武 剛,劉 冰,陳全姚,倪永波,郭璐韻,梅玉婷,于傳飛,王 蘭(中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產(chǎn)品室,衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 069;重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院生物制品室;煙臺大學(xué)藥學(xué)院;共同第一作者;通訊作者,E-mail:wanglan@nifdc.org.cn)

阿達(dá)木單抗是采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞系表達(dá)制備的首個(gè)重組全人源化抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的單克隆抗體,其通過與TNF-α特異性結(jié)合,阻止TNF-α與細(xì)胞表面TNF-α受體結(jié)合,從而有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的多種病理效應(yīng)[1,2]。阿達(dá)木單抗首先是由艾伯維公司研發(fā)并于2002年在美國批準(zhǔn)上市,商品名為“修美樂(Humira)”,2010年獲批進(jìn)入中國,陸續(xù)獲批的適應(yīng)證包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病、克羅恩病等多種自身免疫性疾病[3-5]。自2012年開始,阿達(dá)木單抗修美樂連續(xù)近10年位居全球藥品銷售額榜首,2021年年銷售額突破200億美元,展現(xiàn)了巨大的市場潛力。目前,美國和歐盟已有10余家公司的阿達(dá)木單抗生物類似藥上市,國內(nèi)也已有7家公司的生物類似藥獲批上市,同時(shí)國內(nèi)還有20余家公司正處于研發(fā)階段[6-9]。

肽指紋圖譜是蛋白質(zhì)表征、結(jié)構(gòu)鑒定和功能研究的基本方法之一。還原肽圖是將蛋白質(zhì)進(jìn)行變性還原后利用特異性的酶(蛋白水解)或化學(xué)裂解,得到一系列的短肽片段,然后對其進(jìn)行分離、檢測和鑒定。如果供試品與參考品以同樣的前處理方式制備,酶解后的指紋圖譜一致,那么二者被認(rèn)為是相同的。肽圖分析已成為驗(yàn)證單克隆抗體及其他重組蛋白生物制品一級結(jié)構(gòu)完整性及正確性最有效的方法之一[10-12]。肽圖分析方法對氨基酸序列的變化非常敏感,氨基酸一級序列的變化或氨基酸的翻譯后修飾會導(dǎo)致肽指紋圖譜發(fā)生變化,可以檢測到治療性單抗中單個(gè)氨基酸殘基修飾或突變的細(xì)微變化,如絲氨酸變?yōu)榫彼醄13],肽圖鑒別也是考察產(chǎn)品批間一致性及穩(wěn)定性的重要手段,已成為單抗制品常用的質(zhì)控放行方法之一,對產(chǎn)品的質(zhì)量控制有非常重要的意義[9,14,15]。

治療性單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region,CDR)是決定抗體特異性和親和力的關(guān)鍵部位,不同抗體的CDR序列不同[16,17],酶切后產(chǎn)生相應(yīng)肽段的色譜保留行為也不同,從而得到抗體的特征肽段色譜圖,達(dá)到鑒別抗體的目的。單抗常含有多種翻譯后修飾(post-translational modification,PTM),這些PTMs可能發(fā)生在抗體生產(chǎn)、純化和儲存的任何階段[18,19]。位于抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基的PTM可能會對抗體與目標(biāo)抗原的結(jié)合產(chǎn)生不利影響,進(jìn)而影響抗體活性及臨床療效。蛋氨酸和色氨酸側(cè)鏈的氧化,已被證明會導(dǎo)致構(gòu)象變化[20,21],影響抗體與Fc受體和抗原的結(jié)合[22,23],并影響mAb的穩(wěn)定性和半衰期[21,24]。因此,選擇CDR作為肽圖鑒別監(jiān)測的特征肽段是一種常見策略,對單克隆抗體在藥物開發(fā)、生產(chǎn)和儲存過程中的質(zhì)量控制尤為重要。

