賈向飛，鄭遠榮，劉振民,*，吳涵清,3，周楊陽

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；3.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

奶酪是由牛奶凝乳排乳清后形成的新鮮或成熟的產(chǎn)品，因其美味而富有營養(yǎng)在世界各地被廣泛消費。霉菌成熟奶酪是成熟奶酪的重要類型，目前市場上常見的主要有藍紋奶酪、卡門培爾奶酪、布里奶酪等。由青霉成熟的藍紋奶酪通常蛋白和脂肪分解程度較高，味道強烈且刺激[1-2]。相比之下，卡門培爾奶酪和布里奶酪的氣味相對溫和[3]。有研究表明，將在中國有悠久應(yīng)用歷史的紅曲霉作為輔助發(fā)酵劑進行奶酪制作，不僅可以改善奶酪的功能特性，如提高γ-氨基丁酸和洛伐他汀等有益物質(zhì)含量，其風味也更易于國人接受[2,4-5]。

生物活性肽是奶酪中一類重要的生物活性成分，它們是在奶酪加工過程中通過乳蛋白的分解產(chǎn)生的具有生物活性的小分子肽。這些肽是蛋白質(zhì)的特定片段，具有特殊的N端和C端氨基酸殘基。牛奶被認為是活性肽的最好來源。在牛奶及奶酪中的活性肽已經(jīng)被證明具有多種功能，如抗氧化、抗高血壓、抗血栓、降血糖、抗菌、免疫活性等作用[6-7]。目前，對奶酪生物活性及活性肽方面的研究已取得一定進展，但對紅曲霉奶酪成熟過程中的生物活性變化以及活性肽的鑒定還有待進一步探索。

高血壓作為心血管疾病的主要危險因素，嚴重影響國民健康。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）能夠作用于人體血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，即腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）和激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）。在RAS中，ACE催化血管緊張素I水解成血管緊張素II，促使血管收縮，從而導致血壓升高。在KKS中，ACE通過降解緩激肽表現(xiàn)出升壓作用。通過抑制ACE活性，可以降低血壓，達到治療心血管疾病的效果。傳統(tǒng)ACE抑制藥物如賴諾普利、貝那普利等，雖然在治療心血管疾病和降低血壓方面效果良好，但也存在干咳、頭痛、低血壓、腎功能損害等不同程度的副作用[8]。食源性降血壓肽因其無毒、無副作用、安全性高，已成為當前研究熱點[9]。然而，傳統(tǒng)的從食源蛋白中分離ACE抑制肽需經(jīng)過水解、超濾、離子交換層析、凝膠色譜、反向高效液相色譜等步驟，過程耗時費力、成本高且難度大[10]。因此，有必要研究評估高ACE抑制活性肽較便捷的篩選方法。近年來發(fā)展快速的生物信息學技術(shù)可為生物大數(shù)據(jù)分析提供方法和工具，逐漸應(yīng)用于生物活性肽的功能研究。

目前，關(guān)于紅曲霉對奶酪蛋白肽生物活性的研究處于起步階段。此外，分子對接技術(shù)在ACE抑制肽研究方面也常用于對已知肽的抑制機理進行探究。目前鮮有將這項技術(shù)用于奶酪研究中對未知或者不確定的潛在ACE活性肽進行篩選，此方法可有效節(jié)省研究成本，提高篩選效率。本研究探討紅曲霉對奶酪成熟期間的可溶性氮含量、α-葡萄糖苷酶抑制活性和ACE抑制活性的影響，利用質(zhì)譜、生物信息學和分子對接技術(shù)，對最佳成熟期的紅曲霉奶酪進行肽譜測定，對潛在的ACE抑制肽進行篩選，并進行合成及活性驗證，最后通過酶抑制動力學分析探究其作用機理。本研究一方面為紅曲霉奶酪的功能特性潛力提供一定的依據(jù)，另一方面有望為奶酪活性肽研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳 光明乳業(yè)股份有限公司；商業(yè)發(fā)酵劑FLORA、STI-13 科漢森（中國）有限公司；凝乳酶（酶活力：890 IMCU/g）北京多愛特生物科技有限公司；紅曲霉菌株BC20、ZX99 實驗室自篩菌株；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG）、ACE、α-葡萄糖苷酶、N-[3-(2-呋喃基)丙烯?；鵠-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES）美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、醋酸鹽緩沖溶液國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KT260凱氏定氮儀 丹麥FOSS Scino公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；HPP110奶酪成熟箱 德國Memmert公司；Spectramax M5酶標儀美國Molecular Devices公司；生物安全柜、Easy-nLC 1200液相色譜儀、Orbitrap Exploris 480質(zhì)譜儀、NanoViper色譜柱C18賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 奶酪樣品的制備

