鄧珺文，畢峻龍，李永能，程美玲，沈?qū)W文，楊貴樹，尹革芬**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.紅河州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 蒙自 661100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病。該病于1987 年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，并逐漸蔓延至歐洲和亞洲[1-2]，中國(guó)大陸于1995 年發(fā)現(xiàn)該病[3]，1996 年分離到PRRSV[4]。PRRSV 具有高度遺傳多樣性和快速進(jìn)化的特征，各基因型之間的抗原表位發(fā)生突變，導(dǎo)致疫苗免疫效果降低。為預(yù)防PRRSV 的傳播，控制PRRS的發(fā)生，養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)一線通常采用藥物預(yù)防或疫苗免疫的方法，但效果有限，如何有效地控制PRRS 流行是當(dāng)前面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2006 年變異毒株引起高致病性豬藍(lán)耳病[5]給部分養(yǎng)豬企業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失，近年來出現(xiàn)的類NADC30 毒株[6-7]和類NADC34 毒株[8]正逐步成為新的流行毒株，然而有關(guān)云南省內(nèi)新發(fā)毒株的流行情況鮮有報(bào)道。本研究通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)2013—2021年間云南省部分地區(qū)收集到的血液樣品，旨在調(diào)查云南省PRRS 的流行規(guī)律和混合感染情況以及PRRSV 不同基因型的流行情況，以期為PRRS 的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

于2013—2021 年采集云南省各地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)、不同生長(zhǎng)階段豬群的血液樣品3 112 份(表1)。其中，在3 種不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行樣品采集：種豬場(chǎng)567 份，育肥場(chǎng)1 650 份，散養(yǎng)戶895份；對(duì)5 個(gè)不同生長(zhǎng)階段的豬群進(jìn)行樣品采集：哺乳仔豬556 份，保育豬943 份，生長(zhǎng)育肥豬1 089份，種公豬71 份，種母豬453 份。

1.1.2 試驗(yàn)材料

病毒RNA 提取試劑RNAiso Plus、6×Loading Buffer、DL500 DNA Marker、pMD19-T 載體和大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程有限公司；病毒DNA 提取試劑盒購(gòu)自濟(jì)凡生物科技有限公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 和2×TransTaqHigh Fidelity (HIFI) PCR SuperMix Ⅱ購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；異丙醇、氯仿和無(wú)水乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PRRSV 陽(yáng)性樣品篩選

取血液樣品200 μL 放入離心管，加入RNAiso Plus 細(xì)胞裂解液1 mL，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min；取上清后加入一半體積的氯仿，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min；取上清后加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min；棄去管中液體后加入75%乙醇1 mL，12 000 r/min 離心5 min，棄去液體后室溫放置5～10 min，最后將沉淀溶于無(wú)RNA 酶水20 μL 中，獲得血液樣品的基因組RNA。參考畢峻龍[9]的PRRSV RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)總RNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的RT-PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，用DL500 DNA Marker 確定目的條帶大小，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2 PRRSV 感染情況調(diào)查

為進(jìn)一步分析PRRSV 和其他病毒混合感染的情況，使用病毒DNA 提取試劑盒，按照相關(guān)說明書提取得到血液樣品的基因組DNA。使用PCR/RT-PCR 方法進(jìn)一步對(duì)PRRSV 核酸陽(yáng)性樣品進(jìn)行豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)和豬圓環(huán)病毒2 型病毒(porcine circovirus type 2 virus，PCV2)檢測(cè)，檢測(cè)引物和方法參考畢峻龍[9]的研究。對(duì)陽(yáng)性樣品的檢出率進(jìn)行不同年份、不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)、不同年齡階段和混合感染情況分析。

1.2.3 PRRSV 基因型分析

選取保存較為完好(均為2017—2021 年的樣品)且具有較強(qiáng)毒力的PRRSV 陽(yáng)性樣品共53 份，將產(chǎn)物純化回收后與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α 中，均勻涂板后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～22 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行富集，于恒溫培養(yǎng)搖床(220 r/min，37 ℃)振蕩過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并送至生工生物工程上海(股份)有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到PRRSV 的nsp2基因序列，再進(jìn)行基因型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV 檢測(cè)結(jié)果

樣品經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到約為330 bp 的特異性條帶(圖1)，表明部分樣品PRRSV 核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在2013—2021 年收集的3 112 份樣品中，PPRSV 核酸陽(yáng)性樣品有801 份，陽(yáng)性率為25.74%。

