田麗君,石繼海,余艷琴,姚茹楠,米淑宏,賈喜梅(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,包頭 0400;內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院流行病學(xué)研究中心;通訊作者,E-mail:7063946@qq.com)

宮頸疾病是指發(fā)生在宮頸組織區(qū)域的病變,常見(jiàn)包括宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宮頸癌(cervical cancer,CC)等,CC是目前臨床常見(jiàn)的女性惡性腫瘤,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計(jì)顯示,2020年全球估計(jì)有60.4萬(wàn)新發(fā)病例和34.2萬(wàn)死亡病例,其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,我國(guó)每年新發(fā)病例約占全球新發(fā)病例的20%左右,發(fā)病率及死亡率均高居全球范圍內(nèi)女性惡性腫瘤的第4位[1,2]。CC的發(fā)展是一個(gè)逐步的過(guò)程,CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)作為癌前病變可逐漸進(jìn)展為子宮頸浸潤(rùn)癌,早期篩查宮頸疾病對(duì)提高治療效果、改善患者預(yù)后至關(guān)重要[3,4]。既往研究發(fā)現(xiàn),微生物群通常附著于人體中形成共生體,在宿主的功能、免疫力和飲食方面可發(fā)揮共生體或互惠體的作用,目前發(fā)現(xiàn)微生物群寄生的常見(jiàn)部位包括陰道及腸道[5,6]。現(xiàn)代研究表明,微生物群的改變誘發(fā)相關(guān)疾病,包括炎癥和癌癥。女性陰道微生物環(huán)境在正常情況下處于平衡狀態(tài),而陰道微生物群落是維持陰道微生態(tài)環(huán)境平衡的核心部分[7,8]。但目前的研究只是定性的描述了宮頸疾病治療或手術(shù)后陰道菌群失調(diào),未定量分析陰道微生物群落組成的變化。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題,本研究旨在分析不同級(jí)別宮頸病變女性陰道微生物的分布特征和群落結(jié)構(gòu)變化,探討陰道微生物群在宮頸病變中的作用及潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值,篩選出與宮頸病變相關(guān)的關(guān)鍵微生物種類,為揭示宮頸病變的發(fā)病機(jī)制、探索有效的防治手段以及開(kāi)發(fā)基于陰道微生物群落的診斷和治療方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年1月至2023年6月于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的宮頸病變患者70例為觀察對(duì)象,納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均行宮頸液基細(xì)胞學(xué)、高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)篩選法及宮頸活檢病理,結(jié)果顯示存在宮頸病變;②患者年齡在20～45歲之間;③1月內(nèi)未行抗生素及陰道沖洗藥物;④1周內(nèi)無(wú)性生活。排除標(biāo)準(zhǔn):①患者合并泌尿系統(tǒng)疾病;②合并其他惡性腫瘤;③合并糖尿病或重要器官嚴(yán)重功能障礙;④合并陰道炎癥或盆腔炎癥。根據(jù)病理類型分為CIN Ⅰ組(n=20)、CIN Ⅱ組(n=20)、CIN Ⅲ組(n=20)、CC組(n=10),本研究均經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)同意(倫理批準(zhǔn)號(hào):2019031607)。

1.2 檢查方法

陰道微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè):采用無(wú)菌棉拭子放置于受檢者陰道后穹窿處旋轉(zhuǎn)10～15 s,放置-80 ℃冰箱中保存,采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取樣本總DNA,提取后放置-20 ℃冰箱中冷凍保存,使用PCR擴(kuò)增儀提取稀釋后基因組的DNA,同時(shí)擴(kuò)增16S rRNA的V3、V4區(qū)基因片段,實(shí)施PCR反應(yīng),置于4 ℃冰箱中保存,采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)陰道微生物群落。

陰道微生物分布特征:采用無(wú)菌棉拭子放置于受檢者陰道后穹窿處旋轉(zhuǎn)10～15 s,常規(guī)行涂片、干燥、固定及革蘭氏染色等操作,用顯微鏡觀察陰道菌群密集度及多樣性。陰道菌群密集度:采用油鏡觀察視野下細(xì)菌數(shù)目,放大倍數(shù)為10×100倍,其中視野下細(xì)菌數(shù)目1～9個(gè)為Ⅰ級(jí),10～99個(gè)為Ⅱ級(jí),≥100個(gè)為Ⅲ級(jí),細(xì)菌聚集成團(tuán)或密度覆蓋于黏液為Ⅳ級(jí)。陰道菌群多樣性:采用油鏡觀察視野下細(xì)菌類型數(shù)目,放大倍數(shù)為10×100倍,其中視野下細(xì)菌類型1～3種為Ⅰ級(jí),4～6種為Ⅱ級(jí),7～10種為Ⅲ級(jí),≥11種為Ⅳ級(jí)。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較各組受檢者陰道群落結(jié)構(gòu),其中微生物菌門包括厚壁菌門、放射菌門、擬桿菌門及其他菌門類型,微生物菌群包括乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬;②比較各組受檢者菌落密集度、菌群多樣性情況,其中Ⅱ-Ⅲ級(jí)為正常,Ⅰ級(jí)或Ⅳ級(jí)為異常;③CC組患者隨訪治療后3個(gè)月,比較CC患者治療前后陰道微生物分布特征、群落結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組受檢者一般資料比較