紅曲霉奶酪由光明牧場提供的生牛乳為原料制成，對照組奶酪不接種紅曲霉。奶酪分析樣品在內(nèi)外混合均勻后取樣。奶酪制作工藝參照賈向飛等[11]的方法，具體工藝流程如下：

生牛乳→標準化（脂肪、蛋白質(zhì)質(zhì)量比約為1.6∶1）→殺菌（72 ℃、20 s）→冷卻（32 ℃）→接種發(fā)酵劑（3 g/100 kg）→發(fā)酵（37 ℃、2 h、pH 6.3～6.4）→加凝乳酶（0.6 g/100 kg）→切割攪拌→入模排乳清（不定時翻轉(zhuǎn)、約4 h）→鹽浸（質(zhì)量分數(shù)20%的NaCl溶液）→晾干后涂抹紅曲霉菌液→成熟→貯藏（4 ℃）

1.3.2 奶酪水溶性蛋白肽的提取及超濾分離

分別在成熟期1、5、10、15、20、25 d取接種紅曲霉和不接種紅曲霉的奶酪各10 g左右，加入適量的去離子水，40 ℃水浴30 min，均質(zhì)3～4 min，將勻漿離心（4 ℃、8000 r/min、20 min），除去上層脂肪，上清液先通過Whatman No.41濾紙之后再通過0.22 μm水相過濾膜進行過濾，過10、3 kDa的超濾膜。所得濾液進行凍干后儲存在-20 ℃冰箱，保藏備用。

1.3.3 成熟期間的可溶性氮含量測定

pH 4.6可溶性氮（pH 4.6 acidsoluble nitrogen，pH 4.6-SN）相對含量測定：參照Zhang Shuwen等[12]的方法進行測定。取5 g奶酪加入45 mL pH 4.6的醋酸鹽緩沖溶液，均質(zhì)，60 ℃水浴 1 h，4 ℃、4000 r/min離心20 min，取5 mL中層上清液，轉(zhuǎn)移到消化瓶內(nèi)進行凱氏定氮，結(jié)果用pH 4.6-SN占奶酪總氮的比例表示。

三氯乙酸可溶性氮（trichloroacetic acid-soluble nitrogen，TCA-SN）相對含量測定：取5 g奶酪，加入45 mL質(zhì)量分數(shù)12%的TCA溶液，混合均勻后靜置1 h，4 ℃、4000 r/min離心20 min，取5 mL上清液移入消化瓶進行凱氏定氮，結(jié)果用TCA-SN占奶酪總氮的比例表示。

1.3.4 ACE抑制活性測定

參照Hao Xinyue等[13]的方法并稍加修改，將20 μL 0.1 U/mL的ACE吸入透明96 孔板中，將40 μL 80 mmol/L HEPES緩沖液（pH 8.3）和凍干粉溶液（＜3 kDa）分別添加至對照孔和樣品孔中。最后向每個孔中加入50 μL預熱的1 mmol/L FAPGG，立即將其混合均勻。在340 nm波長下使用酶標儀測定對照孔和樣品孔的初始吸光度（A1和），在37 ℃在黑暗中保持30 min后再次進行吸光度測定（A2和）。ACE抑制活性通過按式（1）計算：

式中：A為對照孔的吸光度減少值，即A1-；B為樣品孔的吸光度減少值，即A2-。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性