圖1 PRRSV 核酸檢測(cè)電泳圖Fig.1 Electrophoretic detection picture of PRRSV

2.2 不同年份PRRSV 核酸檢測(cè)結(jié)果

由表2 可知：2013—2018 年，PRRSV 檢出率呈上升趨勢(shì)；2019—2021 年，PRRSV 檢出率有一定下降，但仍在20%以上。

表2 2013—2021 年送檢樣品PRRSV 核酸陽(yáng)性率Tab.2 Positive rate of PRRSV in samples sent for testing from 2013 to 2021

2.3 PRRSV 與其他病原的雙重、多重感染情況

對(duì)801 份PRRSV 核酸陽(yáng)性樣品進(jìn)行其他疫病檢測(cè)，出現(xiàn)雙重混合感染的樣品有330 份，混合感染率為41.20%。其中，檢出CSFV 陽(yáng)性樣品78 份，陽(yáng)性率9.74%；PCV2 陽(yáng)性樣品198 份，陽(yáng)性率24.72%；PRV 陽(yáng)性樣品54 份，陽(yáng)性率6.74%(表3)。

有100 份PRRSV 核酸陽(yáng)性樣品出現(xiàn)三重混合感染，混合感染率為12.48%；15 份樣品出現(xiàn)PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 四重混合感染，混合感染率為1.87%。其中，18 份樣品檢出PRRSV、CSFV 和PRV 三重混合感染；50 份樣品檢出PRRSV、CSFV 和PCV2 三重混合感染；32 份樣品檢出PRRSV、PCV2 和PRV 三重混合感染(表4)。

表4 多重混合感染情況Tab.4 Situation of multiple mixed infection

2.4 不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)PRRSV 感染情況

801 份PRRSV 陽(yáng)性樣品中，種豬場(chǎng)陽(yáng)性樣品81 份，檢出率為14.29% (81/567)；育肥場(chǎng)陽(yáng)性樣品461 份，檢出率為27.94% (461/1 650)；散養(yǎng)戶陽(yáng)性樣品259 份，檢出率為28.94% (259/895)?？梢?，相對(duì)于育肥場(chǎng)和散養(yǎng)戶，種豬場(chǎng)PRRSV 感染程度較輕。

2.5 不同生長(zhǎng)發(fā)育階段豬群PRRSV 感染情況

801 份PRRSV 陽(yáng)性樣品中，哺乳仔豬陽(yáng)性樣品93 份，檢出率為16.73% (93/556)；保育豬陽(yáng)性樣品271 份，檢出率為28.74% (271/943)；生長(zhǎng)育肥豬陽(yáng)性樣品362 份，檢出率為33.24% (362/1 089)；種公豬陽(yáng)性樣品6 份，檢出率為8.45% (6/71)；種母豬陽(yáng)性樣品69 份，檢出率為15.23% (69/453)?？梢?，不同生長(zhǎng)階段豬群的PRRSV 感染程度差異較大，生長(zhǎng)育肥豬感染最嚴(yán)重，其余依次是保育豬、哺乳仔豬、種母豬和種公豬。

2.6 不同毒株類型分析

由表5 可知：2017—2021 年間，高致病性毒株占58.49% (31/53)，檢出數(shù)量呈逐年下降趨勢(shì)；經(jīng)典毒株占22.64% (12/53)，檢出數(shù)量呈逐年下降趨勢(shì)；類NADC30 毒株自2019 年檢出后呈逐年上升趨勢(shì)，占比為15.09% (8/53)；類NADC34 毒株于2021 年在云南省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，占比為3.77%(2/53)。

表5 陽(yáng)性樣品中的不同毒株數(shù)量Tab.5 Number of different strains in positive samples

3 討論

1995 年在中國(guó)大陸發(fā)現(xiàn)了PRRS[3]；1996 年郭寶清等[4]在國(guó)內(nèi)暴發(fā)PRRS 的豬群中首次分離到PRRSV；1997—1998 年對(duì)PRRSV 的血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：PRRS 在華東地區(qū)廣泛存在[10]；2006 年，1 種新型PRRSV 變異毒株在中國(guó)引起非典型PRRS 的暴發(fā)，其特點(diǎn)是所有年齡段的豬都出現(xiàn)高熱癥狀，且發(fā)病率和死亡率高，這種新型的PRRSV 被定名為高致病性豬藍(lán)耳病[5]；2006年下半年，云南省部分地區(qū)也發(fā)生了高致病性豬藍(lán)耳病疫情，隨后分離到了PRRSV 云南毒株[11]；之后，在云南省內(nèi)不斷檢測(cè)出PRRSV，經(jīng)深入研究，證實(shí)了云南省內(nèi)廣泛存在PRRS，并呈現(xiàn)出一定的流行趨勢(shì)[12-13]。本研究檢測(cè)了2013—2021年間收集的3 112 份血液樣品，發(fā)現(xiàn)有801 份樣品為PPRSV 陽(yáng)性，總陽(yáng)性率為25.74%。在2013—2018 年間，PRRSV 檢出率呈上升趨勢(shì)，陽(yáng)性率在21.08%～41.72%之間；近3 年來，PRRSV 檢出率在22.56%～24.32%之間，雖有一定下降但仍高于20%，提示PRRSV 仍在云南省的部分養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛流行。