本研究首先采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對所建立的阿達(dá)木單抗還原肽指紋圖譜方法的氨基酸序列覆蓋率進(jìn)行了考察,并對全部CDR肽段進(jìn)行了鑒別,在此基礎(chǔ)上建立了阿達(dá)木單抗液相色譜肽指紋圖譜鑒別方法,按照《中國藥典》2020年版四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,對該方法進(jìn)行了專屬性、精密度、耐用性等驗(yàn)證,并考察了樣品的儲存穩(wěn)定性,為企業(yè)建立抗體肽指紋圖譜鑒別分析方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 單抗及主要試劑

阿達(dá)木單抗、貝伐珠單抗和利妥昔單抗為中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產(chǎn)品室留樣。胰蛋白酶(Trypsin)購自美國Promega公司,胞內(nèi)蛋白酶(Lys-C)購自日本W(wǎng)ako公司;二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)購自美國Sigma Aldrich公司;8 mol/L鹽酸胍溶液、1 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)、ESI陽離子校準(zhǔn)液、甲酸(質(zhì)譜級)、乙腈(質(zhì)譜級)、水(質(zhì)譜級)購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器設(shè)備

配有紫外檢測器(UV)的Vanquish Flex超高效液相色譜儀、Q Exactive Plus超高分辨質(zhì)譜儀購自美國Thermo Fisher公司;真空離心濃縮儀購自英國Genevac公司;金屬浴購自德國Eppendorf公司。

1.3 高分辨質(zhì)譜測定氨基酸序列覆蓋率及CDR特征肽段的確證(Trypsin酶切)

1.3.1 樣品處理 取蛋白800 μg于離心管中,采用真空離心濃縮儀將樣品干燥至透明狀,加蛋白變性液40 μL(由8 mol/L鹽酸胍1 mL、1 mol/L Tris-HCl pH8.0溶液50 μL和1 mol/L DTT溶液10 μL混合制成),充分渦旋震蕩混勻,37 ℃孵育30 min,冷卻至室溫,加入1 mol/L IAM溶液1 μL,室溫避光反應(yīng)30 min,加入50 mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液760 μL,渦旋混勻。取上述溶液100 μL至新離心管中,加0.5 mg/mL Trypsin溶液5 μL,37 ℃孵育4 h,加入甲酸3 μL終止酶解,13 000 r/min離心5 min,取上清液待測。

1.3.2 液相色譜參數(shù) 柱溫60 ℃,樣品盤溫度8 ℃,紫外檢測波長214 nm,進(jìn)樣量10 μL。流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫(0～5 min,2%流動相B;5～120 min,2%→35%流動相B;120.1～128 min,35%→100%流動相B;128.1～135 min,2%流動相B),流速0.3 mL/min,色譜柱為Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)。

1.3.3 高分辨質(zhì)譜參數(shù) 采用ESI離子源,正離子模式,數(shù)據(jù)依賴型掃描,一級掃描范圍m/z為200～2 000,分辨率為70 000,AGC target 3×e6;二級分辨率為17 500,AGC target 1×e5;Top 10,First Mass:m/z120,四級桿隔離窗口m/z1.8,碎裂能量NCE 28。3～120 min液相六通閥切入質(zhì)譜采集,其他時(shí)間六通閥切入廢液。

1.3.4 肽指紋圖譜鑒別方法覆蓋率分析及CDR特征肽段確證 使用Thermo BiopharmaFinder3.2軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),分析建立方法的氨基酸序列覆蓋率,并確證全部CDR肽段。結(jié)合肽指紋圖譜各個(gè)肽段的UV強(qiáng)度、分離度、共流出等信息,確定所建立液相方法鑒別分析的特征肽段與參比肽段。

1.4 液相色譜法肽指紋圖譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 專屬性分析 將阿達(dá)木單抗、貝伐珠單抗和利妥昔單抗分別按1.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行制備,以水作為空白對照同樣品處理,所得溶液按1.3.2和1.3.3項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜參數(shù)條件進(jìn)行分析。

1.4.2 精密度分析 將同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次,以特征肽段/參比肽段的相對保留時(shí)間(relative retention time,RRT)及相對峰面積(relative peak area,RPA)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)考察儀器精密度。由同一實(shí)驗(yàn)人員于不同時(shí)間制備樣品以及兩名實(shí)驗(yàn)人員于同一時(shí)間分別制備樣品,每份樣品溶液各進(jìn)樣1次,以特征肽段的RRT及RPA的RSD考察中間精密度。

