張靖銘，馮旸旸，時平茹，孔保華，曹傳愛，王 輝，劉 騫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肉蛋白中最重要的組成部分，約占總蛋白質(zhì)含量的55%～60%，其在熱處理?xiàng)l件下會通過非共價(jià)相互作用和共價(jià)交聯(lián)形成有序的三維網(wǎng)狀的凝膠基質(zhì)，賦予肉制品良好的保水、保油特性和感官特性[1]。隨著人們對高品質(zhì)肉制品需求的不斷增加，研究人員正在努力提高M(jìn)P的凝膠特性，包括持水性、硬度、彈性、致密性等?？紤]到非共價(jià)相互作用的鍵能較低，反應(yīng)通常是不穩(wěn)定和可逆的[2]，而共價(jià)交聯(lián)在理想情況下能達(dá)到電子飽和的狀態(tài)，形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定和堅(jiān)固，因此研究MP的共價(jià)交聯(lián)具有更深遠(yuǎn)的意義。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）能夠催化蛋白質(zhì)多肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，產(chǎn)生ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，增強(qiáng)蛋白分子內(nèi)或分子間的共價(jià)交聯(lián)（圖1），其交聯(lián)度（degree of cross-linking，DCL）對蛋白質(zhì)的凝膠特性起到?jīng)Q定性作用[3]。DCL首先取決于底物蛋白質(zhì)的種類，不同的蛋白質(zhì)對TGase表現(xiàn)出不同的親和性，MP頭部的肌球蛋白中含有豐富且充分暴露的賴氨酸和谷氨酰胺殘基，使其成為TGase作用的良好底物[4]。目前已有大量學(xué)者研究了TGase的共價(jià)交聯(lián)對MP凝膠特性的影響，他們發(fā)現(xiàn)，該酶通過降低α-螺旋含量和增加β-折疊含量，顯著改變了MP的二級結(jié)構(gòu)，使其形成了大分子聚合物[5-7]。這些結(jié)構(gòu)的變化使MP的熱誘導(dǎo)凝膠具有更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度，且在一定范圍內(nèi)DCL與凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性[8]。有研究證明，提升的凝膠強(qiáng)度也賦予肉制品更優(yōu)越的硬度、彈性、黏結(jié)性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特征[9-10]。同時，由于凝膠結(jié)構(gòu)變化減少了風(fēng)味前體物質(zhì)的損失，產(chǎn)品會表現(xiàn)出更加突出的風(fēng)味特征[11]。此外，有研究表明隨著DCL增加，肌球蛋白的水解增強(qiáng)，消化物中存在生物活性肽的可能性也增加[12]。

圖1 TGase催化共價(jià)交聯(lián)過程Fig.1 Covalent cross-linking process catalyzed by TGase

現(xiàn)階段對于TGase催化共價(jià)交聯(lián)改善MP凝膠特性的研究已經(jīng)趨于完善，然而在實(shí)際應(yīng)用方面還存在著一些亟待解決的問題，如TGase催化交聯(lián)會增強(qiáng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用而抑制蛋白質(zhì)-水的相互作用，導(dǎo)致凝膠的持水性降低[13]，在產(chǎn)品中表現(xiàn)出較大的蒸煮損失。因此，近年來研究者開始關(guān)注外源添加物和新型加工技術(shù)協(xié)同TGase對MP凝膠特性的影響，但現(xiàn)有文獻(xiàn)對其影響DCL的情況和機(jī)制缺乏歸納總結(jié)。本文詳細(xì)介紹了TGase催化MP-DCL測定和表征方法，通過分析其影響因素揭示TGase改善MP凝膠品質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制，并綜述了外源添加物或新型加工技術(shù)協(xié)同TGase對MP凝膠特性的影響及分子作用機(jī)制，為后續(xù)TGase在現(xiàn)代肉制品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 DCL的表征及其影響因素