參照Li Yiyan等[14]的方法測定奶酪水溶性蛋白肽提取物（＜3 kDa）抑制α-葡萄糖苷酶的能力。用磷酸鹽緩沖溶液（20 mmol/L、pH 6.8）制備α-葡萄糖苷酶溶液（20 U/mL）和PNPG溶液（10 mmol/L）。將100 μL凍干粉溶液（5 mg/mL）和100 μLα-葡萄糖苷酶溶液加至96 孔板中，37 ℃反應(yīng)10 min，加入50 μL PNPG溶液繼續(xù)反應(yīng)1 h。加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。通過酶標儀在405 nm處記錄各孔的吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（2）計算：

式中：Aa為樣品組吸光度；Ab為未加α-葡萄糖苷酶樣品組吸光度；Ac為對照組吸光度；Ad為未加α-葡萄糖苷酶對照組對照空白組吸光度。

1.3.6 紅曲霉奶酪肽鑒定

對經(jīng)過5 kDa超濾膜過濾后的肽段利用C18脫鹽后進行凍干，加入20 μL 0.1%甲酸溶液復溶。用NanoDrop微量分光光度計進行濃度測定，取2 μg凍干樣品進行質(zhì)譜上機分析。數(shù)據(jù)采集利用Easy nLC液相系統(tǒng)。流動相A液為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈-水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡，由自動進樣器上樣到上樣柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，nanoViper C18），經(jīng)過C18反相分析柱（Thermo Scientific EASY column，10 cm×75 μm，3 μm）分離，流速為300 nL/min。分離后的樣品用Orbitrap Exploris 480質(zhì)譜儀進行數(shù)據(jù)非依賴性采集（data independent acquisition，DIA）質(zhì)譜分析。檢測模式為正離子，一級質(zhì)譜掃描范圍m/z200～3000。二級質(zhì)譜采用DIA數(shù)據(jù)采集模式。DIA數(shù)據(jù)采用Spectronaut軟件（SpectronautTM17.6.230428.55965）進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.7 生物信息學分析

利用BIOPEP（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopepuwm/）和MBPDB（http://MBPDB.nws.oregonstate.edu/）數(shù)據(jù)庫預測蛋白肽的潛在生物活性。利用PeptideRanker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）服務(wù)器對上述查詢數(shù)據(jù)庫獲得的潛在活性肽評分，評分范圍從0～1，評分越高，表明有生物活性的概率越高。使用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html）和AllergenFP（http://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/）數(shù)據(jù)庫對篩選肽段進行潛在的毒性和致敏性的預測。

1.3.8 分子對接

參照Zhang Ting[15]和Shi Yanan[16]等的方法，稍作修改。使用軟件Discovery Studio 2019進行分子對接。ACE的晶體結(jié)構(gòu)（1O86，PDB）從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫中下載。分子對接前，用軟件Discovery Studio 2019從晶體結(jié)構(gòu)中去除水以及刪除其他配體，保留鋅原子和氯原子，加氫，使用“Prepare Protein”前處理操作優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)。利用軟件自帶程序構(gòu)建以及預測肽的結(jié)構(gòu)，通過“Prepare Ligands”進行前處理，使用“CHARMm”力場進行能量最小化優(yōu)化肽的結(jié)構(gòu)。處理后的配體及受體采用半柔性分子對接。對接以Zn2+坐標為中心（x：43.821，y：38.24，z：46.712），半徑為8，作為對接結(jié)合位點。篩選對接成功的化合物，并選擇分值高的對接結(jié)果進行分析。

1.3.9 活性肽的合成及半抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）測定

將篩選得到的多肽送生工生物工程（上海）股份有限公司利用固相合成法合成，得到純度高于90%以上的多肽，通過液相色譜和電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）進行合成肽的純化和鑒定。ACE抑制肽的IC50值被定義為抑制50% ACE活性所需抑制劑的濃度，使用Origin軟件計算IC50。