1.4.3 耐用性分析 分別考察多個(gè)維度的方法耐用性,包括酶:蛋白質(zhì)量比、酶切時(shí)間、酶解后樣品穩(wěn)定性、色譜柱耐用性。

以不同酶∶蛋白質(zhì)量比(1∶35,1∶40,1∶45)加入Trypsin,混勻后37 ℃孵育4 h后終止,即得不同酶解比例的樣品溶液。以特征肽段的RRT及RPA的RSD考察方法耐用性。

以酶∶蛋白質(zhì)量比為1∶40加入Trypsin,37 ℃孵育不同時(shí)間(3.5,4,4.5 h),終止,即得不同酶解時(shí)間的樣品溶液。以特征肽段的RRT及RPA的RSD考察方法耐用性。

將制備的樣品溶液于8 ℃樣品盤中放置0,12,24 h各進(jìn)樣1次;將制備的樣品溶液儲存于-20 ℃,于0,3,7 d溶解后各進(jìn)樣1次。以特征肽段的RRT及RPA的RSD評價(jià)酶解后樣品穩(wěn)定性。

分別采用不同品牌、型號、柱長和孔徑等的7種色譜柱對樣品溶液進(jìn)行分析,通過比較特征肽段色譜行為考察色譜柱的適用性。色譜柱信息見表1。

表1 色譜柱的型號及規(guī)格Table 1 Information of chromatographic columns

1.5 高分辨質(zhì)譜測定氨基酸序列覆蓋率、CDR特征肽段確證及方法學(xué)驗(yàn)證(Lys-C酶切)

以0.5 mg/mL胞內(nèi)蛋白酶(Lys-C)代替Trypsin溶液,其他按1.3項(xiàng)方法進(jìn)行樣品制備和檢測,并按照1.4項(xiàng)開展方法學(xué)驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 高分辨質(zhì)譜測定氨基酸序列覆蓋率及CDR肽段確證結(jié)果(Trypsin酶切)

2.1.1 氨基酸序列覆蓋率結(jié)果 采用Thermo BiopharmaFinder3.2軟件對阿達(dá)木單抗質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,總離子流見圖1,采用99%高置信水平卡值,重鏈(heavy chain,HC)覆蓋率為96.0%,輕鏈(light chain,LC)覆蓋率為98.6%,全部CDR肽段均得到確證,未確證的短肽均為親水性肽段,在色譜柱上無保留,前3 min流入廢液,未進(jìn)入質(zhì)譜。HC、LC覆蓋率良好(≥95.0%),滿足鑒別需求。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補(bǔ)決定區(qū)。圖1 阿達(dá)木單抗總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of adalimumab

2.1.2 CDR肽段確證結(jié)果 HC和LC的全部CDR肽段均得到鑒定。各CDR肽段及離子化信息結(jié)果見表2,各肽段實(shí)測相對分子質(zhì)量與理論值偏差≤±5×10-6,其中下劃線部分為CDR序列,CDR對應(yīng)肽段一級質(zhì)譜圖見圖2。通過MS2高能量碎裂獲得二級碎片b/y離子信息(見圖3,以重鏈CDR1和輕鏈CDR2為例),確證了各肽段的序列。

注:+1,+2,+3,+4代表電荷數(shù)。圖2 阿達(dá)木單抗CDR對應(yīng)肽段一級質(zhì)譜圖Figure 2 First mass spectrum of CDR peptides of adalimumab

注:b/y代表碎片離子類型;數(shù)字代表碎片離子質(zhì)荷比。圖3 阿達(dá)木單抗CDR對應(yīng)肽段MS2譜圖Figure 3 MS2 spectra of CDR peptides of adalimumab