1.1 DCL的測定和表征

目前國內(nèi)外對于表征TGase催化效果的DCL的測定方法如表1所示。ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵是TGase催化MP共價(jià)交聯(lián)過程中形成的一種異肽鍵，其含量的多少直接表明了DCL的數(shù)量多少。同時，因?yàn)镸P中的游離氨基參與異肽鍵形成，所以游離氨基含量的降低可間接反映ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵的增加，即DCL增加，可用下式表示[8]。此外，大分子聚集物的形成或肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）的減少也可以表示DCL的增加。

表1 DCL的測定和表征方法Table 1 Summary of methods for determination and characterization of DCL

式中：a表示酶處理前游離氨基含量；a′表示酶處理后游離氨基含量。

1.2 DCL的影響因素

TGase作為一種蛋白質(zhì)交聯(lián)酶，其催化MP共價(jià)交聯(lián)的過程符合酶促反應(yīng)動力學(xué)，因此DCL受內(nèi)部因素和反應(yīng)環(huán)境的制約，其中內(nèi)部因素包括酶濃度、底物濃度和底物結(jié)構(gòu)，反應(yīng)環(huán)境包括溫度、時間和離子強(qiáng)度（圖2）。

圖2 TGase催化MP交聯(lián)的影響因素Fig.2 Factors influencing MP cross-linking catalyzed by TGase

1.2.1 酶濃度和底物濃度

在酶促反應(yīng)中，酶濃度和底物的濃度是限制反應(yīng)速率的最主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，TGase添加量的增加使MP的G′值顯著增大，其原因是當(dāng)TGase添加量較低時，只有少部分MP分子能夠產(chǎn)生交聯(lián)，當(dāng)TGase添加量充足時，MP分子之間才會充分交聯(lián)[22]。同時，楊明柳等[23]研究發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE圖譜中MHC帶隨TGase添加量的增加逐漸減弱，同樣說明了DCL隨TGase添加量的增加而增加。但值得注意的是，由于MP中的谷氨酰胺和賴氨酸殘基含量有限，所以DCL并不是隨著TGase添加量的增加而無限增加[24]。

1.2.2 底物結(jié)構(gòu)

氧化會改變MP結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響MP分子內(nèi)及分子間的共價(jià)交聯(lián)。Li Chunqiang等[25]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGase處理的輕度氧化MP的DCL為87.6%，未氧化MP的DCL為64.7%，而過度氧化MP的DCL僅為33.8%，說明輕度氧化有利于增加DCL，使MP形成更致密、均勻的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)。這可能是因?yàn)檩p度氧化時，MP分子中有少量巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵使蛋白質(zhì)聚集，拉近了谷氨酰胺和賴氨酸殘基的距離而促進(jìn)TGase的催化反應(yīng)[26]。

1.2.3 反應(yīng)溫度

一方面，溫度的變化會導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，研究表明肌球蛋白頭部在30～50 ℃時開始聚集，50～60 ℃時形成較大的球狀聚集體[27]；另一方面，溫度還會影響酶的活性，TGase作用的溫度范圍為4～65 ℃，最適溫度為45～55 ℃[28]。Shi Yafang等[29]研究了TGase在30～90 ℃條件下作用20 min對DCL及MP凝膠特性的影響，結(jié)果表明，在40 ℃條件下，TGase的交聯(lián)能力最強(qiáng)并對MP凝膠的質(zhì)構(gòu)特性具有最明顯的提升效果。

1.2.4 反應(yīng)時間

根據(jù)溫度的不同，酶的作用時間也不相同，TGase催化常用的有4 ℃低溫長時間交聯(lián)和40 ℃短時間孵育兩種方式，其中40 ℃孵育因?yàn)槎虝r高效而得到更廣泛的關(guān)注。郭秀瑾等[30]在酶添加量10 U/g、反應(yīng)溫度40 ℃條件下研究不同MP凝膠化時間對DCL的影響，發(fā)現(xiàn)前4 h內(nèi)MHC含量逐漸下降且MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)越來越規(guī)則和致密，證明隨著反應(yīng)時間的延長，DCL逐漸增加。Fang Mengxue等[31]也發(fā)現(xiàn)在酶添加量9 U/g、40 ℃的條件下反應(yīng)0 h時，DCL為18.52%，隨著反應(yīng)時間延長至2 h和12 h，DCL分別增加至34.76%和62.87%。不同TGase催化時間形成的不同DCL的MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 不同DCL的MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)[31]Fig.3 Microstructure of MP gels with different DCL[31]