1.3.10 酶促反應(yīng)抑制動力學分析

參照He Rong等[17]的方法，稍作修改后進行測定和分析。將ACE的底物（FAPGG）分別配制為濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L的溶液于試管中。根據(jù)IC50值，選擇肽YPFPGPI濃度為0、300、600 μmol/L，肽FPEVFGKDE濃度為0、500、1000 μmol/L。固定酶濃度，按照1.3.4節(jié)體外活性測定方法進行測定，以酶促反應(yīng)速率倒數(shù)（1/V）為縱坐標、底物濃度倒數(shù)（1/S）為橫坐標制作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，對ACE抑制肽的酶抑制類型進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均做3 次平行實驗，采用IBM SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA分析，處理結(jié)果以±s表示，P＜0.05表示差異顯著。作圖采用Origin 2022和Excel軟件。應(yīng)用Discovery Studio 2019軟件進行分子對接及可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉對奶酪成熟過程中可溶性氮含量的影響

采用pH 4.6-SN和TCA-SN含量對紅曲霉奶酪和對照奶酪在整個成熟過程中的蛋白水解程度進行表征和比較。pH 4.6-SN含量是蛋白初級水解的指標，主要是由于凝乳酶的催化作用。TCA-SN含量是蛋白次級水解的指標，主要是由于發(fā)酵劑和紅曲霉分泌的蛋白酶作用，代表了短肽和游離氨基酸的含量[18]。如圖1所示，兩種奶酪的pH 4.6-SN含量和TCA-SN含量均隨成熟時間的延長而增加。紅曲霉奶酪的pH 4.6-SN相對含量由4.54%上升到32.12%，對照組由4.72%上升到20.34%。紅曲霉奶酪的TCA-SN相對含量由3.18%上升到19.17%，對照組由3.13%上升到13.87%。在成熟的前9 d，兩組奶酪的pH 4.6-SN含量和TCA-SN含量增加速率較快，這是因為前期成熟溫度較高，有利于促進微生物蛋白酶的作用從而加速蛋白水解。在成熟9 d之后，奶酪被放入15 ℃和用錫紙包裹的環(huán)境下繼續(xù)成熟，溫度和氧氣含量的降低一定程度上對微生物的生長代謝造成影響，減緩了其蛋白水解速率。與對照組相比，紅曲霉奶酪的pH 4.6-SN相對含量和TCA-SN相對含量顯著高于對照組（P＜0.05），在成熟結(jié)束時分別提高了57.98%和38.34%。該結(jié)果表明紅曲霉促進了奶酪的初級蛋白水解和次級蛋白水解，從而產(chǎn)生更多的短肽和游離氨基酸。此外，蛋白水解程度的增加也可能與紅曲霉分泌產(chǎn)生的其他代謝產(chǎn)物促進發(fā)酵劑的生長有關(guān)。這與Yu Huaning等[19]的研究結(jié)果相似。

圖1 紅曲霉對奶酪成熟過程中pH 4.6-SN（A）和TCA-SN（B）含量的變化Fig.1 Changes in pH 4.6-SN (A) and TCA-SN (B) contents of Monascus cheese during ripening process

2.2 紅曲霉對奶酪成熟期間蛋白肽生物活性的影響

2.2.1 紅曲霉對奶酪蛋白肽α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響采用PNPG法對紅曲霉奶酪和對照奶酪蛋白肽在整個成熟期間的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行比較。降低或抑制α-葡萄糖苷酶的活力在一定程度上能夠阻礙或減少人體對膳食中碳水化合物的消化，從而達到降低血糖的作用[20]。如圖2所示，兩組奶酪的α-葡萄糖苷酶抑制活性隨著成熟時間延長而逐漸增高，成熟10 d后，紅曲霉奶酪的α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著高于對照組（P＜0.05）。對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生的抑制作用主要與奶酪成熟過程中蛋白水解產(chǎn)生的小分子活性肽有關(guān)[21]。紅曲霉奶酪成熟25 d后，其α-葡萄糖苷酶抑制活性相比于對照組提高了32.21%，這是因為紅曲霉的添加有助于增強奶酪的蛋白水解能力，產(chǎn)生更多的小分子活性肽提高其抑制活性。有研究表明，在乳制品中添加乳酸菌以及特異性的酶能提高乳制品的α-葡萄糖苷酶抑制活性[22-23]，這均與增加了乳制品的蛋白水解能力產(chǎn)生更多的小分子肽和氨基酸有關(guān)。

