王琪文，羅 青，徐洋洋，王曦旻，曾聰彥，戴衛(wèi)波，彭偉文，董更婷

（廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

近年來心血管疾病逐漸成為人們健康的頭號“殺手”，全球約有50%的人因心血管疾病死亡[1-2]。而缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是心血管疾病致死率居高不下的原因之一，其病因主要是由于心肌缺血（myocardial ischemia，MI）導致心臟供血供氧不足，長期心肌供氧量降低引起的能量代謝失衡，造成嚴重的心肌受損，使心肌收縮力減弱甚至喪失，誘發(fā)心絞痛與心律失常等癥狀，如未能及時治療會導致心力衰竭、心肌梗死甚至造成患者死亡[3-6]。

氧化應激已被證實是誘發(fā)MI重要因素之一[7-8]，其主要原因是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)的清除率無法保持平衡。MI導致氧運輸量不足，造成心肌細胞缺氧，線粒體受損，抗氧化清除系統(tǒng)無法清除過量產(chǎn)生的ROS，氧化還原反應失衡，導致氧化應激反應[9-10]，MI同時還會使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開，使得一些促凋亡內(nèi)容物釋放到細胞質(zhì)中，與ROS聯(lián)合促進細胞凋亡[11-12]。目前臨床常采用β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑等藥物治療IHD，但報道顯示部分患者會出現(xiàn)低血壓、心律失常等嚴重副作用，限制了MI藥物的長期應用，因此篩選安全有效的成分抑制氧化應激損傷，有望成為改善MI的新策略。

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）是薔薇科薔薇屬植物，主產(chǎn)于我國云貴等西南高原區(qū)，果實香甜，富含維生素、氨基酸、微量元素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多糖及黃酮等多種活性成分，具有很高的營養(yǎng)保健功能及開發(fā)與應用價值[13-14]?，F(xiàn)代藥理學研究顯示刺梨提取物具有抗氧化、降血糖以及提高機體免疫等作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)刺梨果多糖成分可誘導多種抗氧化酶的活性，并且可以清除多種自由基從而發(fā)揮抗氧化功能[16-18]，但對于刺梨果多糖防治因缺血引發(fā)的心肌細胞死亡的作用及機制尚不明確。異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）為β受體激動劑，因其可以干擾線粒體功能、誘導氧化應激和心肌細胞凋亡等特點，與MI病理特征極為相似，且造模方法簡單，被公認為MI造模劑[19]。因此本研究選用ISO誘導C57BL/6小鼠MI模型探討刺梨果多糖對MI保護作用及相關機制，以期為將刺梨果開發(fā)成抵抗MI的健康保健產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性C57B L/6小鼠40只，體質(zhì)量為18～20 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0002，動物質(zhì)量合格證號：44007200114336）。實驗期間小鼠飼養(yǎng)于中山市中醫(yī)院屏障級動物實驗室（使用許可證號：SYXK（粵）2020-0109），環(huán)境保持12 h光暗循環(huán)，溫度為（22±2）℃，相對濕度50%～60%之間，小鼠自由攝食、飲水，適應性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。動物實驗經(jīng)中山市中醫(yī)院倫理委員會審核通過（批準號AEWC-2022059），并嚴格遵守動物實驗倫理相關規(guī)定進行操作。

刺梨果 貴州省貴定縣。

ISO 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；普萘洛爾（propranolol，Pro）江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司；SOD 檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、蛋白裂解液（RIPA）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、一抗稀釋液 碧云天生物技術公司；BCA蛋白定量試劑盒 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液北京索萊寶科技有限公司；β-肌動蛋白（β-actin）、中核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、NADPH氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2）、半胱天冬酶3（Caspase 3）、B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl2）、Bcl2相關X（Bcl2-associated X，Bax）、超敏顯影液 江蘇親科生物研究中心有限公司；Kelch樣ECH相關蛋白1（Kelch-like ECH-related protein 1，Keap1）生工生物工程（上海）股份有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 密理博中國有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液 武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ECG-2303B心電圖儀 廣州市三銳電子科技有限公司；AUW120D電子天平 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；H1850R渦旋儀 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LUKYM-1樣品冷凍研磨儀 廣州露卡測序儀器有限公司；Ti2-A倒置熒光顯微鏡 尼康儀器（上海）有限公司；2-16R醫(yī)用離心機 湖南恒諾儀器設備有限公司；HGPN-50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HH3500多功能酶標儀 珀金埃爾默儀器有限公司；SMB-PC金屬加熱儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；EPHC 400雙獨立高電流電泳電源廣州道一科學技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨果多糖制備