1.2.5 離子強(qiáng)度

溶液離子強(qiáng)度的變化會改變環(huán)境的pH值，研究發(fā)現(xiàn)在25 ℃、100 U/g條件下，TGase催化的MP凝膠在酸性環(huán)境中強(qiáng)度較低，在弱堿性環(huán)境中強(qiáng)度相對較高，pH 8.5時凝膠強(qiáng)度最大[32]。同時，因MP具有鹽溶特性，高鹽離子濃度能夠促使MP結(jié)構(gòu)展開，增加TGase對谷氨酰胺和賴氨酸殘基的可及性，提高DCL[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Ca2+具有激活TGase的作用，能夠增加DCL，使MP凝膠品質(zhì)增強(qiáng)，微觀結(jié)構(gòu)緊密、均勻，空洞孔洞少；但是過高的Ca2+含量則會導(dǎo)致過度交聯(lián)，導(dǎo)致MP凝膠強(qiáng)度、彈性下降[33]。

2 外源添加物與TGase協(xié)同對DCL和MP凝膠特性的影響

在過去的研究和實(shí)際生產(chǎn)中，許多外源添加物已被開發(fā)并用于MP改性，包括多酚、堿性氨基酸、親水膠體、淀粉和非肉蛋白等。但由于大多數(shù)的外源添加物都是通過非共價(jià)相互作用修飾MP結(jié)構(gòu)以改善其凝膠特性，作用相對有限且不穩(wěn)定，因此近年來研究者們開始關(guān)注外源添加物與TGase的協(xié)同作用。本節(jié)對這些不同外源添加物與TGase協(xié)同催化MP交聯(lián)的效果及其分子作用機(jī)制綜述如下。

2.1 多酚

多酚是一類從植物中提取的天然小分子化合物，具有很強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化活性，因此通常作為功能性食品添加劑應(yīng)用到肉制品中。多酚具有特殊的結(jié)構(gòu)和特性，能夠與MP發(fā)生可逆或不可逆的相互作用，并以劑量依賴的方式誘導(dǎo)MP聚集，從而改變MP的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)、功能和形態(tài)性質(zhì)[34]。較低濃度的多酚能有效提高M(jìn)P的交聯(lián)程度，而高濃度的多酚會由于“氨基-醌”“巰基-醌”等相互作用發(fā)生過度交聯(lián)，破壞MP的二、三級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MP聚集不均勻，形成較差的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，凝膠強(qiáng)度降低[35]。TGase催化MP發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的特性可以很好地彌補(bǔ)多酚的劣勢，因此有研究者將二者復(fù)配應(yīng)用于MP體系中，研究其協(xié)同作用對DCL和MP凝膠特性的影響。

Zhang Daojiu等[36]研究了TGase協(xié)同原花青素B2（proanthocyanidin B2，PCB2）對MP凝膠特性的影響，結(jié)果表明PCB2通過與MP中的巰基結(jié)合而轉(zhuǎn)化為醌-巰基配合物，能夠在一定程度上提升DCL，進(jìn)而促進(jìn)更加致密的MP凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，提高了MP凝膠特性。但值得注意的是，PCB2和TGase協(xié)同作用所產(chǎn)生的大分子聚集物會導(dǎo)致MP溶解度的降低。Chang Jinyang等[37]研究了TGase與綠原酸（chlorogenic acid，CA）協(xié)同改善氧化MP凝膠特性的效果，其結(jié)果表明高濃度CA會導(dǎo)致MP凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散、孔徑大且不規(guī)則，而在TGase與CA協(xié)同作用下MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊湊、孔隙均勻，這說明TGase能夠克服高劑量CA引起的凝膠結(jié)構(gòu)劣變，增加DCL。同時，二者的協(xié)同作用使更多的水分子被截留在凝膠內(nèi)部，并使水分分布趨于均勻，顯著提高氧化損傷MP凝膠的持水能力。同時，有研究者通過分子對接說明了表沒食子茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）與MHC的共價(jià)和非共價(jià)相互作用，確認(rèn)了以MHC為底物的TGase催化機(jī)制（圖4）。

