丁瑤瑤 沖喜會 魏林珍綜述 朱姣姣 張倩倩 陳 凡 秦天生審校

2018年全球癌癥統(tǒng)計,宮頸癌被公認(rèn)為第二大最常見的惡性腫瘤,其死亡率在女性中位居第二[1]。宮頸癌在中低收入國家的發(fā)病率和死亡率較高[2],其中印度(病例:97000,死亡:60000)和中國(病例:106000,死亡:48000)加起來占全球?qū)m頸癌的三分之一以上[3]。盡管人乳頭瘤病毒的疫苗和篩查廣泛應(yīng)用于臨床,但臨床中宮頸癌的診斷和治療仍備受關(guān)注。

近幾十年來,RNA的表觀遺傳調(diào)控已成為一個熱門話題,RNA m6A修飾在癌癥研究中已發(fā)展成為最熱門的領(lǐng)域之一。表觀遺傳調(diào)控抑制劑,如氮胞苷和地西他濱,是DNA甲基化的兩種抑制劑,在臨床應(yīng)用中顯示出巨大的抗癌效果。在人類癌癥中常發(fā)生m6A修飾的失調(diào),其主要通過調(diào)控癌癥基因表達來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長行為和惡性程度。近年來許多研究表明異常的m6A修飾與宮頸癌進展和患者預(yù)后密切相關(guān)。Ma等[4]證明了13種主要的m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子中在306個宮頸癌組織中根據(jù)不同臨床病理特征分層的大多數(shù)中有不同的表達,并確定了兩個宮頸癌亞組命名為RM1/2;與RM1相比,RM2的預(yù)后較差,總生存率(OS)較低,表明m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子與宮頸癌密切相關(guān),因此我們使用m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子衍生出一種風(fēng)險標(biāo)記物,它不僅是一種獨立的預(yù)后標(biāo)記物,而且可以預(yù)測宮頸癌的臨床病理特征。研究證明了METTL3和CD33+在宮頸癌中關(guān)系的綜合結(jié)果,并揭示了METTL3在體外可誘導(dǎo)直接的髓源性抑制細胞(MDSC)和腫瘤相關(guān)的MDSC分化;結(jié)果表明,這兩種生物標(biāo)志物都是預(yù)后的不良指標(biāo)并且可能在宮頸癌的微環(huán)境中有重要作用,該研究可能為進一步研究METTL3在宮頸癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)MDSC介導(dǎo)的免疫抑制機制提供線索[5]。因此,作用于m6A修飾調(diào)節(jié)因子可能是有希望且具有潛力的宮頸癌治療靶點。

1 m6A

1.1 m6A的功能

N6-甲基腺苷(m6A)作為真核細胞mRNA中最常見的化學(xué)修飾之一,影響無數(shù)生命的過程,如在胚胎干細胞分化[6]、大腦發(fā)育[7]、突觸可塑性[8]、造血[9]和癌癥進展中起著關(guān)鍵作用[10]。N6甲基腺苷(m6A)修飾是mRNA21腺苷堿基第6個氮位的甲基化[11]。m6A甲基化可由甲基轉(zhuǎn)移酶催化,如METTL3/14/16(“編寫者”),由去甲基酶FTO和ALKBH5(“橡皮擦”)去除,并與m6A結(jié)合蛋白相互作用,如YTHDF1/2/3和IGF2BP1/2/3(“閱讀器”)[11]。m6A修飾在由甲基轉(zhuǎn)移酶或甲基轉(zhuǎn)移酶操作的mRNA上是動態(tài)可逆的?？傊?m6A書寫器、擦除器和讀取器的表達水平調(diào)節(jié)人類癌細胞中的RNA甲基化?？赡娴腞NA甲基化通過其對轉(zhuǎn)錄、剪接、mRNA穩(wěn)定性和翻譯速率的影響,調(diào)節(jié)癌細胞的基本特征[12]。