稱取干燥刺梨果實加水適中，室溫浸泡24 h后，煮至水沸，繼續(xù)保持微沸煎煮2 h；過濾后按照上述方法再煎煮一次，合并兩次藥液進行濃縮，隨后透析到適當體積，于4000 r/min離心15 min，取上清液加入95%的乙醇沉淀過夜，4000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀于烘箱中烘干，后復溶于水中冷凍干燥得刺梨果多糖。

1.3.2 刺梨果多糖中性糖含量及糖醛酸糖含量的檢測

稱取15 mg樣品用蒸餾水溶解后定容至100 mL，取200 μL溶液，加入400 μL 5%苯酚和2 mL濃硫酸，室溫反應30 min后測定490 nm波長處吸光度并根據(jù)標準曲線計算中性糖含量；取硼砂（NaB4O7·10H2O）2.385 g，加濃硫酸并定容至500 mL配制成試劑A；取0.25 g NaOH溶解于適量去離子水中，加75 mg間苯基苯酚，攪拌溶解后定容至50 mL配制成試劑B；取7.5 mg葡萄糖醛酸，溶解于適量去離子水中并定容至50 mL（150 g/mL）配制成糖醛酸標準溶液，再取多個試管分別加入不同劑量的標準液或樣品液、水、試劑A，100 ℃水浴反應5 min后各管加入試劑B，混勻后室溫條件下反應15 min，根據(jù)標準曲線計算樣品糖醛酸含量。

1.3.3 動物分組、造模及給藥

40 只雄性C57BL/6小鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組8 只，即對照組（CTL）、模型組（MOD）、陽性藥組（Pro：30 mg/kg）、刺梨果多糖低劑量組（CL-L：50 mg/kg）、刺梨果多糖高劑量組（CL-H：100 mg/kg）。除對照組與模型組小鼠，其余各組小鼠連續(xù)灌胃（ig）給藥14 d。從第8天開始參考文獻[20]造模給藥，對照組小鼠腹腔注射（ip）相同劑量的生理鹽水，其余各組小鼠均ip ISO（10 mL/kg），連續(xù)7 d，構(gòu)建MI小鼠模型。

1.3.4 心電圖檢測

末次造模1 h后ip 1%戊巴比妥麻醉小鼠，固定四肢，將心電圖儀各導聯(lián)按標準連接四肢，記錄心電圖ST段變化。

1.3.5 心肌梗死率檢測

取各組小鼠心臟置于冰冷的生理鹽水潤洗后立即放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，垂直于心臟長軸方向切1～2 mm厚度的切片，加入TTC染色液在37 ℃恒溫箱避光染色30 min，觀察并通過Image-Pro Plus 6.0獲得心梗死面積，按下式計算心肌梗死率：

1.3.6 心臟指數(shù)分析

觀察心臟外觀形態(tài)并稱取質(zhì)量，按下式計算心臟指數(shù)：

1.3.7 心臟組織病理學觀察

取小鼠心臟縱切并用中性甲醛固定，使用甲苯及梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，使用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.8 小鼠血清指標檢測

取小鼠全血室溫靜置2 h，12000 r/mim離心10 min取上清液，按照試劑盒說明書步驟分別檢測SOD與LDH活性和MDA含量。

1.3.9 Western blot檢測心肌組織氧化應激及凋亡相關通路蛋白

稱取心臟組織，按體積比1∶10加入預冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），勻漿后12000 r/mim離心取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒對樣品蛋白定量，再進行熱變性。將等量蛋白樣品通過10%聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳進行蛋白分離，將蛋白0.3 A恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜，PBST（PBS加0.1%吐溫20）洗膜3 次（5 min/次），5%脫脂奶粉封閉2 h。PBST洗膜，加入一抗（Keap1、Nrf2、HO-1、NOX2、Caspase 3、Bcl2和Bax），4 ℃孵育過夜。次日PBST洗膜，加入兔二抗（稀釋液按1∶10000稀釋）孵育2 h，PBST洗膜，加入顯影液，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯色并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 24.0軟件采用單因素方差分析方法進行統(tǒng)計分析，并使用GraphPad Prism 7.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨果多糖理化性質(zhì)

刺梨果實500 g經(jīng)水提醇沉、透析和冷凍干燥，獲得刺梨果粗多糖，得率為2.36%。經(jīng)檢測刺梨果粗多糖中的中性糖含量為196.2 mg/g，糖醛酸含量為179.6 mg/g。