圖4 通過分子對接分析MHC與EGCG的相互作用及TGase的催化機(jī)制[38]Fig.4 Interaction analysis between MHC and EGCG and catalytic mechanism of TGase via molecular docking[38]

2.2 堿性氨基酸

堿性氨基酸是人體的必需或半必需氨基酸，包括精氨酸（arginine，Arg）、賴氨酸（lysine，Lys）和組氨酸（histidine，His），作為一種安全無毒、來源廣泛、營養(yǎng)健康且價(jià)格低廉的小分子物質(zhì)，將其添加到食品體系中不會引入有害物質(zhì)，是一種綠色的食品添加劑。大量研究表明，在MP溶液中添加堿性氨基酸能夠提高體系pH值，并通過電荷作用擾亂MP分子結(jié)構(gòu)，使肌球蛋白絲狀體解離，進(jìn)而使MP溶解度增加[39]。另外也有研究者發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸可以通過與MP中酸性氨基酸殘基發(fā)生相互作用抑制MP聚集，起到增加MP溶解度的效果[40]。溶解度的增加會使得MP結(jié)構(gòu)展開，不僅有利于形成良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還可以增加TGase對賴氨酸和谷氨酰胺殘基的可及性，增加DCL并改善MP凝膠特性[41]。

Cao Yungang等[42]研究發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)添加TGase或Lys的實(shí)驗(yàn)組相比，二者協(xié)同作用的MP凝膠呈現(xiàn)出更為精細(xì)、光滑、致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，說明TGase與Lys在提升DCL和改善凝膠結(jié)構(gòu)方面具有協(xié)同作用。此外，Lys的ε-氨基作為TGase的反應(yīng)底物，使得Lys可以在TGase的作用下被連接到MP分子內(nèi)部，因其本身具有咸味，可以有效地提升產(chǎn)品的風(fēng)味特征和營養(yǎng)價(jià)值[43]。Cao Yungang等[44]的另一項(xiàng)研究表明，TGase與Arg的組合也能夠協(xié)同增加DCL，并顯著提高M(jìn)P的凝膠強(qiáng)度和持水性，使其呈現(xiàn)出細(xì)膩、致密的微觀結(jié)構(gòu)。Shi Tong等[45]進(jìn)一步研究在微波輻射條件下，Arg與TGase協(xié)同改善低鹽MP凝膠特性的分子作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Arg能夠結(jié)合在MP表面，并通過靜電作用和陽離子相互作用增加MP的水分散性，使其在TGase作用下發(fā)生更大程度的交聯(lián)，其交聯(lián)機(jī)制如圖5所示。同時，在TGase作用下相互靠近的MHC能與Arg的羧基產(chǎn)生相互作用破壞掉原有的氫鍵，產(chǎn)生新的氫鍵，使MP分子出現(xiàn)更多的展開和聚集行為，顯著提高熱誘導(dǎo)凝膠的DCL，進(jìn)而提升凝膠強(qiáng)度和保水性。

圖5 Arg與TGase協(xié)同改善低鹽MP凝膠特性的機(jī)制[45]Fig.5 Synergic mechanism of action of Arg combined with TGase in improving the gel properties of low-salt MP[45]

2.3 親水膠體

親水膠體是以單糖為單位形成的大分子多糖，在自然界中來源豐富，因具有良好的增稠、膠凝、穩(wěn)定、保水以及乳化能力，在食品行業(yè)中迅速發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用[46]。肉制品加工過程中常用的親水膠體包括魔芋膠、卡拉膠、可得然膠、黃原膠、海藻酸鈉和納米纖維素等，溶于水后能夠與水分子相互作用形成水凝膠，在MP體系中形成較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多糖-水復(fù)合體系，對于致密穩(wěn)定的MP凝膠形成有促進(jìn)作用[47]?；谶^去幾年的突出成果和快速進(jìn)展，目前關(guān)于親水膠體的研究正轉(zhuǎn)向與其他成分相互作用的調(diào)控。

