧化酶、磷酸酶等[7]。CeO2納米酶可利用其SOD酶活性清除細胞內(nèi)ROS,從而防止細胞受到氧化應(yīng)激損傷[8]。目前,CeO2納米酶在雄激素性脫發(fā)、銀屑病、視網(wǎng)膜變性、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、缺血、心臟疾病、糖尿病、胃腸道炎、肝臟疾病和癌癥等疾病中都展現(xiàn)了較好的治療效果[9,10]。目前,斑禿還沒有能實現(xiàn)完全緩解而不復(fù)發(fā)的治療方法,因此,本課題組采用單次腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建AA小鼠模型[11],探討CeO2納米酶對AA小鼠的作用及其效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

7周齡雌性C57BL/6J小鼠30只,SPF級,體質(zhì)量(20±2)g,購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(晉)2019-0004。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺注射液購自德國Baxter Oncology GabH;異氟烷購自河北一品制藥股份有限公司;ICAM-1及ELAM-1試劑盒購自睿信生物科技;MDA及SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所;DNM-9602酶標儀為北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Optima XE超速離心機購于美國Beckman公司。透射電子顯微鏡購于美國FEI公司。

1.3 CeO2納米酶制備方法

將108.6 mg硝酸鈰[0.25 mmol的Ce(NO3)3·6H2O]溶解在10 mL的去離子水中,得到硝酸鈰水溶液。同時,131.2 mg 6-氨基己酸(1 mmol,AHA)和5 μL鹽酸(37%)在磁性攪拌下溶于1 mL去離子水中。然后,將硝酸鈰的水溶液迅速在空氣中加熱到95 ℃,加入已配制完成的AHA和鹽酸混合溶液。反應(yīng)持續(xù)6 h,將所得的溶液降至室溫,用丙酮清洗3次,除去過量的反應(yīng)物,即可獲得CeO2納米酶。為了研究CeO2納米酶結(jié)構(gòu),將樣品溶在水中滴在超薄碳網(wǎng)上并烘干,進行透射電子顯微鏡的測試。

1.4 模型制備及分組

7周齡C57BL/6J小鼠隨機分為3組,分別為空白組、模型組和CeO2納米酶組,每組10只。吸入適量異氟烷后,使用動物專用刮毛刀將背部毛發(fā)剃除2 cm×3 cm區(qū)域,隨后剃毛區(qū)域涂抹適量脫毛膏。此時,小鼠背部毛發(fā)呈粉紅色,從而誘導(dǎo)小鼠背部毛囊從休止期進入生長期。剃毛后第9天,空白組小鼠給予腹腔內(nèi)單次注射等劑量的生理鹽水,模型組和CeO2納米酶組小鼠均單次腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺注射液[11]。定時拍照觀察毛發(fā)生長及脫落情況,對新生毛發(fā)狀況進行打分。評分標準:無毛生長為0分;淺毛生長滿脫毛區(qū)為1分;新生毛長度及密度約為未脫毛區(qū)的一半為2分;新生毛長與未脫毛區(qū)無差別為3分[12]。

1.5 HE染色觀察小鼠斑禿處毛發(fā)組織病理改變

實驗完成后,通過頸椎脫臼處死所有小鼠,用剃毛刀將小鼠背部毛發(fā)脫干凈,取小鼠背部治療后的皮膚組織進行包埋、脫水及HE染色,觀察鏡檢下組織病理學特點及顯微鏡下每個視野的毛囊計數(shù)。

1.6 ELISA檢測小鼠血清ICAM-1及ELAM-1含量

實驗第28天,通過尾靜脈取血,6 000g離心10 min,取血清,使用ELISA法檢測小鼠血清中ICAM-1及ELAM-1含量水平,均嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明操作,最后使用酶標儀測定450 nm處吸光度值,并根據(jù)繪制的標準曲線計算各樣品中待測指標含量水平。

1.7 小鼠皮膚組織中MDA及SOD含量檢測

取小鼠背部治療后的皮膚組織,用玻璃研磨機和PBS徹底研磨得到勻漿,6 000g離心10 min,取上清,按照試劑盒說明書檢測禿發(fā)區(qū)皮膚組織中MDA及SOD含量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CeO2納米酶表征

透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)下觀察CeO2納米酶形態(tài),結(jié)果觀察到制備所得的CeO2納米酶形貌規(guī)整、分散均勻、尺寸均一(見圖1)。

圖1 CeO2納米酶表征Figure 1 Characterization of CeO2 nanoenzymes

2.2 小鼠禿發(fā)區(qū)毛發(fā)生長情況及評分

模型組背部禿毛區(qū)毛發(fā)很短,顏色灰白;空白組背部剃毛區(qū)毛發(fā)較模型組長,毛發(fā)致密,CeO2納米酶組背部禿發(fā)區(qū)毛發(fā)致密,毛色烏黑光澤(見圖2)。模型組小鼠禿發(fā)區(qū)毛發(fā)生長評分明顯低于空白組(P<0.05);CeO2納米酶組小鼠禿發(fā)區(qū)域毛發(fā)生長評分均明顯高于模型組(P<0.05,見圖3)。

