何明媚,高靜云,賀美婷,潘海峰

(承德醫(yī)學院河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,河北 承德 067000)

高脂血癥(hyperlipidemia,HLP),常被稱為高血脂,醫(yī)學上也稱為血脂異常(dyslipidemia),通常指血漿中甘油三酯(TG)和(或)總膽固醇(TC)升高,包括低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[1]。HLP分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。原發(fā)性與先天和遺傳有關,是由基因缺陷,參與脂蛋白轉(zhuǎn)運和代謝的受體、酶或載脂蛋白異常,或由環(huán)境或未知因素引起;繼發(fā)性多發(fā)生于代謝性紊亂疾病(糖尿病、高血壓等),或與年齡、飲食、精神、情緒活動等其他因素有關。臨床上表現(xiàn)為真皮內(nèi)脂質(zhì)沉積引起的黃色瘤和脂質(zhì)在血管內(nèi)皮沉積引起的動脈硬化。目前,現(xiàn)代醫(yī)學治療HLP的藥物以降低TC和LDL-C為主的有他汀類和樹脂類,以降低TG為主的有貝特類和煙酸類[2-3]。這幾類西藥都有一定的降脂作用,但對于一些不耐受降脂藥的患者長期服用后可能會出現(xiàn)肌肉疼痛或肝腎損傷,甚至死亡。相比西藥,中藥在改善高脂血癥方面有一定優(yōu)勢,中醫(yī)治療高血脂的藥物如山楂、茯苓、丹參和澤瀉等副作用較小,對人體的損害相對減少[4-5]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的進步,中醫(yī)中藥在調(diào)節(jié)血脂方面的作用日益突出,中藥治療高脂血癥的研究也備受關注。

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge),薔薇科山楂屬,分布于河北、山東、河南等地。性味酸甘,微溫。具有降血脂、降血壓、強心和抗心律不齊等作用,也是健脾、開胃、消食、活血化痰的良藥,對胸膈脾滿、血淤、閉經(jīng)等癥狀有很好的療效[6]。山楂中的有效成分有機酸、黃酮是其發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)基礎,能抑制肝臟膽固醇的合成,促進肝臟對血漿中膽固醇的吸收,從而起到降血脂的作用。研究發(fā)現(xiàn)山楂黃酮可顯著降低實驗性高血脂動物的TC、LDL-C和載脂蛋白的濃度,顯著升高HDL-C和載脂蛋白濃度,但對TG影響較小。山楂黃酮還可降低動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的風險,起到預防AS的作用[6]。

網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)生物學理論的基礎上,通過網(wǎng)絡對生物系統(tǒng)進行分析,選擇特定信號節(jié)點進行多靶點藥物分子設計的一門新興學科。分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間相互作用的方式來進行藥物設計,主要研究分子間(如配體和受體)相互作用,并預測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[7]。本文基于網(wǎng)絡藥理學,采用分子對接技術(shù)探究山楂治療高脂血癥的作用機制,為后續(xù)山楂治療高脂血癥的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 山楂成分的收集和靶點預測以“山楂”或“shanzha”為檢索詞在HERB、ETCM、SymMap和BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫獲得山楂所有的化學成分并去重,再去除同分異構(gòu)體。將篩選出的山楂的各個成分輸入PubChem數(shù)據(jù)庫獲得每個成分的SMILE結(jié)構(gòu),導入SwissTargetPretiction數(shù)據(jù)庫,預測出各個成分對應的靶點。最后利用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點基因進行標準化[8-9]。

1.2 高脂血癥靶點的收集以“hyperlipemia”為檢索詞,分別在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫收集疾病的相關靶點并去重,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點基因進行標準化[10]。