圖2 紅曲霉對奶酪成熟過程中α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.2 Effect of Monascus on α-glucosidase inhibitory activity of cheese during ripening process

2.2.2 紅曲霉對奶酪蛋白肽ACE抑制活性的影響

采用FAPGG底物法測定紅曲霉奶酪和對照奶酪蛋白肽的ACE抑制活性，對其進行表征和比較。奶酪中的ACE抑制活性肽作為食源性活性肽，數(shù)量多、安全性高且活性好。經(jīng)統(tǒng)計，約有30%的ACE抑制肽均來源于乳制品[24]。如圖3所示，隨著成熟時間的延長，紅曲霉奶酪的ACE抑制活性由10.14%增加至75.16%，對照組由9.73%增加至43.20%。在成熟5 d后，紅曲霉奶酪的ACE抑制活性顯著高于對照奶酪（P＜0.05），這是因為紅曲霉在奶酪上的快速生長加速了奶酪的蛋白水解，從而產(chǎn)生了更多以及活性更好的ACE抑制肽。成熟25 d時，紅曲霉奶酪的ACE抑制率達到了75.16%，而對照奶酪僅為43.20%，紅曲霉奶酪較對照奶酪提高了73.98%，兩者差異顯著（P＜0.05）。在對切達奶酪成熟期間ACE抑制活性的研究中發(fā)現(xiàn)，益生菌的添加有利于促進奶酪ACE抑制肽的產(chǎn)生并提高其活性[25]。紅曲霉奶酪良好的ACE抑制活性與本實驗后續(xù)活性肽鑒定結(jié)果一致，即與其含有較多的ACE抑制肽有關(guān)。

圖3 紅曲霉對奶酪成熟過程中ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of Monascus on ACE inhibitory activity of cheese during ripening process

2.3 紅曲霉奶酪活性肽分析

通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對紅曲霉奶酪中分子質(zhì)量低于5 kDa的肽譜進行鑒定，共鑒定到1796 種肽。根據(jù)分子質(zhì)量大小進行分類，結(jié)果如圖4所示，其中分子質(zhì)量低于3 kDa的肽種類占到了約93.49%，這也為活性肽的產(chǎn)生提供了更多的可能性。圖5顯示了來自不同酪蛋白和乳清蛋白來源的肽在紅曲霉奶酪蛋白肽提取物中的分布，其β-酪蛋白和αs1-酪蛋白占比高，分別達到52.08%和29.82%。這Wei Guangqiang等[26]對乳餅蛋白肽來源的鑒定結(jié)果相似。酪蛋白是奶酪蛋白的主要組成部分，乳清蛋白來源肽的種類少是因為大部分乳清蛋白在奶酪加工過程中已經(jīng)隨著乳清被排出。

圖4 紅曲霉奶酪不同分子質(zhì)量蛋白肽（＜5 kDa）的數(shù)量Fig.4 Number of peptides with different molecular masses from Monascus cheese (<5 kDa)

圖5 紅曲霉奶酪中低于5 kDa肽的主要來源分布Fig.5 Distribution of major sources of peptides with molecular masses less than 5 kDa in Monascus cheese