孫樂常等[48]研究在熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中添加TGase和魔芋膠（konjac gum，KGM）對MP凝膠品質(zhì)的影響，結(jié)果表明KGM的加入引起了MP周圍水分子的重排，改變了MP的分子間作用力，從而導(dǎo)致MP中親水性氨基酸暴露，為TGase催化ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵的形成提供了有利條件，增加了DCL。同時，有研究者在魚明膠與TGase和κ-卡拉膠的雙交聯(lián)實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果[49]。但是，Zhang Xiaowei等[50]研究發(fā)現(xiàn)羧化納米纖維素（carboxylated nanofiber cellulose，cNFC）和TGase能夠協(xié)同提升MP凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，但并未增加DCL。其作用機(jī)制如圖6所示，TGase催化MP交聯(lián)，抑制cNFC的運(yùn)動，形成MP-cNFC半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中兩種物質(zhì)幾乎不發(fā)生相互作用而是保持各自的結(jié)構(gòu)，相互糾纏、相互支撐，從而提高M(jìn)P的凝膠強(qiáng)度。

圖6 TGase催化MP-cNFC半互穿網(wǎng)絡(luò)形成機(jī)制[50]Fig.6 Formation mechanism of MP-cNFC semi-interpenetrating polymer network catalyzed by TGase[50]

2.4 淀粉

淀粉作為一種水固結(jié)劑，在許多肉制品生產(chǎn)過程中起到了降低成本、提高保水性、改善質(zhì)構(gòu)特性的重要作用。雖然MP和淀粉在加熱過程中的熱轉(zhuǎn)變是相互獨(dú)立的，但淀粉在加熱溫度達(dá)到70 ℃時發(fā)生糊化，淀粉顆粒吸收大量的水，體積膨脹到初始大小的數(shù)倍，能夠?qū)P凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)起到支撐作用，使其具有更好的持水力和更高的凝膠強(qiáng)度[51]。

夏秀芳[52]、鄧思楊[53]等研究不同的馬鈴薯淀粉和TGase添加量對MP熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉與TGase的添加能夠促使MP在分子內(nèi)和分子間產(chǎn)生交聯(lián)，形成大分子物質(zhì)。但二者作用機(jī)制不同且沒有觀察到協(xié)同作用。淀粉糊化吸水后與MP相互作用形成淀粉-蛋白-水的復(fù)合型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提升了MP凝膠的持水性和凝膠強(qiáng)度，主要涉及氫鍵等非共價(jià)作用[54]；而TGase是通過催化作用形成ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，使MP凝膠網(wǎng)絡(luò)更為致密，共價(jià)作用是此過程中的主要因素。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)添加過量的淀粉會導(dǎo)致DCL降低，其原因可能是在加熱升溫的過程中，淀粉糊化的發(fā)生先于MP凝膠的形成，過量的淀粉顆粒遮蔽了賴氨酸和谷氨酰胺殘基，降低了TGase對底物的可及性，進(jìn)而導(dǎo)致DCL降低[55]。

2.5 植物蛋白

在肉制品加工中，添加植物蛋白能夠在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。這是因?yàn)橹参锏鞍妆旧砜梢酝ㄟ^填補(bǔ)凝膠空隙或者改變凝膠結(jié)構(gòu)而影響MP熱誘導(dǎo)凝膠特性[56]。然而，由于缺乏結(jié)構(gòu)變化，植物蛋白和MP分子之間的相互作用通常有限，甚至可能由于干擾MP凝膠行為而對凝膠品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[57]。