2.1.3 特征肽段的確認(rèn) 根據(jù)質(zhì)譜鑒定出CDR肽段峰的保留時(shí)間確定特征肽段。阿達(dá)木單抗LC的CDR1和CDR3序列內(nèi)存在Trypsin酶切位點(diǎn),酶切后CDR位于2個(gè)肽段,分別標(biāo)記為CDR1-1、CDR1-2及CDR3-1、CDR3-2。經(jīng)解析,HC-CDR1和LC-CDR1-2在出峰位置處存在共流出峰,其中HC-CDR1與共流出峰強(qiáng)度相當(dāng),而LC-CDR1-2與其共流出峰相比強(qiáng)度僅約為2%。因此,最終鑒別用特征肽段選取HC的CDR1、CDR2、CDR3以及LC的CDR1-1、CDR2、CDR3-1、CDR3-2作為特征肽段,同時(shí)選定保留時(shí)間約為97 min的肽段(Fc段保守氨基酸序列152-214)作為參比肽段。

2.2 液相色譜法肽指紋圖譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 專屬性分析結(jié)果 空白對照在樣品出峰時(shí)間內(nèi)無干擾峰;阿達(dá)木單抗、貝伐珠單抗和利妥昔單抗據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,鑒定出各自的CDR肽段(見圖4)。該方法可對阿達(dá)木單抗進(jìn)行有效的鑒別。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補(bǔ)決定區(qū);紅色區(qū)域代表CDR肽段色譜峰。圖4 專屬性UV肽譜圖Figure 4 The UV peptide mapping chromatograms for specificity

2.2.2 精密度分析結(jié)果 連續(xù)5次進(jìn)樣測定各特征肽段的RRT的RSD在0.008%～1.097%之間,RPA的RSD在1.212%～7.951%之間(見表3,4),中間精密度考察特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.985%之間,RPA的RSD在2.306%～10.939%之間(見圖5,表5,6),表明該方法精密度良好。

注:6條不同顏色的譜圖代表6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的色譜圖。圖5 中間精密度色譜圖Figure 5 Chromatograms for intermediate precision tests

表3 儀器精密度考察結(jié)果Table 3 Results of instrument precision tests

表4 儀器精密度考察結(jié)果Table 4 Results of instrument precision tests

表5 中間精密度考察結(jié)果Table 5 Results of intermediate precision tests

表6 中間精密度考察結(jié)果Table 6 Results of intermediate precision tests

2.2.3 耐用性分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Trypsin酶切比例為1∶35～1∶45,特征肽段RRT的RSD在0.003%～0.870%之間,RPA的RSD在1.299%～14.584%之間;酶切時(shí)間在3.5～4.5 h內(nèi)變化時(shí),特征肽段RRT的RSD在0.031%～1.066%之間,RPA的RSD在2.518%～4.380%之間,耐用性良好(見表7,8)。

表7 耐用性考察結(jié)果Table 7 Results of durability tests

表8 耐用性考察結(jié)果Table 8 Results of durability tests

酶解后樣品穩(wěn)定性結(jié)果表明,樣品溶液在8 ℃放置24 h以及-20 ℃放置7 d的穩(wěn)定性良好(見表9,10)。

表9 酶解后樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 9 Results of stability tests of sample solution

表10 酶解后樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 10 Results of stability tests of sample solution

對7根不同色譜柱采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以99%高置信水平卡值,除色譜柱7的重鏈外,肽段覆蓋率均在95%以上,根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果,均在對應(yīng)的UV譜圖中標(biāo)記出CDR特征峰(見圖6)。色譜柱1～4為Waters CSH系列色譜柱,對阿達(dá)木單抗各肽段保留行為基本一致,其中色譜柱3分離效果稍好,如重鏈CDR1與其共流出峰有分開趨勢但仍未完全分離;色譜柱4為長100 mm的短柱,肽段保留時(shí)間整體前移,但對同一肽段的分離效果卻不完全相同,如鑒定到的輕鏈CDR1-2與其共流出峰分開,保留時(shí)間約為36 min,因強(qiáng)度較低未能在UV譜圖上標(biāo)出對應(yīng)的色譜峰;而鑒定到的重鏈CDR3與其后面的峰由基線分離變?yōu)楣蚕疵摲?。色譜柱5～6為Waters BEH系列色譜柱,二者孔徑不同,相比而言,130 ?比300 ?分離效果好,如重鏈CDR2和CDR3在130 ?色譜柱上可以達(dá)到基線分離,而在300 ?色譜柱上被同時(shí)洗脫下來。與Waters CSH系列色譜柱相比,鑒定出的輕鏈CDR1-2被分在2個(gè)肽段即ASQGIR和NYLAWYQQKPGKAPK,保留時(shí)間約為3 min和47 min,分別標(biāo)記為CDR1-2′和CDR1-3′;其他特征肽段洗脫順序大致相同,但峰形整體增寬且峰強(qiáng)度偏低,原因是CSH為表面帶正電的BEH(亞乙基橋雜化)顆粒,可以改善低離子強(qiáng)度流動相中的上樣能力和峰不對稱性。色譜柱7為Agilent色譜柱,其對各肽段保留行為與Waters BEH系列色譜柱類似,但重鏈CDR2未鑒定到(見圖6)。