圖2 小鼠禿發(fā)區(qū)毛發(fā)生長情況Figure 2 Hair growth in the bald area of mice

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖3 各組小鼠禿發(fā)區(qū)毛發(fā)評分Figure 3 Hair scores in the bald area of mice in each group

2.3 小鼠禿發(fā)區(qū)病理組織學改變

鏡檢可見模型組表皮增厚,毛囊數(shù)量減少;空白組表皮較薄,毛囊處于生長期;CeO2納米酶組毛囊數(shù)量明顯增加且處于生長期(見圖4)。模型組小鼠背部皮膚組織HE單位視野下的毛囊數(shù)量低于空白組(P<0.05);CeO2納米酶組單位視野毛囊數(shù)量顯著高于模型組(P<0.05,見圖5)。

圖4 禿發(fā)區(qū)皮膚組織病理學 (×10)Figure 4 Skin histopathology in bald area (×10)

2.4 小鼠血清ICAM-1及ELAM-1水平

模型組血清中ICAM-1水平較空白組升高(P<0.05),CeO2納米酶組血清中水平低于模型組(P<0.05,見圖6)。模型組血清中ELIAM1水平較空白組升高(P<0.05),CeO2納米酶組血清中水平低于模型組(P<0.05,見圖6)。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖6 CeO2納米酶小鼠血清中ICAM-1和ELAM-1含量的影響Figure 6 Effect of CeO2 nanoenzyme on serum contents of ICAM-1 and ELAM-1 in mice

2.5 小鼠禿發(fā)區(qū)皮膚組織中MDA及SOD含量

模型組皮膚組織中MDA含量較空白組升高(P<0.05),CeO2納米酶組MDA含量較模型組降低(P<0.05,見圖7)。模型組皮膚組織中SOD含量較空白組降低(P<0.05),CeO2納米酶組SOD含量較模型組升高(P<0.05,見圖7)。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖7 CeO2納米酶對小鼠皮膚組織中MDA和SOD含量的影響Figure 7 Effect of CeO2 nanoenzyme on MDA and SOD contents in mouse skin

3 討論

AA作為一種自身免疫性炎癥性脫發(fā),嚴重影響了患者的生活治療,目前缺乏有效預(yù)防及治愈AA的方法,多種針對免疫細胞的療法用于治療AA,但是效果具有個體差異[3,13]。氧化應(yīng)激作為AA發(fā)病機制之一,為AA的治療提供新的治療靶點。

CeO2納米酶具有SOD樣活性,可保護細胞免受氧化應(yīng)激的損傷,擁有強大的抗氧化能力,這種抗氧化能力源于CeO2納米酶表面的雙氧化態(tài)Ce3+和Ce4+,其中Ce3+負責消除O2·和·OH,而Ce4+根除H2O2[14,15]。由于CeO2納米酶良好的抗氧化還原和儲氧能力,CeO2納米酶被廣泛應(yīng)用于各種與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病。但是目前在皮膚相關(guān)疾病中應(yīng)用較少。Yuan等[10]的實驗結(jié)果表明,氧化鈰納米酶外用于雄激素脫發(fā)小鼠模型可以通過有效地改善毛囊周圍環(huán)境氧化應(yīng)激水平,對毛囊周圍微血管系統(tǒng)的新生也有較好促進作用,從而加速毛囊由休止期進入生長期,快速誘導(dǎo)毛發(fā)生長,且比傳統(tǒng)治療藥物米諾地爾效果顯著。故本研究將CeO2納米酶應(yīng)用于斑禿小鼠模型,觀察其治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組相比,模型組皮膚組織中MDA含量升高及SOD含量下降,經(jīng)過CeO2納米酶治療后,CeO2納米酶組皮膚組織中MDA含量降低及SOD含量升高。提示,CeO2納米酶可以通過清除過量的活性氧積累,有效地調(diào)控皮膚中氧化應(yīng)激,減輕氧化損傷,從而促進毛發(fā)生長,與上述文獻研究結(jié)論一致。

綜上所述,本研究表明CeO2納米酶可以通過抗氧化應(yīng)激清除活性氧從而促進AA小鼠模型毛發(fā)生長,達到治療的目的,CeO2納米酶可能成為治療AA的新型藥物的研究方向。但本研究存在以下局限性:首先,本研究通過腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建斑禿小鼠模型,其發(fā)病機制與人類斑禿并非完全吻合;其次,本研究僅在動物模型層面考察了CeO2納米酶治療AA的可能作用,并未在細胞層面進一步研究深入揭示CeO2納米酶發(fā)揮作用的具體分子機制。因此,在后續(xù)研究中,需要進一步構(gòu)建更符合人類斑禿的動物模型并在細胞和分子層面論證CeO2納米酶治療AA的具體機制,并深入探究CeO2納米酶治療AA的優(yōu)勢和不足。