2.2 刺梨果多糖對MI小鼠心電圖的影響

刺梨果多糖對小鼠心電圖影響如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠心電圖ST段明顯抬高，與現(xiàn)有研究結(jié)果[21]一致。給予刺梨果多糖后小鼠心電圖ST段都有明顯降低。

圖1 刺梨果多糖對MI小鼠心電圖的影響Fig.1 Effects of R.roxburghii Tratt polysaccharides on the electrocardiogram of mice with MI

2.3 刺梨果多糖對MI小鼠心臟形態(tài)及心臟指數(shù)的影響

如圖2所示，模型組小鼠心臟與對照組比較明顯腫大，并且心臟指數(shù)呈顯著升高趨勢（P＜0.001）；與模型組小鼠比較，各給藥組小鼠心臟都有一定程度的恢復，并且小鼠心臟指數(shù)均顯著降低，且刺梨果多糖高劑量組小鼠心臟恢復效果更佳，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

圖2 刺梨果多糖對MI小鼠心臟形態(tài)及心臟指數(shù)的影響Fig.2 Effects of R.roxburghii Tratt polysaccharides on cardiac morphology and cardiac index in mice with MI

2.4 刺梨果多糖對MI小鼠心臟組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組小鼠心肌組織排列緊密，未發(fā)現(xiàn)有炎癥細胞浸潤等病理狀態(tài)；與對照組小鼠心肌組織相比較，模型組小鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的細胞間隙，局部炎癥細胞浸潤，出現(xiàn)明顯的纖維化組織和早期膠原沉淀，并伴有少量心肌空泡的產(chǎn)生；與模型組小鼠相比較，刺梨果多糖給藥組小鼠心臟病理情況發(fā)生了明顯的改善，且高劑量組小鼠心肌組織恢復更顯著，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性關系。

圖3 刺梨果多糖對MI小鼠心臟組織病理變化的影響（×200）Fig.3 Effects of R.roxburghii Tratt polysaccharides on histopathological changes in the heart of mice with MI (×200)

2.5 刺梨果多糖對MI小鼠心肌梗死面積的影響

TTC可將正常心肌組織染為紅色，而顏色較淡的部分為梗死組織。如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠心臟有明顯的缺血梗死表現(xiàn)；與模型組比較，刺梨果多糖給藥組小鼠心臟缺血壞死部分均顯著減少，其中高劑量組小鼠減少更為明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性關系。

圖4 刺梨果多糖對MI小鼠心肌梗死面積的影響Fig.4 Effects of R.roxburghii Tratt polysaccharides on myocardial infarction area in mice with MI

2.6 刺梨果多糖對MI小鼠血清學相關指標的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中MDA含量顯著增加（P＜0.001），LDH活力顯著升高（P＜0.001），而SOD活力顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比較，刺梨果多糖各給藥組小鼠血清中MDA含量均顯著降低（P＜0.001），LDH活力顯著下降（P＜0.001），SOD活力顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），且高劑量變化更明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性關系。

圖5 刺梨果多糖對MI小鼠血清MDA含量以及SOD、LDH活力的影響Fig.5 Effects of R.roxburghii Tratt polysaccharides on serum MDA content and SOD and LDH activity in mice with MI

2.7 刺梨果多糖對MI小鼠心臟Keap1-Nrf2信號通路及NOX2、Bcl2、Bax和Caspase 3蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，模型組小鼠心臟中NOX2、Keap1、Bax和Caspase 3蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），Nrf2、HO-1及Bcl2表達顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；給予刺梨果多糖后小鼠心臟NOX2、Keap1、Bax和Caspase 3表達顯著下調(diào)，Nrf2、HO-1及Bcl2表達顯著上調(diào)。

圖6 刺梨果多糖對MI小鼠心肌組織Keap1-Nrf2信號通路及NOX2、Bcl2、Bax及Caspase 3蛋白表達的影響Fig.6 Effects of R.roxburghii Tratt polysaccharides on the Keap1-Nrf2 signaling pathway and the expression of NOX2,Bcl2,Bax and caspase 3 proteins in the myocardial tissue of ischemic mice

3 討論

IHD發(fā)病率逐年升高，已然成為危害人類生命健康的重大疾病[22]，患者發(fā)病時會有胸悶氣短等明顯癥狀，嚴重影響人們?nèi)粘Ｉ頪23]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)IHD主要發(fā)病原因與氧化應激、鈣超載、線粒體損傷、炎癥反應、細胞凋亡等因素密切相關，其中氧化應激被普遍認為是IDH發(fā)病重要的因素之一[8,24]，而刺梨果中含有豐富的多糖，可以有效地清除ROS，抵御氧化應激[25]，因此本研究通過ISO誘導小鼠MI來探究刺梨果多糖對MI的預防作用及相關機制。