注:紅色區(qū)域代表CDR肽段色譜峰。圖6 不同色譜柱分析CDR肽段的色譜圖Figure 6 The chromatograms of CDR peptide by different columns

2.3 高分辨質(zhì)譜測定氨基酸序列覆蓋率、CDR特征肽段確證及方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果(Lys-C酶切)

2.3.1 氨基酸序列覆蓋率及CDR確證結(jié)果 采用Thermo BiopharmaFinder3.2軟件對阿達(dá)木單抗質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,總離子流圖見圖7,HC覆蓋率為95.1%,LC覆蓋率為96.7%,HC、LC覆蓋率良好(≥95.0%)。全部CDR肽段均得到確證,對應(yīng)肽段及離子化信息結(jié)果見表11、一級質(zhì)譜圖見圖8,通過MS2高能量碎裂獲得二級碎片b/y離子信息(見圖9,以重鏈CDR1和輕鏈CDR1為例),成功確證各CDR肽段。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補(bǔ)決定區(qū);數(shù)字代表保留時(shí)間。圖7 阿達(dá)木單抗CDR對應(yīng)肽段總離子流圖(Lys-C酶切)Figure 7 Total ion chromatograms of adalimumab (digested by Lys-C)

注:圖中+2,+3,+4,+5,+6,+7代表電荷數(shù);數(shù)字代表質(zhì)荷比。圖8 阿達(dá)木單抗CDR對應(yīng)肽段一級質(zhì)譜圖(Lys-C酶切)Figure 8 Mass spectrum of CDR peptides of adalimumab (digested by Lys-C)

注:b/y代表碎片離子類型;數(shù)字代表碎片離子質(zhì)荷比。圖9 阿達(dá)木單抗CDR對應(yīng)肽段MS2譜圖(Lys-C酶切)Figure 9 MS2 spectra of CDR peptides of adalimumab (digested by Lys-C)

表11 阿達(dá)木單抗CDR對應(yīng)Lys-C酶切肽段及離子化信息Table 11 Related CDR peptides and ionization information of adalimumab digested by Lys-C

2.3.2 CDR肽段確證結(jié)果及鑒定用特征肽段的確定 阿達(dá)木單抗LC的CDR2和CDR3位于同一肽段,HC的CDR1和CDR2在色譜圖中體現(xiàn)為共流出峰,且二者強(qiáng)度相當(dāng)。因此,選擇HC的CDR1&2、CDR3以及LC的CDR1、CDR2&3肽段作為特征肽段,同時(shí)選定保留時(shí)間約為95 min的峰(Fc段保守氨基酸序列152-214)作為參比峰。

2.3.3 液相色譜法肽指紋圖譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 空白對照在樣品出峰時(shí)間內(nèi)無干擾峰(見圖10A),且可與其他單抗進(jìn)行鑒別(見圖10B-D)。5次連續(xù)進(jìn)樣測定特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.017%之間,RPA的RSD在1.617%～6.570%之間;中間精密度考察特征肽段RRT的RSD在0.070%～0.129%之間,RPA的RSD在3.730%～18.280%之間。結(jié)果表明,該方法精密度良好。耐用性考察結(jié)果表明,Trypsin酶切比例在1∶30～1∶50內(nèi)變化時(shí),特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.038%之間,RPA的RSD在7.576%～16.593%之間;酶切時(shí)間在3～5 h內(nèi)變化時(shí),特征肽段RRT的RSD在0.014%～0.027%之間,RPA的RSD在9.254%～10.999%之間,耐用性良好。酶解后樣品溶液在8 ℃放置24 h以及-20 ℃放置7 d的穩(wěn)定性良好。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補(bǔ)決定區(qū);紅色區(qū)域代表CDR肽段色譜峰。圖10 專屬性UV肽譜圖 (Lys-C酶切)Figure 10 The UV peptide mapping chromatograms for specificity (digested by Lys-C)