Jiang Jiang等[58]研究改性的大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）與TGase協(xié)同作用對DCL和MP凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)酸改性的SPI能夠明顯提升MP的最終G′值，且TGase的加入進(jìn)一步強(qiáng)化了上述現(xiàn)象，說明TGase與酸改性的SPI在增加DCL方面有明顯的協(xié)同作用。推測其原因，一方面是SPI增大了MP的溶解度，增強(qiáng)了TGase對底物氨基酸殘基的可及性；另一方面是TGase能催化SPI中的β-伴大豆球蛋白（7S）和球蛋白（11S）與MP中活性基團(tuán)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。同時，有研究者發(fā)現(xiàn)超聲改性的豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）和TGase對于改善低磷環(huán)境下MP的凝膠特性具有相似的協(xié)同效應(yīng)，能使焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）的添加量減少50%，其作用機(jī)制如圖7所示[59]。此外，Lee等[60]用紅豆分離蛋白和TGase聯(lián)合作用于低鹽MP體系，發(fā)現(xiàn)二者的協(xié)同效應(yīng)能夠克服低鹽造成的凝膠結(jié)構(gòu)劣變，獲得的MP凝膠仍具有良好的持水力和堅(jiān)固、致密的凝膠結(jié)構(gòu)。

圖7 TGase催化MP和改性PPI復(fù)合凝膠形成機(jī)制[59]Fig.7 Mechanism of composite gel formation from MP and modified PPI catalyzed by TGase[59]

3 新型加工技術(shù)對TGase催化MP共價(jià)交聯(lián)程度的影響

隨著人們對高品質(zhì)食品需求的增長，超聲處理（ultrasound treatment，UT）、高壓處理（high-pressure processing，HPP）、微波和脈沖電場等一系列新型加工技術(shù)正在食品工業(yè)中推廣應(yīng)用，由于其具有獨(dú)特的能量傳輸機(jī)制，生產(chǎn)效率更高、產(chǎn)品品質(zhì)更好、對環(huán)境的影響更小，因此近年來研究者針對上述新型加工技術(shù)開展了大量研究。本節(jié)綜述了UT、HPP、微波協(xié)同TGase對DCL和MP凝膠品質(zhì)的影響及其分子作用機(jī)制。

3.1 超聲波技術(shù)

UT是一項(xiàng)新興的非熱加工技術(shù)，因其無污染、安全、易操作等優(yōu)點(diǎn)在食品加工領(lǐng)域得到了廣泛的研究，具有很大的應(yīng)用潛力。超聲波能夠產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，其中空化效應(yīng)對MP結(jié)構(gòu)的影響最為顯著?？栈?yīng)即超聲產(chǎn)生的氣泡在爆破時引起微射流對物體表面造成物理損傷的現(xiàn)象，能夠破壞肌纖維的Z線和M線，增大肌纖維間的間隙，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)-水相互作用，同時使蛋白質(zhì)的活性基團(tuán)暴露，有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，有助于形成均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[61]。近年來，超聲輔助酶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于改變食物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[62-63]。

Feng Jiaqi等[64]研究TGase和UT及其組合對MP凝膠特性的影響，其動態(tài)流變學(xué)結(jié)果表明UT-TG處理組樣品的G′值最高，其次為TGase處理組和UT處理組樣品，未經(jīng)處理樣品的G′值最低，說明TGase與UT的聯(lián)合作用提升了MP-DCL，得到了具有較高強(qiáng)度和彈性的凝膠。其SEM結(jié)果表明，UT-TG處理組樣品的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更緊密，孔隙更小，且比TGase處理組和UT處理組樣品的凝膠網(wǎng)絡(luò)連通性更高，結(jié)構(gòu)更有序。這是因?yàn)閁T能夠促進(jìn)TGase運(yùn)動，使其擴(kuò)散到MP分子的各個位點(diǎn)，從而在加熱過程中形成更均勻有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)[65]。Gao Xia等[66]研究發(fā)現(xiàn)，超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)會釋放大量的能量并產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，肌動球蛋白解離，使肌球蛋白在鹽溶液中的溶解度升高，并隨著反應(yīng)進(jìn)行均勻分散，充分暴露出供TGase作用的活性基團(tuán)，在其熱誘導(dǎo)凝膠中形成更多的ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，其作用機(jī)制如圖8a所示。此外，還有研究者推測UT改變了TGase的構(gòu)象，提高了TGase活性，并誘導(dǎo)了更適合TGase作用的MP構(gòu)象，使DCL進(jìn)一步增加[67]。但也有研究表明，過強(qiáng)的超聲強(qiáng)度可能會導(dǎo)致TGase結(jié)構(gòu)大幅改變，喪失其原有活性[68]。