1.3 山楂-高脂血癥交集靶點的收集取山楂和高脂血癥的共同靶點,作為山楂治療HLP的潛在靶點,利用Venny 2.1在線工具繪制韋恩圖[11]。

1.4 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與核心靶點的收集將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫設置物種為“Homo sapiens”,最低相互作用評分設為0.4,刪除游離節(jié)點,獲取PPI網(wǎng)絡圖,將其tsv文件導入Cytoscape 3.9.1軟件。使用Centiscape 2.2插件進行網(wǎng)絡拓撲分析,選取兩輪操作均滿足大于度中心性“Degree Centrality,DC”、接近中心性“Closeness Centrality,CC”和介數(shù)中心性“Betweenness Centrality,BC”這3個參數(shù)的節(jié)點作為關鍵靶點,構(gòu)建關鍵靶點的網(wǎng)絡拓撲圖。將準備好的成分-靶點的數(shù)據(jù)與屬性文件導入Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建成分-靶點的網(wǎng)絡拓撲圖[12]。

1.5 GO生物過程和KEGG信號通路富集分析將山楂-高脂血癥交集基因提交到DAVID數(shù)據(jù)庫,選擇物種為智人“Homo sapiens”,進行GO和KEGG富集分析,獲得生物過程(BP)、細胞成分(CC)、分子功能(MF)和關鍵信號通路的富集信息,借助微生信網(wǎng)站繪制相關分析圖[13-14]。

1.6 分子對接驗證將與山楂防治HLP相關的6個活性成分和12個關鍵靶點進行分子對接。從PDB、PubChem數(shù)據(jù)庫獲取受體蛋白和配體的結(jié)構(gòu)文件,通過閱讀相關文獻選擇合適的受體蛋白,運用Open Babel GUI、AutoDockTools-1.5.7軟件對受體蛋白和小分子配體進行預處理,獲得相應的pdbqt文件,確定活性口袋位置,設置對接參數(shù)。運行AutoDockTools-1.5.7軟件進行分子對接,通過PyMOL軟件將對接結(jié)果可視化,獲得相應的對接結(jié)果模式圖[15]。

1.7 基因在正常人體的組織分布情況通過BioGPS數(shù)據(jù)庫收集山楂-高脂血癥靶基因中的188個交集基因在正常人體組織的分布信息,計算各組織器官表達量的平均值和平均值的中位值,篩選大于中位值的組織器官,分析處理數(shù)據(jù),利用Cytoscape 3.9.1軟件繪制交集基因在與HLP相關組織器官上的分布圖[16-17]。

2 結(jié)果

2.1 確定山楂有效成分和靶點HERB、ETCM、SymMap和BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫中檢索到山楂所有的化學成分274個,去除重復項和同分異構(gòu)體后,篩選出有效成分69個(見表1)。通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲得各個成分的SMILE結(jié)構(gòu),用SwissTargetPretiction數(shù)據(jù)庫預測出各個成分對應的靶點并將其標準化,即將蛋白質(zhì)名稱(UniProt KB)統(tǒng)一為基因名,得到628個與山楂化學成分相關的基因。

表1 山楂的有效成分

2.2 確定高脂血癥靶點檢索“hyperlipemia”,在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中搜集所有與HLP相關的靶基因,刪除重復基因后得到1 552個,再用UniProt數(shù)據(jù)庫將基因標準化。

2.3 獲得山楂-高脂血癥交集靶點及韋恩圖1 552個HLP靶點與山楂活性成分的628個靶點取交集,得到188個交集基因即山楂治療HLP的潛在作用靶點,使用Venny 2.1在線工具繪制成分-疾病靶點韋恩圖(見圖1)。

圖1 成分-靶點韋恩圖

2.4 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡與核心靶點將188個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫,分析得到PPI蛋白互作網(wǎng)絡,篩選出12個關鍵靶點,繪制其網(wǎng)絡拓撲圖(見圖2)。圖中節(jié)點代表靶點,連線表示節(jié)點之間的關系,連線越多靶點關系越密切,靶點大小隨度值大小而變化,度值越大節(jié)點越大,與山楂治療HLP的相關性越大,由關鍵靶點的網(wǎng)絡拓撲圖可知AKT1、TNF和IL-6等基因可能與治療HLP高度相關。將成分-靶點的數(shù)據(jù)與屬性文件導入Cytoscape 3.9.1軟件,繪制成分-靶點的網(wǎng)絡拓撲圖(見圖3),通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡得到35個化學成分與188個交集靶點有連線,即這35個成分與治療HLP有關(見表2)。圖中成分節(jié)點隨度值大小而改變,成分的度值越大,和HLP的關聯(lián)就越密切,根據(jù)成分-靶點網(wǎng)絡拓撲圖和表2,槲皮素、亞油酸等可能是山楂治療HLP的核心成分。