3 討論

單克隆抗體類藥物是目前最常見的蛋白質(zhì)類藥物之一,肽指紋圖譜鑒別是蛋白質(zhì)類藥物質(zhì)量控制的重要手段之一。通過反相色譜分析蛋白質(zhì)酶解后的肽段能夠獲取蛋白質(zhì)的大量信息,再通過比較供試品蛋白與參比品蛋白的肽指紋圖譜進(jìn)而判斷蛋白表達(dá)的準(zhǔn)確性,該方法對于蛋白質(zhì)類藥物特性鑒別具有重要意義,現(xiàn)已成為鑒別質(zhì)控分析常用方法之一。相比于非還原肽圖,還原肽圖將鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵打開,酶切得到的肽段(如含二硫鍵的肽段)相對更小,利于保持可溶狀態(tài)、離子化,便于MS表征分析及檢測,用于質(zhì)控放行的肽圖鑒別方法一般使用還原肽指紋圖譜,因此,本研究選擇還原肽圖方法對阿達(dá)木單抗進(jìn)行鑒別。

CDR氨基酸序列是不同單克隆抗體的特異性序列,單抗肽圖鑒別方法常選取CDR肽段作為特征肽段進(jìn)行鑒別以達(dá)到質(zhì)控目的。單抗輕重鏈各含有3個(gè)CDR,酶切后一般產(chǎn)生≥6個(gè)含CDR的肽段,但并非所有的CDR肽段峰都適合作為特征峰,如有的CDR肽段雖可由質(zhì)譜確證,但在UV譜圖上色譜峰強(qiáng)度較低或不可見;有的CDR肽段親水性較強(qiáng)在反相色譜柱上保留較弱,導(dǎo)致保留時(shí)間變異較大。本研究中的全部CDR肽段均得到確證,結(jié)合質(zhì)譜鑒定結(jié)果以及UV譜圖情況,分別選擇7個(gè)CDR肽段(Trypsin酶切)和4個(gè)CDR肽段(Lys-C酶切)作為特征肽段用于肽指紋圖譜鑒別。特征肽段應(yīng)基于對分子特性充分了解,對分析方法充分驗(yàn)證的基礎(chǔ)上進(jìn)行規(guī)定,合理設(shè)定特征肽段是鑒別方法優(yōu)劣的關(guān)鍵。同時(shí),如在方法開發(fā)時(shí)遇到譜圖中一些峰的洗脫順序、峰強(qiáng)度、目視分離度、峰數(shù)目和峰形無論如何優(yōu)化條件(液相色譜儀、色譜柱、流動相、柱溫、流速等)均無法穩(wěn)定重現(xiàn),則可以考慮在結(jié)果判定中合理設(shè)置可變區(qū)段。肽圖一致性判定標(biāo)準(zhǔn)通常要求計(jì)算供試品與參比品的特征峰與參比峰的保留時(shí)間/相對保留時(shí)間、面積/相對峰面積、峰高/相對峰高,規(guī)定供試品與參比品相應(yīng)參數(shù)的差值/比值范圍來進(jìn)行判斷,且供試品的總洗脫概況(如峰保留時(shí)間、峰形和峰高等)應(yīng)與參比品色譜圖一致,本研究采用相對保留時(shí)間及相對峰面積作為考察指標(biāo)對建立的阿達(dá)木單抗肽指紋圖譜液相鑒別法開展了方法學(xué)驗(yàn)證,以此評價(jià)該方法的可行性。

