李梅方，唐國文，劉正杰，王 一，李成云，董玉梅**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

白粉菌是子囊菌門(Ascomycota)盤菌亞門(Pezizomycotina)錘舌菌綱(Leotiomycetes)白粉菌目(Erysiphales)真菌的統(tǒng)稱，是一類分布廣泛的專性寄生植物病原菌[1-2]。常引起重要的植物病害，在全球范圍內(nèi)感染超過10 000種雙子葉和單子葉植物，涉及約900 種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物[3-5]。白粉菌嚴(yán)格地專性寄生于活體植物，在寄主植物上完成生長和繁殖，目前仍不能通過人工培養(yǎng)，其寄主范圍的變化直接導(dǎo)致生態(tài)位分離，從而可能觸發(fā)誘發(fā)白粉菌的新物種形成[6]。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)一年生或多年生雙子葉植物[7]，截至目前已有22 個(gè)種[8-9]?？嗍w為蕎麥栽培種之一，在中國主產(chǎn)于西北、東北、華北和西南一帶高寒山區(qū)[10]。據(jù)《中國農(nóng)村統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2017 年全國苦蕎年產(chǎn)量達(dá)到5.39×105t，種植面積和產(chǎn)量均居世界第1 位，是重要的糧食作物[11]。自2018 年以來，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)蕎麥實(shí)驗(yàn)種植區(qū)和云南蕎麥種植區(qū)一直觀察到白粉病，嚴(yán)重時(shí)基本絕收。本研究通過形態(tài)鑒定以及核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)和核糖體大亞基(ribosomal large subunit，LSU)序列分析，明確苦蕎白粉病的病原類型及分類地位，為防治苦蕎白粉病提供依據(jù)，也為大田作物布局時(shí)避開白粉菌跨寄主的近距離接觸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集與保存

從云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地采集苦蕎白粉病病葉，將病葉裝入自封袋置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于形態(tài)觀察及和分子生物學(xué)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間癥狀調(diào)查

觀察記錄植株發(fā)病部位、病斑顏色和大小、危害程度等[12-13]。

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察及致病性檢測

參考BRAUN 等[3]、KIRK 等[14]以及《中國真菌志》[15]對(duì)白粉菌無性型進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類。在數(shù)碼顯微鏡Smart zoom 5 (廣州行真科技設(shè)備)下觀察病葉的白粉菌分生孢子形態(tài)特征，測量大小并拍照；用掃描電子顯微鏡FlexSEM 1000 (日立高新技術(shù)設(shè)備)觀察分生孢子形態(tài)、著生方式及表面形態(tài)特征。

按照科赫法則測定白粉菌的致病性并進(jìn)行確認(rèn)[16]。將苦蕎感染葉片打成直徑6 mm 的葉盤，置于5 周齡健康苦蕎葉片正面和背面，葉盤上含有大量孢子，各接種5 株植物；將接種植株置于20～25 ℃、相對(duì)濕度80%、光照周期12 h∶12 h的溫室培養(yǎng)，將5 株未接種的對(duì)照植株種植于相同環(huán)境條件的另一個(gè)生長室中，用聚乙烯袋罩住處理和對(duì)照植株48 h，觀察發(fā)病癥狀和病原菌形態(tài)。

1.2.3 病原菌ITS、LSU 片段的PCR 擴(kuò)增和測序

將病菌樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，用Chelex-100 法提取白粉菌DNA[17]，利用真菌通用引物ITS 和LSU進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[18]；LROR：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′；LR5：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)[19]。PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL，包括2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)32 次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收備用。參照pTOPO-Blunt Simple 平末端載體試劑盒說明書與TreliefTM5α 感受態(tài)細(xì)胞連接轉(zhuǎn)化，菌液用PCR確定陽性克隆后送至擎科生物有限公司測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

在GenBank 上對(duì)測序序列進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)；為比較不同寄主白粉菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從GenBank 中下載相似性高于97%的ITS 片段，采用MEGA 7.0 軟件對(duì)序列進(jìn)行最大似然法系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)行1 000 次重復(fù)的BS 分析，構(gòu)建進(jìn)化樹[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎白粉病田間癥狀

苦蕎白粉病發(fā)病早期，主要在病葉背面出現(xiàn)不規(guī)則的白色粉塵狀菌落，葉面出現(xiàn)褪綠小點(diǎn)；隨著病情發(fā)展，菌落變得豐富，覆蓋整個(gè)葉片背面，并且在葉正面也形成白色菌斑，繼而葉片正面失綠黃化，嚴(yán)重時(shí)可危害花和果實(shí)。感病葉片輕者褪綠、黃化、卷曲、皺縮，嚴(yán)重時(shí)葉片畸形、質(zhì)地變硬、失去光澤、干枯(圖1)。