圖8 新型加工技術(shù)影響TGase催化MP凝膠形成的作用機(jī)制Fig.8 Mechanism of the effect of novel processing technologies on MP gel formation catalyzed by TGase

3.2 HPP技術(shù)

HPP是一項(xiàng)高效率、低能耗、無毒無害的非熱處理技術(shù)，因其對菌落致死率高達(dá)97%，能夠有效延長產(chǎn)品的貨架期，已作為一種冷殺菌手段在食品行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用[69]。近年來，研究者又發(fā)現(xiàn)HPP能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，暴露出巰基和疏水基團(tuán)，減少蛋白與水分子的接觸，有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[70]。同時，HPP還會影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈的相互作用，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)變性、聚集或凝膠化，但其形成的凝膠結(jié)構(gòu)類似于一種“海綿狀”，主要由疏水作用力維持，無法形成均勻穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)[71]。因此，近年來研究者嘗試?yán)肨Gase彌補(bǔ)HPP誘導(dǎo)凝膠的不足。

Herranz等[71]研究TGase、HPP和這兩種處理的組合在MP凝膠形成過程中的作用，其結(jié)果表明，僅添加TGase的處理組形成的凝膠共價(jià)鍵比例較大，凝膠結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的剛性特征，而HPP處理產(chǎn)生的壓縮-膨脹效應(yīng)會使得非共價(jià)鍵重新組合，產(chǎn)生更富有彈性的凝膠網(wǎng)絡(luò)，二者的聯(lián)合作用沒有觀察到明顯的協(xié)同效果。但Kunnath等[72]研究發(fā)現(xiàn)TGase對HPP誘導(dǎo)的MP凝膠特性具有明顯的提升效果，具體表現(xiàn)為TGase的加入使HPP誘導(dǎo)的MP凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出更為連續(xù)、均勻的狀態(tài)，在后續(xù)加熱過程中，相互靠近的巰基形成二硫鍵進(jìn)一步加強(qiáng)了MP聚集，形成表面連續(xù)均勻、孔洞小的凝膠，具有更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度。

上述研究結(jié)果并不一致，這可能與HPP作用的強(qiáng)度、時間等因素有關(guān)，但更重要的似乎是HPP與TGase的作用順序。如圖8b所示，先加入TGase反應(yīng)一段時間后再進(jìn)行HPP，則HPP作用效果不顯著，這是因?yàn)門Gase催化產(chǎn)生的共價(jià)鍵強(qiáng)于HPP建立的非共價(jià)相互作用[73]。先進(jìn)行HPP可以促進(jìn)MP的展開，使更多活性基團(tuán)暴露，更容易被TGase催化形成共價(jià)鍵[41]。

3.3 微波處理技術(shù)

與傳統(tǒng)加熱相比，微波處理是一種綠色、環(huán)保、清潔的技術(shù)，它通過產(chǎn)生電磁場進(jìn)行加熱，直接引起材料分子內(nèi)的振動，由于其穿透能力強(qiáng)、加熱速度快、加工時間短、能源效率高、操作簡單，在食品工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，包括烹飪、殺菌、干燥、解凍、生物活性成分提取和誘導(dǎo)MP凝膠化等[74]。微波因其特殊的交變電場，可以改變蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的電荷環(huán)境和內(nèi)電場分布，從而破壞蛋白質(zhì)肽鏈之間的靜電作用，和傳統(tǒng)的水浴加熱相比更容易形成肌球蛋白聚集體從而形成更好的凝膠結(jié)構(gòu)[75-76]。