肽圖樣品處理過程中涉及蛋白變性、二硫鍵還原、烷基化封閉、酶切等步驟,由于變性、還原劑等會影響蛋白酶的活性,常選用脫鹽后酶切的操作流程,可以使樣品處理方法具有較好的重現(xiàn)性。脫鹽方法較多,如透析袋、超濾管、SEC脫鹽柱、液相在線脫鹽等,但存在成本高、時(shí)間長、依賴回收率穩(wěn)定性等缺陷。由于Trypsin、Lys-C對較低濃度的變性劑具有一定的耐受性,本研究嘗試通過稀釋的方式建立了非脫鹽前處理方法,結(jié)果顯示蛋白酶可充分對樣品進(jìn)行酶解,且蛋白回收率穩(wěn)定性較好。因此,為避免方法重現(xiàn)性不穩(wěn)定、形成批間差異,應(yīng)在方法學(xué)開發(fā)階段充分驗(yàn)證樣品處理方法的精密度及耐用性。

本研究采用以甲酸作為流動相離子對試劑的反相體系進(jìn)行分析,甲酸和三氟乙酸是肽圖分析方法的流動相中常用的離子對試劑,三氟乙酸相較于甲酸具有更強(qiáng)的色譜保留,同時(shí)還具有改善峰型、降低UV基線噪音等作用,但在質(zhì)譜上表現(xiàn)出顯著的離子抑制效應(yīng),長期使用會污染儀器,降低儀器效能[25]。肽圖分析通常是在基于質(zhì)譜鑒別的基礎(chǔ)上建立液相方法,如何選擇離子對試劑,需權(quán)衡利弊后來確定。本研究耐用性考察發(fā)現(xiàn)不同的反相色譜柱對各肽段選擇性、保留強(qiáng)弱、分離效果以及峰強(qiáng)度等具有一定差異,這不僅與肽段的大小、電荷及疏水性有關(guān),還與色譜柱固定相特性,如顆粒類型、孔徑等有關(guān),因此,在方法開發(fā)過程中可以通過篩選色譜柱對肽段分離方法進(jìn)行優(yōu)化,以獲取更高的分離度和回收率。

Trypsin能識別賴氨酸K和精氨酸R,單抗酶解后得到較多的肽段,可實(shí)現(xiàn)較好的全序列覆蓋,CDR肽段數(shù)量多便于合理選定特征肽段,是肽指紋圖譜鑒別方法開發(fā)最常用的蛋白酶。Trypsin法存在小肽段較多,易形成共流出峰,疊加操作人員差異、色譜柱差異、液相色譜儀工況、批次日間差異等可能導(dǎo)致色譜圖存在細(xì)微或顯著差異,不利于一致性判定。Lys-C酶只識別賴氨酸K,單抗酶解后肽段總量較少,CDR分布的肽段較少,不利于特征肽段的選定。但使用該酶建立的鑒別方法譜圖批間差異較小、一致性更好,越來越多的進(jìn)口及國產(chǎn)上市單抗品種選用Lys-C酶法用于QC放行鑒別。本研究分別采用Trypsin和Lys-C兩種酶進(jìn)行酶切,通過方法學(xué)驗(yàn)證,均可達(dá)到預(yù)期的鑒別目的。除Trypsin、Lys-C外的特異性的蛋白酶也可使用,如AspN、Glu-C等。

本實(shí)驗(yàn)分別應(yīng)用Trypsin、Lys-C對阿達(dá)木單抗進(jìn)行前處理,利用高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對CDR區(qū)肽段進(jìn)行了表征確證,以表征結(jié)果為基礎(chǔ)選取部分適宜的CDR肽段作為鑒別用特征肽段建立液相肽指紋圖譜鑒別方法并按照2020年版《中國藥典》(通則9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則)完成方法學(xué)驗(yàn)證。所建立的肽指紋圖譜鑒別分析方法具有良好的專屬性、精密度和耐用性,可用于阿達(dá)木單抗的質(zhì)量控制及批檢驗(yàn)放行,對眾多國產(chǎn)阿達(dá)木生物類似藥的質(zhì)量屬性評價(jià)和控制具有參考價(jià)值,同時(shí)也可為其他重組蛋白生物制品的肽指紋圖譜鑒別方法開發(fā)提供參考。