1.2 m6A在人類癌癥中的作用

許多研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),尤其在人類癌癥中對癌細胞的調(diào)節(jié)更為明顯。在乳腺癌干細胞(BCSCs)中,NANOG mRNA中m6A的水平因缺氧依賴性ALKBH5上調(diào)而降低,從而提高了BCSCs的穩(wěn)定性和NANOG蛋白水平[13]。將膠質(zhì)母細胞瘤中的METTL3或METTL14基因敲除,使ADAM19、EPHA3和KLF4等幾種癌基因的表達水平上調(diào),而這幾種癌基因在過度表達METTL3或METTL14的膠質(zhì)母細胞瘤中表達水平下調(diào);通過m6A免疫沉淀證實了ADAM19 mRNA的m6A水平的變化[14]。FTO是m6A的去甲基化酶,研究者發(fā)現(xiàn)通過降低mRNA轉(zhuǎn)錄物中的m6A水平,調(diào)控錨蛋白重復(fù)行列和含SOCS盒2(ASB2)和維甲酸受體α(RARA)等靶基因的表達,使白血病癌基因介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化增強和白血病發(fā)生并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)的AML細胞分化;ASB2和RARA在正常造血過程中上調(diào),是ATRA誘導(dǎo)白血病細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,表明FTO對ASB2和RARA表達的抑制有助于急性髓系白血病細胞對ATRA治療的反應(yīng)[15]。METTL14的敲除使RNA中m6A水平降低并增加了體內(nèi)外的腫瘤轉(zhuǎn)移,另外METTL14下降是肝細胞癌的不良預(yù)后因素;METTL14被證實與微處理器蛋白DGCR8相互作用,并以m6A依賴的方式積極調(diào)節(jié)初級microRNA-126過程。這項研究表明,RNA中的m6A模式參與了腫瘤生物學(xué),METTL14和microRNA信號之間的相互作用可能指向HCC的一個可能治療靶點[16]。在肝細胞癌中m6A調(diào)節(jié)器的去調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率來調(diào)節(jié)不同下游靶點的表達,需要進一步的研究來解決m6A修飾和m6A調(diào)節(jié)因子在肝癌發(fā)展中的異質(zhì)性和復(fù)雜性[17]。Fan等[18]研究發(fā)現(xiàn)METTL14在胃癌組織樣本中下調(diào),在體外和體內(nèi)METTL14的異位表達顯著抑制胃癌細胞的生長和侵襲,而METTL14的敲除具有相反的作用,circORC5確定為METTL14的下游靶點,METTL14的沉默降低了circORC5的m6A水平但增加了circORC5的表達,表明METTL14低表達是胃癌患者生存率低的一個預(yù)測因素。m6A由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和METTL16(編寫者)催化,被去甲基酶FTO和ALKBH5(清除器)去除,并與m6A結(jié)合蛋白相互作用,如YTHDF1和IGF2BP1(讀取器),RNA甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和M6A結(jié)合蛋白在多種器官來源的人類癌癥組織中經(jīng)常上調(diào),增加癌轉(zhuǎn)錄物和癌蛋白表達、癌細胞增殖、存活、腫瘤起始、進展和轉(zhuǎn)移[11]。Huang等[19]分析了轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中21種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)劑的表達和預(yù)后價值,并利用RBM15沉默和過度表達前后的體外細胞學(xué)實驗以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型進一步驗證了這些調(diào)節(jié)劑,發(fā)現(xiàn)m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶RBM15在骨肉瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。Shen等[20]首次深入了解了m6A修飾的lncRNA在透明細胞腎細胞癌中的功能和機制,并確定了透明細胞腎細胞癌進展中的“METTL14-YTHDC1-Lnc-LSG1”調(diào)節(jié)軸,強調(diào)了METTL14和lncRNA m6A修飾在透明細胞腎細胞癌發(fā)展中的重要作用。以上研究充分說明了m6A在人類癌癥中的重要影響,因此為了遏制癌癥對人類生命的威脅需要進一步對其進行研究。

2 m6A在宮頸癌中的作用機制

m6A RNA修飾通過調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄、剪接、加工、翻譯和衰變發(fā)揮作用,并參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Geng等[21]研究發(fā)現(xiàn)METTL14的下調(diào)抑制了SiHa和C33a細胞的增殖、遷移和侵襲能力,沉默METTL14可誘導(dǎo)宮頸癌細胞的細胞周期停滯;METTL14基因敲除通過降低Akt和mTOR的磷酸化來抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,并且下游凋亡相關(guān)蛋白的表達也受到影響,這些數(shù)據(jù)表明METTL14在HPV陽性和HPV陰性宮頸癌細胞的生長和侵襲中起著重要的致癌作用。Li等[22]研究證明m6A可以通過調(diào)節(jié)PDK4來調(diào)節(jié)癌細胞的糖酵解,5′UTR的甲基化對m6A介導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定性和翻譯至關(guān)重要;由于大量基因參與細胞代謝,不能排除m6A修飾通過間接靶向其他基因來調(diào)節(jié)代謝過程的可能性,該研究表明,m6A通過誘導(dǎo)PDK4調(diào)節(jié)宮頸癌的糖酵解。METTL3在宮頸癌組織和細胞中顯著上調(diào),這與宮頸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[23]。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)了METTL3在宮頸癌致癌和糖酵解效應(yīng)中的關(guān)鍵作用,m6A修飾的HK2 mRNA受m6A讀取器蛋白YTHDF1調(diào)節(jié),該蛋白識別m6A并增強靶轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性,METTL3招募YTHDF1來調(diào)節(jié)HK2 mRNA的穩(wěn)定性,通過加速糖酵解,通過YTHDF1/HK2軸發(fā)揮致癌作用,從而為宮頸癌提供一個潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)YTHDF1在宮頸癌中高表達,并且與宮頸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。YTHDF1基因敲除抑制宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡,也抑制了宮頸癌細胞在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生。通過對YTHDF1基因敲除后RIP-seq、meRIP-seq和Ribo-seq的聯(lián)合在線數(shù)據(jù)分析,RANBP2被確定為YTHDF1在宮頸癌細胞中的關(guān)鍵靶點;YTHDF1以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)RANBP2翻譯而不影響其mRNA表達,RANBP2促進宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲,該研究說明通過調(diào)節(jié)的表達證明了YTHDF1在宮頸癌中的致癌作用。E6/E7可以通過IGF2BP2介導(dǎo)的m6A-MYC mRNA在體外和體內(nèi)的調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的有氧糖酵解。細胞代謝是一個涉及眾多基因活性的復(fù)雜過程,不能排除E6/E7也可能通過以IGF2BP2依賴的方式影響miRNA(而非MYC)的甲基化狀態(tài)來靶向有氧糖酵解[25]。Hu等[25]人發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7/IGF2BP2/m6A MYC/糖酵解軸可能在宮頸癌的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用,這表明靶向HPV E6/E7及其下游通路可能是治療該癌癥患者的一個有吸引力的治療選擇。N6-甲基腺苷(m6A)異常修飾影響宮頸癌細胞的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后,異常的m6A調(diào)節(jié)因子可能確定為治療宮頸癌新的藥物靶點。

