周瑞雪,連云嵐,郝云芳,馮 貞,李民生,張遠芳,李 倩,崔廣青(山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術(shù)研究所生物制品室,太原 03000;山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術(shù)研究所中藥室;通訊作者,E-mail:450889749@qq.com)

農(nóng)藥殘留(pesticide residues)指使用農(nóng)藥后一個時期內(nèi)沒被分解而殘留在生物體、收獲物、水體、環(huán)境和空氣中微量的農(nóng)藥原體、有毒的代謝物以及雜質(zhì)的總稱。農(nóng)藥對農(nóng)林收獲物和空氣、水、土壤等的污染,大多源于農(nóng)藥的利用率偏低以及農(nóng)藥的施用不合理[1]。如何合理、高效地施用農(nóng)藥,提升農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,同時不斷開發(fā)靈敏、快速、高效的農(nóng)殘檢測技術(shù),對保障人體健康、改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量及減少環(huán)境污染具有重要意義[2]。

目前應(yīng)用于農(nóng)藥檢測的前處理方法很多,其中常用的有:液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法和分散液相萃取法等[3-5]。苯并咪唑類農(nóng)藥儀器分析主要集中在多菌靈(即辛硫磷)和噻菌靈的同時檢測分析,而同時測定農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈和甲基托布津種苯并咪唑類農(nóng)藥的方法僅在國外文獻中有部分報道[6]。同時檢測羌活藥材中常見的這兩種農(nóng)藥甲基托布津和辛硫磷,未見文獻報道。震蕩法具有提取效率高、操作方便等優(yōu)點,因此本試驗采用震蕩提取結(jié)合高效液相色譜法來對羌活樣品中的辛硫磷和甲基托布津進行提取分析,旨在建立一種操作簡單、易于推廣應(yīng)用、并可滿足羌活藥材中辛硫磷和甲基托布津殘留量同時測定的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀購自安捷倫科技公司,CM-1000型高速振蕩機購自上海愛朗儀器有限公司,乙腈(色譜純)和甲酸(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

甲基托布津標準溶液(1 000 μg/L),購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;辛硫磷標準溶液(1 000 μg/L),購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

收集的羌活藥材及飲片為國家藥品監(jiān)督管理局組織的全國評價性抽驗專項任務(wù)樣品,分別來自于四川、安徽等藥材生產(chǎn)基地和全國批發(fā)零售企業(yè)等地的抽樣,樣品共計202批次,取適量進行粉碎,分別過四號篩,即為所需羌活藥材粉末。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準溶液配制 將甲基托布津和辛硫磷用乙腈分別配制成甲基托布津0.67 mg/mL、辛硫磷0.20 mg/mL的母液,置于-20 ℃冷凍保存。臨用現(xiàn)配,稀釋成約20 μg/mL的溶液。

1.2.2 液相色譜條件 硅膠柱C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈與0.1%甲酸(含10 mmol/L甲酸銨)(70∶30),柱溫30 ℃,流速為0.8 mL/min,檢測波長為280 nm,進樣量10 μL。

1.2.3 供試品溶液制備 取羌活藥材粉末約3 g,加入氯化鈉約5 g,精密加入10 mL含0.1%甲酸的乙腈溶液,置于100 mL具塞量筒中,避光操作,猛烈振搖150次,放置1 min,再振搖100次,靜置1 h,經(jīng)過0.25 g無水硫酸鈉及0.45 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

1.3 樣品前處理因素的篩選

1.3.1 樣品前處理提取溶劑的選擇 參照文獻[7],本研究分別對乙酸乙酯、乙腈及0.1%甲酸的乙腈溶液幾種提取溶劑進行了考察。

1.3.2 樣品前處理提取方法的選擇 參照文獻[7,8],分別對這兩種提取方法進行考察:渦旋1.5 min后靜置1 h;或樣品加氯化鈉共同振搖2遍,每遍100次左右,然后靜置1 h,用無水硫酸鈉過濾。

1.3.3 檢測波長的選擇 分別對甲基托布津和辛硫磷標準品進行全波長光譜掃描,選擇最優(yōu)檢測波長。

1.4 方法學考察

1.4.1 線性關(guān)系及檢出限的考察 取約20 μg/mL的甲基托布津及辛硫磷對照溶液,分別按照1,2,4,6,8,10 μL進樣,按上述1.2.2項下色譜條件測定,計算此兩種農(nóng)藥的對照溶液標準曲線。

1.4.2 方法精密度及回收率試驗 取約3 g羌活藥材粉末,分別添加不同體積的甲基托布津和辛硫磷標準品儲備液,制得不同濃度的回收率待測樣品,按照供試品溶液制備方法對樣品進行提取及凈化,通過外標法定量的方法,計算出各自相應(yīng)的平均回收率及相對標準偏差。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗 甲基托布津和辛硫磷皆對光和熱比較敏感,所以對兩者的穩(wěn)定性進行了相關(guān)的試驗。將此二者標準溶液分別放在棕色進樣瓶中,置于液相儀器進樣盤上,無光進入,在實驗室常規(guī)環(huán)境中,在16 h內(nèi)連續(xù)檢測標準品變化情況,考察穩(wěn)定性。