各組受檢者年齡、BMI等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表1)。

表1 各組受檢者一般資料比較Table 1 General information of subjects in each group

2.2 各組受檢者群落結(jié)構(gòu)比較

健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組患者菌門分布以厚壁菌門為主,分別占99.08%,96.13%,80.60%,73.32%,59.19%,放射菌門、擬桿菌門、其他菌門等微生物占比逐漸增加,5組菌門分布情況兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 各組受檢者菌門分布情況比較 菌門數(shù)(%)Table 2 Comparison of the distribution of bacterial phyla in subjects among five groups counts(%)

健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組乳酸桿菌屬占比逐漸下降,健康組、CINⅠ組、CINⅡ組和CINⅢ組患者菌屬分布以乳酸桿菌屬為主,分別占88.90%,73.43%,60.84%,54.37%,CC組患者以加德納菌屬為主,占比25.24%,5組菌屬分布情況兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表3 各組受檢者菌屬分布情況比較 菌屬數(shù)(%)Table 3 Comparison of the distribution of bacterial genera in subjects among five groups counts(%)

2.3 各組受檢者微生物分布特征比較

健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組患者菌落密集度正常占比分別為95.00%,80.00%,60.00%,50.00%,40.00%,CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ組患者菌落密集度正常占比明顯低于健康組,CC組患者菌落密集度正常占比明顯低于CINⅠ組和健康組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、CC組五組患者菌群多樣性正常占比分別為90.00%,65.00%,55.00%,30.00%,20.00%,CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組、CC組患者菌群多樣性正常占比明顯低于健康組,CIN Ⅲ組、CC組患者菌群多樣性正常占比明顯低于CINⅠ組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表4)。

表4 各組患者微生物分布特征比較 例(%)Table 4 Comparison of microbial distribution characteristics in subjects among five groups cases(%)

2.4 CC患者治療前后群落結(jié)構(gòu)比較

相較于治療前,治療后CC組患者厚壁菌門占比明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表5);相較于治療前,治療后CC組患者乳酸桿菌屬占比明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表6)。

表5 CC患者治療前后菌門分布情況比較 菌門數(shù)(%)Table 5 Comparison of the distribution of bacterial phyla in CC patients before and after treatment counts(%)

表6 CC患者治療前后菌屬分布情況比較 菌屬數(shù)(%)Table 6 Comparison of the distribution of bacterial genera in CC patients before and after treatment counts(%)

2.5 CC患者治療前后微生物分布特征比較

治療前CC組患者菌落密集度異常和菌群多樣性異常占比分別為60.00%和80.00%,治療后CC組患者菌落密集度異常和菌群多樣性異常占比分別為70.00%和90.00%,治療前、后菌落密集度和菌群多樣性異常情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表7)。

表7 CC患者治療前后微生物分布特征比較 例(%)Table 7 Comparison of microbial distribution characteristics of CC patients before and after treatment cases(%)

3 討論

宮頸疾病是目前臨床常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)疾病,從CIN發(fā)展至CC是一個(gè)持續(xù)性、漫長(zhǎng)的過(guò)程,但臨床癥狀不典型,無(wú)法引起患者的重視,部分患者就診時(shí)已處于癌癥階段,治療效果及預(yù)后普遍較差[9,10]。目前研究認(rèn)為,陰道微生物分布特征及群落結(jié)構(gòu)變化與宮頸病變的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[11,12],分析陰道微生態(tài)結(jié)構(gòu)與宮頸疾病的關(guān)系有助于早期篩查宮頸疾病,對(duì)臨床診斷及治療方面發(fā)揮一定指導(dǎo)作用。