近年來，臨床上出現(xiàn)多種病原混合感染和持續(xù)性感染的現(xiàn)象，且呈上升趨勢(shì)[14]。在云南省的部分養(yǎng)殖場(chǎng)中，繁殖障礙病毒性疾病常以PRRSV 和PCV2 的混合感染為主[15]，這2 種病毒均能夠破壞宿主的免疫過程，并進(jìn)一步加重混合感染的程度[16-17]。本研究進(jìn)一步對(duì)801 份PRRSV 核酸陽(yáng)性樣品進(jìn)行其他疫病檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在不同程度上與CSFV、PRV、PCV2 等病原發(fā)生混合感染。經(jīng)檢測(cè)，共有330 份PRRSV 核酸陽(yáng)性樣品出現(xiàn)雙重混合感染，混合感染率為41.20%，且PRRSV 和PCV2 雙重混合感染最為常見；共有100 份PRRSV 核酸陽(yáng)性樣品出現(xiàn)三重混合感染，混合感染率為12.48%；共有15 份樣品檢出PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 四重混合感染，混合感染率為1.87%。結(jié)果提示當(dāng)前規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疫病的主要臨床表現(xiàn)為PRRSV 和其他疫病混合感染，且相對(duì)于育肥場(chǎng)和散養(yǎng)戶，種豬場(chǎng)的PRRSV 感染程度較輕；不同生長(zhǎng)階段豬群中，以生長(zhǎng)育肥豬感染最嚴(yán)重。

PRRSV 具有基因遺傳多樣的特性，且不斷出現(xiàn)新的變異毒株，尤其是近年來新發(fā)現(xiàn)的類NADC30 新毒株，目前已在中國(guó)多地流行[6-7]；2017年，中國(guó)新出現(xiàn)了類NADC34 毒株，并逐步在全國(guó)范圍內(nèi)流行[8]；現(xiàn)階段，中國(guó)主要流行的毒株仍為類JXA1 和類NADC30 毒株[18]。本研究選取53 份PRRSV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2017—2021 年間，高致病性毒株和經(jīng)典毒株占比呈逐年下降趨勢(shì)，類NADC-30 毒株自2019 年檢出后占比呈逐年上升趨勢(shì)，類NADC34 毒株于2021 年在云南省首次發(fā)現(xiàn)。提示類NADC30 毒株和類NADC34 毒株等新型變異毒株已在云南省內(nèi)流行，并可能會(huì)逐漸取代高致病性毒株和經(jīng)典毒株成為云南省的優(yōu)勢(shì)毒株。

4 結(jié)論

2013—2021 年間，PRRSV 仍是對(duì)云南省生豬養(yǎng)殖危害最大的疫病之一，當(dāng)前規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疫病的主要臨床表現(xiàn)為PRRSV 和其他疫病混合感染，相對(duì)于育肥場(chǎng)和散養(yǎng)戶，種豬場(chǎng)感染程度較輕，生長(zhǎng)育肥豬感染最嚴(yán)重。類NADC30 毒株和類NADC34 毒株等新發(fā)毒株可能會(huì)成為云南省優(yōu)勢(shì)毒株。本研究為PRRS 的防控提供了理論參考依據(jù)。

致謝：云南省獸醫(yī)生物制品研制中心獸醫(yī)師朱玲云、楚雄彝族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)師趙謙、石林彝族自治縣畜牧獸醫(yī)總站高級(jí)獸醫(yī)師陳關(guān)雄、麗江市古城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局高級(jí)獸醫(yī)師楊淵、云南省普文公路動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站農(nóng)業(yè)推廣研究員鄭旺華在樣本采集、數(shù)據(jù)分析、流行病學(xué)調(diào)查等方面提供了大量幫助，特質(zhì)誠(chéng)摯謝意！