1.5 驗證實驗

檢測全國產(chǎn)地及藥材市場收集的202批次羌活藥材中甲基托布津和辛硫磷兩種農(nóng)藥殘留的含量,按1.2.3供試品溶液制備方法進行處理,每個供試品處理2份平行樣,按1.2.2液相色譜條件檢測,采集譜圖峰面積。根據(jù)峰面積計算含量。

2 結(jié)果

2.1 樣品前處理提取溶劑的選擇

經(jīng)對樣品前處理提取液進行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用0.1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑時,目標物回收率有較明顯提高(見表1),因此選擇使用含0.1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

表1 樣品前處理提取溶劑的選擇Table 1 Selection of extraction solvents for sample pretreatment

2.2 樣品前處理提取方法的選擇

對羌活藥材粉末前處理提取方法考察結(jié)果顯示,藥材粉末加入0.1%甲酸的乙腈溶液進行渦旋1.5 min后靜置1 h提取,甲基托布津和辛硫磷回收率分別為71.55%和65.01%;羌活藥材粉末加0.1%甲酸的乙腈和氯化鈉共同振搖2次,每次100次左右,然后靜置1 h,用無水硫酸鈉過濾的提取方法,回收率分別為101.33%和88.59%。第二種方法回收率更高,因此作為供試品前處理提取方法。

2.3 檢測波長的選擇

經(jīng)對甲基托布津和辛硫磷標準品進行全波長光譜掃描,光譜圖顯示分別在267 nm和283 nm處有最大吸收峰(見圖1),參考文獻[9,10]并綜合考慮,因此選用280 nm作為檢測波長。

圖1 甲基托布津和辛硫磷全波長掃描光譜圖Figure 1 Full-wavelength scanning spectrogram of thiophanate-methyl and phoxim

2.4 線性關(guān)系及檢出限的考察

建立甲基托布津和辛硫磷這兩種農(nóng)藥的對照溶液標準曲線,結(jié)果見表2。從表2中可以看出甲基托布津和辛硫磷這兩種農(nóng)藥的線性相關(guān)性較好,R2均大于0.995,按照信噪比即S/N=3得到該方法對甲基托布津和辛硫磷的儀器檢測限分別為4 ng/mL和3 ng/mL,可以滿足目前國內(nèi)對蔬菜水果樣品的最高殘留限量標準0.05 mg/kg的檢測要求。

表2 兩種農(nóng)藥標準曲線方法線性方程、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Standard curve linear equation, linear correlation coefficient and detection limit for two pesticides

2.5 方法精密度及回收率試驗

通過外標法定量的方法,計算甲基托布津和辛硫磷各自相應(yīng)的平均回收率及相對標準偏差,測定結(jié)果見表3。從表3中的測定結(jié)果可以看出,甲基托布津和辛硫磷在不同添加量時的回收率均較高,相對標準偏差值較低,重現(xiàn)性也比較理想。甲基托布津的回收率為92.14%～112.56%,辛硫磷的回收率為87.85%～103.45%。

表3 兩種農(nóng)藥成分回收率及精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of recovery rate and precision test of the two pesticides

2.6 穩(wěn)定性試驗

取羌活藥材粉末,按1.2.3供試品溶液制備方法進行處理,得供試品溶液,2～8 ℃放置,分別于1,2,3,6,8,12,16 h上樣檢測,采用1.2.2液相色譜條件檢測,采集譜圖峰面積。結(jié)果顯示,16 h以內(nèi)的峰面積的RSD分別為0.45%和1.02%,表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品農(nóng)藥殘留含量檢測結(jié)果

對202批次羌活藥材樣品進行檢測,測出疑似辛硫磷樣品為36批次,含量范圍為10.18～87.73 μg/g;甲基托布津樣品為15批次,含量范圍為0.19～1.66 μg/g其中兩者均檢出的有3批次,甲基托布津和辛硫磷對照品液相色譜圖及羌活藥材樣品液相色譜圖,并將相應(yīng)峰進行光譜確認,結(jié)果見圖2。

圖2 羌活藥材陽性供試品液相色譜圖和光譜圖Figure 2 Liquid chromatogram and spectrum of Notopterygium incisum positive sample

3 討論

甲基托布津和辛硫磷為羌活藥材種植中常用的農(nóng)藥,對人體有一定的毒性,使用過程中難免會有殘留,但目前尚未見到羌活藥材常用的農(nóng)藥殘留相關(guān)文獻報道。甲基托布津和辛硫磷2種成分對溫度和光較敏感,尤其見光易分解,所以對羌活藥材樣品前處理過程中要注意避光操作。本文建立的檢測方法,使用氯化鈉粉末和無水硫酸鈉粉末進行兩步除雜凈化,不需要昂貴的凈化小柱,檢測成本較低,更經(jīng)濟,且前處理操作簡單,方法的靈敏度、準確度和精密度均較高。故本文建立的方法有較好的使用價值,適合大范圍推廣,能滿足羌活藥材農(nóng)藥殘留的定量檢測要求,可用于羌活藥材中常用農(nóng)藥甲基托布津和辛硫磷的殘留檢測。