3 RNA靶向m6A在宮頸癌治療中的潛力

隨著表觀遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,新型m6A甲基化修飾越來越受到關(guān)注。近年來,許多研究說明了m6A可能與lncRNA一起參與宮頸癌的發(fā)病機制。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比,宮頸癌組織中GAS5-AS1的表達顯著降低,且GAS5-AS1的下調(diào)與晚期FIGO分期、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后顯著相關(guān)。GAS5-AS1在體外顯著降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,在體內(nèi)顯著抑制宮頸癌的致瘤性和轉(zhuǎn)移;GAS5-AS1與腫瘤抑制因子GAS5相互作用,并通過與RNA去甲基化酶ALKBH5相互作用和減少GAS5 N6甲基腺苷(m6A)修飾來增加其穩(wěn)定性,m6A介導(dǎo)的GAS5 RNA降解依賴于m6A讀取器蛋白YTHDF2依賴的途徑;因此研究者發(fā)現(xiàn)了宮頸癌癌變和轉(zhuǎn)移中表觀遺傳學(xué)改變的一個重要機制。ZFAS1在宮頸癌組織中顯著上調(diào),ZFAS1的升高與晚期FIGO分期、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān),也表明宮頸癌患者的總體生存率較低[27]。Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)ZFAS1在體外促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲,在體內(nèi)促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移;ZAFS1隔離了miR-647,這種RNA-RNA相互作用受METLL3介導(dǎo)的m6A修飾的調(diào)節(jié)。以上研究說明ZFAS1及其m6A修飾在宮頸癌細胞中的功能作用,并表明ZFAS1可能是宮頸癌治療的一個有希望的靶點。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA KCNMB2-AS1在宮頸癌中顯著過度表達,并與不良預(yù)后相關(guān),KCNMB2-AS1的缺失顯著抑制宮頸癌細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[28]。體內(nèi)異種移植模型顯示敲除KCNMB2-AS1明顯延遲腫瘤生長; KCNMB2-AS1作為競爭性內(nèi)源性RNA大量海綿狀miR-130b-5p和miR-4294,導(dǎo)致IGF2BP3的上調(diào),IGF2BP3是宮頸癌中一個已被證實的癌基因,其能夠通過KCNMB2-AS1上的3個N6甲基腺苷(m6A)修飾位點結(jié)合KCNMB2-AS1,其中IGF2BP3充當(dāng)m6A“讀取器”并穩(wěn)定KCNMB2-AS1;因此,KCNMB2-AS1和IGF2BP3形成了一個正調(diào)節(jié)回路,擴大了KCNMB2-AS1在宮頸癌中的致瘤作用[28]。FOXD2-AS1在宮頸癌細胞和組織中的表達顯著上調(diào),這與不良預(yù)后密切相關(guān)[29]。在功能方面,功能獲得和功能喪失分析顯示FOXD2-AS1促進宮頸癌細胞的遷移和增殖,FOXD2-AS1沉默抑制了體內(nèi)腫瘤的生長;m6A甲基轉(zhuǎn)移酶-甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(METTL3)增強了FOXD2-AS1的穩(wěn)定性并維持其表達;FOXD2-AS1將賴氨酸特異性去甲基酶1(LSD1)招募到p21的啟動子區(qū)域,以抑制其轉(zhuǎn)錄豐度;以上研究說明了METTL3/FOXD2-AS1通過m6A依賴方式加速宮頸癌的進展[29]。研究表明miR-193b較低的表達與更晚期的宮頸癌分期和更深的間質(zhì)浸潤密切相關(guān)[30]。