然而，Cao Hongwei等[77]研究相同的TGase反應(yīng)條件下，微波加熱與傳統(tǒng)水浴加熱對MP凝膠特性的影響，結(jié)果表明兩種加熱方式誘導(dǎo)的MP凝膠的DCL差異不大。這是因?yàn)槲⒉ㄋa(chǎn)生的交變電場對MP分子有“撕扯”的作用，有利于MP結(jié)構(gòu)展開，原本包埋在其內(nèi)部的活性殘基暴露，使得二硫鍵廣泛形成，但二硫鍵所產(chǎn)生的空間位阻會阻礙ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵的形成，且隨著時間的延長，二硫鍵作用形成的大分子聚集體又會將原本暴露出來的活性殘基重新包埋起來，降低TGase對底物的可及性，進(jìn)一步阻止TGase催化MP交聯(lián)[78]。其潛在的機(jī)制如圖8c所示。

但值得注意的是，微波除了簡單的熱效應(yīng)外，還可以通過非熱效應(yīng)對酶本身直接產(chǎn)生作用，如酶分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，引起酶活性的變化，最終影響其作用結(jié)果[79]。研究發(fā)現(xiàn)TGase的活性受微波功率和加熱時間的影響。在相同的升溫速率下，微波加熱的TGase活性在40 ℃時達(dá)到最高值，且高于常規(guī)水浴加熱，這是因?yàn)門Gase分子自身的介電特性使其在微波交變電場的作用下發(fā)生偶極-偶極相互作用，活性位點(diǎn)發(fā)生改變而使酶活性提高[80]。因此，將微波改性的TGase加入到MP體系中或許是提高DCL的一種有效手段。

4 結(jié)語

如今消費(fèi)者的健康意識逐漸增強(qiáng)，清潔標(biāo)簽食品的發(fā)展成為必然趨勢，低鹽低磷等肉制品的開發(fā)生產(chǎn)已經(jīng)成為肉品行業(yè)的熱點(diǎn)研究問題。TGase能夠催化生成ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，提高DCL，賦予MP良好的凝膠特性，進(jìn)而改善肉制品品質(zhì)，這對于清潔標(biāo)簽肉制品的生產(chǎn)具有重要意義。由于TGase單獨(dú)作用對MP凝膠特性的提升效果有限，因此研究者將其他外源添加物和新型加工技術(shù)引入到TGase催化MP共價(jià)交聯(lián)的過程中，旨在彌補(bǔ)TGase作用缺陷的同時進(jìn)一步提升MP凝膠特性，以獲得品質(zhì)更優(yōu)的產(chǎn)品。

近幾年，關(guān)于TGase與外源添加物或新型加工技術(shù)協(xié)同改善MP凝膠特性的研究已經(jīng)取得了一定成果，然而不可忽視的是這些方案還存在著一些問題。第一，雖然目前國內(nèi)外已有大量研究表明外源添加物如多酚、堿性氨基酸、淀粉、親水膠體和非肉蛋白等能夠與TGase協(xié)同提高M(jìn)P交聯(lián)程度，但對二者協(xié)同作用機(jī)制研究的深度和廣度還有不足，未來可深入探究其分子互作行為和凝膠過程中MP結(jié)構(gòu)的演化規(guī)律。第二，各種新型加工技術(shù)與TGase聯(lián)合作用時的參數(shù)選擇還不明確，強(qiáng)度過低作用效果不明顯，強(qiáng)度過高可能破壞TGase的結(jié)構(gòu)使其失活或?qū)P結(jié)構(gòu)造成損傷，此外新型加工技術(shù)與TGase的作用順序也是未來研究的一項(xiàng)重點(diǎn)。第三，現(xiàn)有研究大多集中在MP體系中，但對于實(shí)際生產(chǎn)中面臨的多組分共混體系的研究還不夠豐富，因此在未來的研究中，應(yīng)當(dāng)考慮TGase的共價(jià)交聯(lián)作用對多組分體系凝膠結(jié)構(gòu)的影響，擴(kuò)大TGase在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。第四，研究TGase與外源添加物或新型加工技術(shù)協(xié)同作用改善凝膠結(jié)構(gòu)對肉制品口感、風(fēng)味釋放和消化吸收等特性的影響，以便合理控制TGase催化的MP-DCL，為實(shí)際生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。