通過數(shù)據(jù)庫對鑒定到的肽進行了檢索注釋。在進入BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫并點擊“蛋白質(zhì)”或“生物活性肽”欄后，操作步驟如下：分析→潛在生物活性概況→選擇活性（抗氧化、ACE抑制、抗糖尿病等）→蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（使用其登錄ID選擇蛋白質(zhì)序列）→進行比對注釋生物活性。MBPDB數(shù)據(jù)庫可直接對單個肽或者一批肽進行搜索，注釋其生物活性。如圖6所示，潛在的ACE抑制肽為51 條，潛在的抗氧化肽為28 條，潛在抗菌肽為18 條，潛在降血糖肽（肽基肽酶抑制肽）為7 條等。其潛在的ACE抑制肽數(shù)量最多，與ACE抑制活性測定的良好效果相對應(yīng)。后續(xù)將對潛在的ACE抑制活性肽進行篩選，希望可以得到一種及幾種抑制效果良好的ACE抑制肽。表1展示了鑒定到的51 種潛在的ACE抑制肽，幾乎均小于3 kDa，其主要來源是α-酪蛋白和β-酪蛋白，這可能與它們在奶酪中的高含量及容易被酶解的結(jié)構(gòu)有關(guān)。表2顯示了用PeptideRanker服務(wù)器對鑒定到的潛在ACE抑制肽進行了排列（只篩選預測評分＞0.5），得到共27 條肽段序列，并對其進行了毒性和致敏性的預測，結(jié)果顯示均無毒和低致敏性或無致敏性。后續(xù)研究將利用分子對接技術(shù)繼續(xù)對這些得到的潛在ACE抑制肽進行篩選。

表1 紅曲霉奶酪中的潛在ACE抑制肽Table 1 Potential ACE inhibitory peptides in Monascus cheese

表2 潛在ACE抑制肽段的活性、毒性預測及理化性質(zhì)Table 2 Predicted activity,toxicity and physicochemical properties of potential ACE inhibitory peptides

圖6 生物活性肽數(shù)據(jù)庫預測的紅曲霉奶酪生物活性肽種類及數(shù)量Fig.6 Types and numbers of bioactive peptides in Monascus cheese predicted using the database of bioactive peptides

2.4 分子對接篩選及作用機理分析

分子對接有助于根據(jù)結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系預測肽的ACE抑制活性。使用Discovery Studio 2019軟件對表2篩選具有ACE抑制活性的潛在活性肽進行分子對接模擬。結(jié)果表明，肽YPFPGPI和FPEVFGK的對接效果較好，其LibdockScore分別為142.623和174.406，LibdockScore越高，小分子與受體結(jié)合的活性越高，越方便其發(fā)生相互作用。

圖7顯示了ACE-YPFPGPI和ACE-FPEVFGK復合體的3D和2D結(jié)構(gòu)圖。研究表明，氫鍵在對接復合體和酶催化反應(yīng)中起到重要作用[27]。如圖7A所示，肽YPFPGPI與ACE殘基Asn70形成1 個傳統(tǒng)氫鍵，與Asn66、Leu140、Glu143、Ser516形成4 個碳氫鍵。如圖7B所示，肽FPEVFGK與ACE氨基酸殘基Met223、Glu123、Ser516形成3 個傳統(tǒng)氫鍵，和Glu143、Ser355、Gly404形成3 個碳氫鍵。氫鍵的長度和數(shù)量會影響在抑制劑和酶的相互作用[28]。此外，以范德華力和疏水作用力等形式的力也有助于ACE-結(jié)合肽的穩(wěn)定，進而影響到對ACE的抑制作用[29]。這兩種肽的末端都具有疏水性氨基酸。有研究表明，ACE活性位點的Ser355氨基酸殘基對ACE-結(jié)合肽相互作用的穩(wěn)定性有顯著貢獻作用[30]。在Shi Yanan等[16]的研究中，肽YPFPGPIH具有良好的ACE抑制活性。因此，肽YPFPGPI和肽FPEVFGK極有可能具有良好的ACE抑制活性。

圖7 肽YPFPGPI（A）和FPEVFGK（B）分子對接構(gòu)象圖Fig.7 Molecular docking conformations of peptides YPFPGPI (A) and FPEVFGK (B)