微生物群落平衡一般被認(rèn)為是健康的標(biāo)志。既往研究發(fā)現(xiàn),健康女性的陰道菌門大部分由厚壁菌門組成,乳酸桿菌屬是育齡婦女健康陰道細(xì)菌群落中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)微生物屬群,被認(rèn)為是對(duì)抗病原體的第一道防線[13,14]。乳酸桿菌屬在陰道中寄生,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源、產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌素及生物表面活性物質(zhì)等代謝物對(duì)抗其他細(xì)菌的黏附和生長(zhǎng),達(dá)到一種微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡,保護(hù)宿主陰道上皮細(xì)胞免受性傳播感染,還可增強(qiáng)子宮頸到子宮的精子的活力[15,16]。據(jù)報(bào)道,在健康的陰道里還可生存25種其他微生物,包括加德納菌屬、奇異菌屬、葡萄球菌、鏈球菌等,當(dāng)乳酸桿菌屬相對(duì)豐度下降,其他厭氧菌及雜菌快速生長(zhǎng),不僅破壞陰道防御機(jī)制,還可導(dǎo)致有害代謝物質(zhì)堆積,外來(lái)病毒侵襲能力增強(qiáng),最終誘導(dǎo)宮頸疾病的發(fā)生及發(fā)展,最終誘發(fā)CC[17,18]。本研究中,健康組、CCINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組受檢者菌門分布以厚壁菌門為主,但占比逐漸下降,放射菌門、擬桿菌門、其他菌門占比逐漸增加。健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組菌屬分布以乳酸桿菌屬為主,但占比逐漸下降,加德納菌屬、奇異菌屬、其他菌屬占比逐漸增加,CC組患者以加德納菌屬為主,占比25.24%。說(shuō)明當(dāng)厚壁菌門、乳酸桿菌屬相對(duì)豐度下降,微生物群落結(jié)構(gòu)紊亂時(shí),其他厭氧菌及雜菌過(guò)度生長(zhǎng),可誘導(dǎo)CIN及CC的發(fā)生及發(fā)展,早期監(jiān)測(cè)女性陰道微生物群落結(jié)構(gòu)變化,有助于早期預(yù)測(cè)宮頸疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),在臨床篩查CIN及CC等宮頸疾病具有一定指導(dǎo)意義,適當(dāng)調(diào)節(jié)陰道微生物變化有助于增強(qiáng)陰道防御系統(tǒng),降低宮頸疾病的發(fā)生。

1994年,學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)陰道微生物群分布改變與HR-HPV感染存在密切聯(lián)系[19],當(dāng)機(jī)體陰道乳酸桿菌屬占比降低,厭氧菌過(guò)度生長(zhǎng)時(shí),陰道防御系統(tǒng)降低,HR-HPV感染風(fēng)險(xiǎn)越高,HPV病毒表達(dá)越強(qiáng)[20,21]。aniewski等[22]研究認(rèn)為,泌尿生殖器微生物群與婦科癌癥有關(guān),特別是與CC的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,CC組患者菌落密集度正常占比明顯低于CINⅠ組;CIN Ⅲ組和CC組患者菌群多樣性正常占比明顯低于CINⅠ組。說(shuō)明陰道微生物分布改變與宮頸疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),與Mitra等[23]研究結(jié)果相近,該研究認(rèn)為,陰道微生物群成分可能是未來(lái)預(yù)測(cè)宮頸疾病治療效果及預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)記物,同時(shí)也為制定新的預(yù)防和治療戰(zhàn)略提供參考。另外本研究發(fā)現(xiàn),相較于治療前,治療后CC組患者厚壁菌門占比明顯降低;治療后CC組患者乳酸桿菌屬占比明顯降低。治療后菌落密集度、菌群多樣性異常占比較治療前加重,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明CC治療過(guò)程中可能影響陰道微生物的分布及群落結(jié)構(gòu)改變,對(duì)陰道微生態(tài)造成不良影響,導(dǎo)致陰道乳酸桿菌屬進(jìn)一步減少,容易造成感染等并發(fā)癥,究其原因,放化療或手術(shù)治療可對(duì)陰道優(yōu)勢(shì)菌群造成直接破壞,增加菌群多樣性[24],另外放化療也可通過(guò)損傷機(jī)體免疫功能及內(nèi)分泌功能損傷陰道微生態(tài)[25],治療期間監(jiān)測(cè)陰道微生態(tài)改變可能幫助降低感染等并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),有助于改善患者預(yù)后情況。

綜上所述,在不同階段宮頸病變中,陰道微生物分布特征、群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變,CC治療可能對(duì)陰道微生物分布特征、群落結(jié)構(gòu)造成不良影響,因此治療期間需關(guān)注陰道微生態(tài)失衡情況。但由于本研究納入對(duì)象均為我院就診人員,樣本量較少,研究結(jié)果可能存在一定誤差,另外由于本研究時(shí)間較短,尚未分析遠(yuǎn)期預(yù)后與宮頸病變女性陰道微生物分布特征、群落結(jié)構(gòu)變化,未來(lái)將以此為方向進(jìn)一步進(jìn)行探究。