圖2 關鍵靶點網(wǎng)絡拓撲圖

圖3 成分-靶點網(wǎng)絡拓撲圖

表2 山楂治療HLP的有效成分

2.5 GO生物過程和KEGG信號通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO和KEGG富集分析。GO分析得到667個生物學過程、76個細胞組分和166個分子功能。根據(jù)富集度(enrichment score)的數(shù)值分別選擇前10個生物學過程,細胞組分和分子功能通過微生信網(wǎng)站繪制GO term BP、CC、MF三合一柱狀圖(見圖4)。研究表明,富集度數(shù)值越大該GO term越易受到實驗因素的影響。生物學過程包括正調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、正調(diào)控基因表達和信號轉(zhuǎn)導等方面;細胞組分有質(zhì)膜、細胞溶質(zhì)、細胞質(zhì)和細胞核等;分子功能包括蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合和鋅離子結(jié)合等方面。結(jié)合柱狀圖可以看出對藥物的反應、正調(diào)控基因表達和蛋白磷酸化等生物學過程,膜、細胞外間隙、胞外區(qū)和胞外外泌體等細胞組分,RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性,配體激活序列特異性DNA結(jié)合、酶結(jié)合和序列特異性DNA結(jié)合等分子功能在各范圍內(nèi)的富集度數(shù)值較高,可能對治療HLP產(chǎn)生較大影響[3]。KEGG富集分析得到201條通路,根據(jù)P值和Count值選擇前20個信號通路通過微生信平臺繪制氣泡圖(見圖5)。研究表明,-log10(P值)越大,P值越小,該通路的作用越顯著。結(jié)合氣泡圖,圓點由綠色向紅色過渡,P值逐漸較小,顏色越紅的圓點代表的通路表示該通路在治療HLP中的作用可能比較明顯,該通路上靶基因富集程度越高。Count值表示在該條通路上富集的基因數(shù),Count越大該通路上富集的基因數(shù)越多[18]。富集顯著的通路有脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路(lipid and atherosclerosis)、癌癥通路(pathways in cancer)和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等。

圖4 GO term BP、CC、MF三合一柱狀圖

圖5 信號通路氣泡圖

2.6 分子對接驗證將山楂的12個關鍵靶點與治療HLP的6個主要活性成分進行分子對接,得到分子對接的最低結(jié)合能(見表3)。研究表明,低于-5.0 kcal·mol-1的對接親和力分數(shù)是表明化合物與其靶基因之間存在強結(jié)合相互作用的標準,親和力分數(shù)小于-1.2 kcal·mol-1的分子對接結(jié)果表現(xiàn)為良好。本文的對接結(jié)果顯示,除了VEGFA與蔗糖對接結(jié)果較差,結(jié)合能小于-1.2 kcal·mol-1,其余的配體和受體對接結(jié)果良好[13]。對接結(jié)果表明山楂的主要活性成分對治療HLP的關鍵靶點有一定的調(diào)控作用。通過PYMOL軟件對對接結(jié)果進行處理,得到了分子對接模式圖(見圖6),其中藍色部分是與氫鍵連接的氨基酸殘基,旁邊數(shù)字標注為氨基酸名稱,黃色部分為氫鍵,旁邊數(shù)字標注為氫鍵長度。

圖6 部分分子對接模式圖

表3 分子對接結(jié)果

2.7 基因在正常人體的組織分布利用Excel和Cytoscape 3.9.1軟件繪制出山楂-高脂血癥的交集基因在人體組織分布圖(見圖7～8)。以基因在組織器官中的表達量大于其平均值的一倍中位值為標準,篩選出心臟、肝臟、肺、全血、骨骼肌、前列腺、甲狀腺和腎臟等可能與山楂治療HLP相關性大的組織器官。通過柱狀圖可知,188個交集基因中有超過135個基因在心臟、肝臟、肺、全血、骨骼肌、前列腺和甲狀腺中,說明山楂的有效成分可能通過這幾個組織器官發(fā)揮作用來治療HLP的。而腎臟上富集的基因數(shù)量較少,僅有44個,說明基因在腎臟上的表達情況不是很好。