2.5 篩選ACE抑制肽的IC50測定結(jié)果分析

為進一步驗證所篩選肽的ACE抑制活性，利用固相合成法進行肽段合成，其兩個合成肽的液相色譜純度圖和ESI-MS鑒定結(jié)構(gòu)圖如圖8、9所示。測定不同濃度ACE寡肽YPFPGPI和FPEVFGK的ACE抑制活性，結(jié)果如圖10、11所示。經(jīng)計算，肽YPFPGPI和FPEVFGK的IC50值分別為207.31 μmol/L和410.61 μmol/L，高于Shi Yanan等[16]從乳餅和奶渣經(jīng)模擬胃腸消化后篩選得到的ACE抑制肽YPFPGPIH（IC50＝（109.5±4.2）μmol/L）、LKNWGEGW（IC50＝（77.70±2.60）μmol/L）、HPHPHLS（IC50＝（64.30±3.00）μmol/L）。但低于鐘玉旺等[29]從辣木籽中篩選得到的ACE抑制肽QGPRPQ（IC50＝（1.15±0.30）mmol/L）。不同ACE抑制活性測定方法也會對結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響?？傊?，說明肽YPFPGPI和FPEVFGK是潛在的ACE抑制活性肽，具有良好的抑制效果。

圖8 肽YPFPGPI的液相色譜純度圖（A）和ESI-MS鑒定結(jié)構(gòu)圖（B）Fig.8 Liquid chromatogram (A) and ESI-mass spectrum and structural diagram (B) of peptide YPFPGPI

圖9 肽FPEVFGK的液相色譜純度圖（A）和ESI-MS鑒定結(jié)構(gòu)圖（B）Fig.9 Liquid chromatogram (A) and ESI-mass spectrum and structural diagram (B) of peptide FPEVFGK

圖10 不同濃度下肽YPFPGPI的ACE抑制活性Fig.10 ACE inhibitory activity of peptide YPFPGPI at different concentrations

圖11 不同濃度下肽FPEVFGK的ACE抑制活性Fig.11 ACE inhibitory activity of peptide FPEVFGK at different concentrations

2.6 篩選ACE抑制肽對ACE的抑制動力學分析

Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖常被用于探究ACE抑制肽對ACE的抑制類型。對篩選得到的ACE抑制活性肽YPFPGPI和FPEVFGK進行ACE抑制動力學分析，結(jié)果如圖12所示。隨著兩種活性肽的濃度增加，其Vmax逐漸減小，且都相交于X坐標軸，故米氏常數(shù)Km不變，屬于典型的非競爭性抑制模式，表明抑制劑可以與酶的活性位點之外的部位結(jié)合，與底物不形成競爭關(guān)系。酶同時與底物和抑制劑結(jié)合，形成的一些中間物不能分解成產(chǎn)物，因此酶活性降低。這與何海艷等[31]從南瓜籽分離出來的肽LLPGF和LVF以及王斌雅等[28]從螺旋藻中分離出的肽HIIARPH和LRLKE等具有一樣的抑制類型。非競爭性抑制劑相比競爭性抑制劑而言，抑制作用持續(xù)時間更長。

圖12 肽PFPGPI（A）和肽FPEVFGK（B）對ACE的雙倒數(shù)圖Fig.12 Double reciprocal plots for the ACE inhibitory effect of peptides FPEVFGK (A) and FPEVFGK (B)

3 結(jié)論

紅曲霉的添加能夠促進奶酪的蛋白降解。在成熟過程中，由于紅曲霉自身的代謝能力和具有特異性的酶系統(tǒng)促進了奶酪產(chǎn)生更多的活性肽，提高了奶酪的ACE抑制活性和降糖活性，尤其ACE抑制活性更為顯著（P＜0.05），成熟25 d時相比對照組可顯著提高73.98%。在對紅曲霉奶酪的肽譜鑒定中，也發(fā)現(xiàn)了較多的具有潛在功能的ACE抑制肽。通過PeptideRanker服務(wù)器和分子對接技術(shù)從這些具有潛在活性的ACE抑制肽中篩選到了兩種活性良好的ACE抑制肽YPFPGPI和FPEVFGK，IC50測定分別為207.31 μmol/L和410.61 μmol/L。動力學分析表明，這兩種肽對ACE的抑制類型均為非競爭性抑制。后續(xù)可對篩選得到的肽進行細胞或動物實驗，進一步了解抑制作用及其機制。總之，本實驗提供了一種快速篩選ACE抑制肽的方法，表明了奶酪中添加紅曲霉能夠有效提高ACE抑制活性且可以作為篩選ACE抑制肽的良好來源，為紅曲霉奶酪的開發(fā)提供指導。