miR-193b是一種腫瘤抑制因子,受宮頸腫瘤中m6A甲基化的調(diào)節(jié),METTL3以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)miR-193b成熟過程,通過CCND1靶向在體內(nèi)和體外重新引入miR-193b可顯著抑制宮頸癌細胞的增殖,說明m6A相關(guān)的miR-193b下調(diào)通過靶向CCND1促進宮頸癌的侵襲性[30]。Ji等[31]研究發(fā)現(xiàn)新的m6A修飾的circRNA(circARHGAP12,hsa_circ_0000231)在宮頸癌組織和細胞中上調(diào),circARHGAP12的m6A修飾可以放大其富集;實驗表明circARHGAP12在體內(nèi)外均促進了宮頸癌的進展,MeRIP-Seq表明FOXM1 mRNA中有一個顯著的m6A位點,CircARHGAP12與m6A讀取器IGF2BP2相互作用與FOXM1 mRNA結(jié)合,從而加速FOXM1 mRNA的穩(wěn)定性;該研究說明circARHGAP12通過m6A依賴IGF2BP2/FOXM1途徑在宮頸癌進展中發(fā)揮致癌作用。Chen等[32]研究了hsa_circ_0000069(circ0000069)對宮頸癌的促瘤作用及其作用機制,發(fā)現(xiàn)circ0000069在宮頸癌細胞和組織中上調(diào),N6-甲基腺苷(m6A)修飾保持了circ0000069的穩(wěn)定性,circ0000069促進頸癌細胞增殖和遷移;miR-4426特異性結(jié)合circ0000069并介導(dǎo)其在宮頸癌發(fā)育中的功能,circ0000069部分上調(diào)是由于m6A修飾,其通過宮頸癌中的海綿狀miR-4426促進細胞增殖和遷移。piRNA-14633在宮頸癌組織和細胞中高表達,piRNA-14633模擬物(piRNA-14633過度表達)促進CaSki細胞和SiHa細胞的存活、增殖、遷移和侵襲,piRNA-14633模擬增加了m6A RNA甲基化水平和METTL14 mRNA穩(wěn)定性;METTL14是piRNA-14633的定向靶基因,用siRNA敲除METTL14可減弱宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲;piRNA-14633增加了CYP1B1的表達而METTL14的沉默削弱了其表達。piRNA過度表達對METTL14表達的影響具有濃度依賴性,體內(nèi)實驗結(jié)果表明piRNA-14633促進宮頸腫瘤生長,說明piRNA-14633通過METTL14/CYP1B1信號軸促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,突出了piRNA-14633在宮頸癌中的重要作用[33]。以上研究說明了m6A修飾和RNA在宮頸癌中的共同作用影響了宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移,因此我們可以通過以上的結(jié)果進行進一步研究,通過調(diào)節(jié)m6A和RNA之間相互作用的途徑來阻礙宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上,m6A書寫器、擦除器和讀取器的表達水平調(diào)節(jié)人類癌細胞中的RNA甲基化情況,可逆的RNA甲基化通過對轉(zhuǎn)錄、剪接、mRNA穩(wěn)定性和翻譯速率的影響,調(diào)節(jié)癌細胞的基本特征[12]。在宮頸癌中,m6A修飾促進了癌細胞的增殖、侵襲、遷移以及腫瘤的惡行性。另外,研究應(yīng)該集中在m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和METTL16及其伙伴蛋白、去甲基酶FTO和ALKBH5以及m6A閱讀器YTHDF1-3、YTHDC1-2和IGF2BP1-3的致癌作用機制上,以便為靶向治療提供新的、更具體和有效的策略[11]。另外,m6A調(diào)節(jié)因子在腫瘤免疫治療和免疫逃避中被廣泛研究。腫瘤免疫治療是最有前途的治療策略,m6A修飾介導(dǎo)的免疫侵襲成為婦科腫瘤發(fā)病機制和預(yù)后研究的熱點[34]。然而,m6A修飾在婦科腫瘤中介導(dǎo)的免疫侵襲的研究仍處于起步階段,在未來的研究中,m6A修飾有望在這一領(lǐng)域取得新的突破[34]。因此,把m6A修飾酶或者靶向的RNA作為研究靶點,阻斷或者沉默其研究靶點將是宮頸癌有力的潛在治療策略。我們相信在不久的將來,越來越多的新型、特異、有效的m6A修飾抑制劑和激活劑將被開發(fā)并批準(zhǔn)用于臨床。