圖1 苦蕎白粉病癥狀Fig.1 Powdery mildew symptoms in tartary buckwheat

2.2 苦蕎白粉菌的形態(tài)特征及致病性

苦蕎白粉菌分生孢子呈圓筒形或橢圓形，無色，透明，兩端圓，單胞，表面有皺紋；長28.0～50.9 μm，寬 11.3～19.9 μm，平均大小為39.1 μm×15.3 μm (n=100)(圖2)。根據(jù)形態(tài)特征初步將病原菌鑒定為子囊菌門(Ascomycota)白粉菌目(Erysiphales)白粉菌屬(Erysiphe)真菌[16]。

圖2 顯微鏡(a)和電鏡(b 和c)下的苦蕎白粉菌分生孢子Fig.2 Conidia of powdery mildew collected from tartary buckwheat under microscope (a) and electron microscope (b and c)

苦蕎健康葉片接種病原7 d 后，在接種植株上觀察到與田間感病植株一致的癥狀，而對(duì)照植株則無發(fā)病癥狀(圖3)。接種發(fā)病葉片病原菌再經(jīng)顯微觀察表明：其菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征與采集的苦蕎白粉病病原一致，表明接種的病原菌為苦蕎白粉病的致病菌。

圖3 苦蕎白粉菌的致病性Fig.3 Pathogenicity of tartary buckwheat powdery mildew

2.3 基于ITS 和LSU 片段的苦蕎白粉病菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3.1 苦蕎白粉病菌的分子鑒定

苦蕎白粉病病原菌ITS 片段為607 bp (MW-494930.1)，LSU 片段為910 bp (OK490143)，將序列在GenBank 中進(jìn)行比對(duì)，ITS 結(jié)果顯示該序列與甜蕎上的白粉菌(E.polygoni，KP076437.1)核酸序列的相似度為100.00%；LSU 結(jié)果顯示該序列與酸模上的白粉菌(E.polygoni，MT36176-9.1) 核酸序列的相似度99.89%。從GenBank 獲得76 條序列相似性高于97%的ITS 片段，以E.glycines序列 (LC028953.1)為外群，經(jīng)多序列比對(duì)后獲得550 bp 的矩陣，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)顯示：病原菌的ITS 序列與E.polygoni聚為一支。從GenBank 檢索相似性高于97%的LSU 序列，共獲得57 條注冊(cè)為白粉菌的序列，以E.glycines序列 (AB015927.1)為外群，經(jīng)過對(duì)位排列后獲得792 bp 的矩陣，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5) 顯示：病原菌的LSU 序列與E.polygoni聚為一支。結(jié)合病原菌致病性測定、形態(tài)特征以及ITS 和LSU 序列比對(duì)，將苦蕎白粉病病原菌鑒定為蓼白粉菌(E.polygoni)。

圖4 基于77 條白粉菌序列 ITS 區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the ITS regions of 77 powdery mildew sequences

圖5 基于59 條白粉菌 LSU 區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the LSU regions of 59 powdery mildew sequences

2.3.2 苦蕎白粉病菌在白粉菌系譜中的位置

76 條序列包含5 種已命名的白粉病病原菌，寄主來源涵蓋7 科26 屬植物(表1)，E.polygoni、E.heraclei、E.buhrii和E.betae占主要部分。E.polygoni寄主均為蓼科植物；E.heraclei序列占比最多，寄主植物包括傘形科、五加科和蓼科的16 屬植物，其中傘形科植物占83%；E.buhrii寄主為石竹科；E.betae寄主為藜科和莧科植物，且與E.heraclei在系譜發(fā)育樹上交替分布。相似性高于99%的序列中包含E.polygoni和E.heraclei2 個(gè)種；當(dāng)相似性大于98%時(shí)，新增加E.buhrii和E.betae2 個(gè)種；當(dāng)相似性大于97%時(shí)，又新增加E.pisi1 個(gè)種?；贗TS 基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)顯示：在第4 個(gè)節(jié)點(diǎn)處將序列分為2 個(gè)大分支，本研究病原菌與來自蓼科的E.polygoni(KP076437.1)相似性為100.00%，與13 個(gè)E.polygoni和1 個(gè)E.heraclei的相似性都大于99%。該分支的寄主均為蓼科，且強(qiáng)烈聚為1 個(gè)分支。該分支又分為2 個(gè)小分支，1 個(gè)小分支寄主為蕎麥屬、大黃屬和酸模屬，其中酸模屬居多；另1 個(gè)小分支寄主為蓼屬、竹節(jié)蓼屬和珊瑚藤屬，其中竹節(jié)蓼屬和珊瑚藤屬各有1 種，其余為蓼屬植物。

表1 GenBank 中檢索到的相似性高于97%的白粉菌ITS 序列及其寄主信息Tab.1 Host information and ITS sequence similarity (≥97%) retrieved from GenBank