圖7 山楂-高脂血癥交集基因的組織分布圖

圖8 山楂-高脂血癥交集基因的組織分布柱狀圖

3 討論與結(jié)論

本文通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)分析了山楂的活性成分,探究了山楂治療HLP的靶點蛋白和關鍵通路之間的聯(lián)系,初步探討了山楂治療HLP的作用機制。本文共收集69種山楂的活性成分,35種與治療HLP有關,其中槲皮素、亞油酸和阿里紅酸等化合物度值較高,與治療HLP相關性較大。槲皮素是一種黃酮類化合物,具有降血脂、抗氧化和抗炎等多種藥理作用,可以降低主動脈和肝臟組織的脂質(zhì)水平,降低肝臟中總膽固醇和甘油三酯水平,能調(diào)節(jié)血脂代謝,抑制肝臟脂肪沉積,從而對HLP起到防治作用[19]。亞油酸作為一種不飽和酸,能與膽固醇結(jié)合形成酯,通過降低體脂含量、肝臟中低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和甘油三酯的水平來治療HLP[20]。

山楂的有效成分與HLP的188個交集靶點在心臟、肝臟、肺、全血、骨骼肌、前列腺和甲狀腺等組織器官的表達情況良好,說明山楂治療HLP可能是通過這幾個組織器官發(fā)揮作用。通過PPI網(wǎng)絡分析,篩選出12個治療HLP的關鍵靶點,有白細胞介素(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶(AKT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體的編碼基因(PPARG)和內(nèi)皮一氧化氮合成酶(NOS3)等。有研究表明,蛋白激酶(AKT)在許多組織中均有表達,是PI3K-AKT通路中的關鍵靶點,AKT1是AKT的一種亞型,能夠參與細胞代謝、生長、增殖、胰島素信號傳導、血管生成以及和HLP相關的多種生物學過程[19];NOS3可以參與精氨酸和脯氨酸的代謝,催化一氧化氮(NO)的生成,NO作為一種內(nèi)皮舒張因子,可使血管舒張,調(diào)節(jié)血流,抑制血管平滑肌細胞增殖,抑制血小板和白細胞的黏附,參與多種疾病的病理生理過程[21]。山楂的有效成分在脂質(zhì)與動脈粥樣硬化形成過程中能夠上調(diào)AKT1,協(xié)同PI3K(胞內(nèi)磷脂酰基醇基酶)和NOS3參與細胞凋亡、細胞增殖以及血脂調(diào)節(jié)的過程,從而發(fā)揮治療HLP的作用。研究發(fā)現(xiàn),IL-6和TNF為重要的促炎因子,與HLP密切相關,它們能夠促進脂肪細胞凋亡,抑制脂肪細胞分化與合成,刺激脂肪細胞脂質(zhì)加速分解,導致胰島素抵抗,促進動脈粥樣硬化,增加患HLP的可能[18];PPARG是脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡中一類轉(zhuǎn)錄因子PPARs的其中一種亞型,可以通過與特異DNA序列結(jié)合調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄,李濤等[21]研究發(fā)現(xiàn)PPARG表達的增加同時還能抑制炎癥因子,在脂質(zhì)的分解代謝方面尤為重要,能夠促進脂肪細胞攝取脂肪酸,進而影響脂肪細胞中甘油三酯的生成。山楂的活性成分能夠富集到與IL-6、TNF和PPARG等基因相關的通路上,通過增加PPARG的表達,激活相應的調(diào)控因子,促進脂質(zhì)代謝,降低血脂,同時下調(diào)IL-6和TNF,抑制炎癥發(fā)生,調(diào)節(jié)血脂,從而達到治療HLP的目的,體現(xiàn)了山楂治療HLP多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點,為后期治療HLP的臨床實驗驗證提供參考。