IHD發(fā)生時會導致心肌細胞嚴重缺氧、心肌纖維化和心室重構(gòu)等病理狀況，使得心臟腫大[26]，1909年第一次記錄IHD心電圖模式ST段抬高，此后心電圖是成為檢測心臟病理情況最直觀簡易的手段[27]。IHD會導致心肌細胞中產(chǎn)生的大量ROS和炎性細胞無法被清除，誘發(fā)氧化應激反應，造成細胞凋亡，心肌組織局部缺氧梗死[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠心臟與正常小鼠心臟相比明顯變大，心電圖ST段明顯抬高，TTC染色液結(jié)果顯示心肌組織梗死面積顯著增加，通過病理切片也觀察到明顯的炎癥浸潤并伴有少量的心肌空泡，心肌組織出現(xiàn)明顯的細胞間隙；經(jīng)刺梨果多糖預防給藥后，小鼠心臟大小恢復至正常，ST段明顯降低，梗死面積也顯著減少，并且從病理切片也觀察到炎性細胞明顯減少，細胞間隙縮減，以上結(jié)果表明刺梨果多糖有效抑制ISO誘導的小鼠心肌損傷。MI過程中，未及時被清除的ROS會激活脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量MDA，增加細胞膜通透性，使LDH進出血液，血清中LDH活性升高[30-32]，機體第一道氧化應激防線SOD能夠有效清除ROS，但由于氧化應激造成的線粒體受損，使得SOD活性下降，無法正常清除自由基發(fā)揮抗氧化的作用[33-35]。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠血清SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加，LDH活性顯著升高；經(jīng)刺梨果多糖預防給藥后，小鼠血清SOD活性顯著升高，MDA含量也顯著減少且LDH活性顯著下降，表明刺梨果多糖通過抑制氧化應激損傷減少小鼠因ISO誘導造成的心肌細胞死亡。

早期研究發(fā)現(xiàn)NOX2是產(chǎn)生ROS主要蛋白酶之一[36]。ROS通過激活Caspase 3，同時參與Bcl2、Bax的調(diào)控來誘導細胞凋亡[37-38]，Nrf2直接參與氧化應激，Keap1為氧化應激傳感蛋白，參與Nrf2的反饋調(diào)節(jié)，兩者可在核外相互結(jié)合達到平衡，在氧化應激情況下Nrf2在胞內(nèi)積累，易位到細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)HO-1水平，抑制氧化應激從而達到保護細胞的目的[39-42]。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠心臟NOX2、Keap1、Bax和Caspase 3蛋白表達顯著上調(diào)，Nrf2、HO-1和Bcl2蛋白表達顯著下調(diào)，而刺梨多糖給藥組中NOX2、Keap1、Bax和Caspase 3蛋白表達顯著下調(diào)，Nrf2、HO-1和Bcl2蛋白表達顯著上調(diào)，表明刺梨果多糖可激活Keap1-Nrf2信號通路，抑制氧化應激，通過上調(diào)Bcl2并下調(diào)Bax與Caspase 3蛋白表達減少細胞凋亡，從而減少ISO誘導的小鼠心肌損傷。

綜上所述，刺梨果多糖可有效減少ISO誘導小鼠心肌梗死面積，降低心肌LDH活性，增加SOD活性并抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮防治MI的作用。其作用機制與通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2信號通路和Bcl2、Bax及Caspase 3蛋白表達改善氧化應激損傷、抑制心肌細胞死亡有關，可為將刺梨果多糖開發(fā)為功能性食品提供重要參考。

4 結(jié)論

本研究通過水提醇沉的方法提取刺梨果中多糖成分，并發(fā)現(xiàn)其可對小鼠MI起到保護作用。因此本實驗通過ISO誘導小鼠MI模型的經(jīng)典造模方法探究刺梨果多糖改善小鼠MI的作用機制，發(fā)現(xiàn)刺梨果多糖可以通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2信號通路抑制氧化應激，恢復抗氧化關鍵酶的活性，減少脂質(zhì)過氧化，從而減少MDA的產(chǎn)生，同時調(diào)節(jié)蛋白Bcl2、Bax及Caspase 3的表達減少心肌細胞的凋亡，進而改善MI病理狀態(tài)。