57 條LSU 序列包含21 種白粉病病原菌，寄主來源涵蓋22 科29 屬植物(表2)。其中也檢索到E.polygoni和E.heraclei2 個(gè)種的LSU 序列，E.polygoni的寄主為蓼科植物，E.heraclei的寄主為傘形科植物?？嗍w白粉菌序列與E.polygoni、E.heraclei在同1 分支，具有較好的支持率，與ITS序列進(jìn)化樹相似。相似性高于99%的序列包括E.polygoni和E.heraclei2 個(gè)種；當(dāng)相似性大于98%時(shí)，增加E.trifoliorum、E.cruciferarum、E.ac-antholimonis、E.quercicola、E.convolvulivar.、E.berberidis和E.magnifica7 個(gè)種；當(dāng)相似性大于97%時(shí)，增加E.alphitoides、E.convolvuli、E.lespedezae、E.limonii、Pseudoidium neolycopersici、E.corylacearum、E.caricae-papayae、E.aquilegiae、E.takamatsui、E.platani、E.aquilegiaevar.和E.cornicola12 個(gè)種。E.quercicola序列占比達(dá)47%，寄主包括蕓香科、大戟科、漆樹科和蓼科。

表2 GenBank 中檢索到的高相似性白粉菌LSU 序列及其寄主信息Tab.2 Host information and highly similarity of LSU sequences retrieved from GenBank

3 討論

白粉菌是最常見和最重要的專性寄生性植物病原真菌[21]，有超過400 種白粉菌能夠侵染近10 000 種植物，其中包括許多具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物和觀賞植物[22-24]。本研究通過致病性測定、形態(tài)學(xué)及分子鑒定，證實(shí)供試苦蕎白粉病病原為E.polygoni，該種于1986 年在中國臺(tái)灣被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)形態(tài)學(xué)和寄主植物將其鑒定到種[25]。

白粉菌具有專性活體營養(yǎng)性質(zhì)，其中既有寄主專化性很高的種，也有寄主范圍較廣的種。由于迄今尚不能人工培養(yǎng)，僅有部分白粉菌進(jìn)行過分子系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)分析[26]。根據(jù)分子鑒定結(jié)果，ITS 進(jìn)化樹的E.polygoni分支中有E.heraclei(KX-757832.1)，與E.polygoni的寄主同為蓼科植物，E.buhrii的寄主為石竹科植物，而傘形科和蓼科均屬于石竹亞綱。在GenBank 中檢索到E.polygoni的相關(guān)序列45 條，寄主分別是蓼科、藜科和豆科植物，涵蓋10 屬，其中，蓼科酸模屬和蓼屬最多，豆科豇豆屬和藜科甜菜屬次之。有研究報(bào)道：東南亞、印度和澳大利亞地區(qū)E.polygoni侵染綠豆[Vigna radiata(Linn.) Wilczek]引起綠豆白粉病[27]，美國西部地區(qū)E.polygoni侵染甜菜(Beta vulgarisL.)引起白粉病[28]，可見，E.polygoni不僅只侵染蓼科植物，但其優(yōu)勢寄主為蓼科植物。LSU 序列進(jìn)化樹中，苦蕎白粉菌序列與E.polygoni(MT361769.1)、E.heraclei(MK966309.1)序列的親緣關(guān)系最近，但E.heraclei寄主為傘形科植物，可見，白粉菌寄主專性范圍可跨越2 個(gè)科以上的植物。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)白粉菌的研究更加深入，越來越多的研究表明白粉菌的寄主跨越事件，如BEENKEN[29]報(bào)道臭椿(Ailanthus altissima)上的E.platani和E.alphitoides，宿主跳躍、跨越了不同科甚至不同目的植物，分別從懸鈴木科(Proteales)和殼斗科(Fagales)擴(kuò)展到苦木科(Sapindales)，由此可見，寄主植物在綱、目、科、屬的分類階元對(duì)白粉菌的系統(tǒng)進(jìn)化和生理進(jìn)化、物種形成起著十分重要的作用。根據(jù)寄主范圍、交叉接種和多個(gè)分子標(biāo)記的聯(lián)合系譜分析才能為白粉菌種群劃分、寄主范圍確定及病害有效防控提供準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過病原菌致病性測定、形態(tài)特征以及ITS 和LSU 序列比對(duì)，確定引起苦蕎白粉病的病原菌為蓼白粉菌(E.polygoni)，該病原菌有多個(gè)科寄主植物，是典型的復(fù)合種，急需從寄主范圍、交叉接種和多個(gè)分子標(biāo)記的聯(lián)合系譜進(jìn)行深入分析，才能為種群劃分、寄主范圍的確定以及白粉病的綠色防控提供理論依據(jù)。