李瑋軒，解東超，邵晨陽，張 悅，呂海鵬，林 智，杜琪珍,*，朱 蔭,*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

茶葉是全球三大無酒精飲料之一，受到了世界各國(guó)人民的廣泛喜愛[1]。綠茶位居中國(guó)傳統(tǒng)六大茶類之首，是中國(guó)產(chǎn)量最高的茶類，按照殺青和干燥方式的不同可分為炒青、烘青、蒸青和曬青綠茶4 類[2]。烘青綠茶產(chǎn)區(qū)分布較為廣泛，主要以安徽、浙江、福建三省為主，其余地區(qū)也有少量生產(chǎn)[3]。烘青綠茶因其烘干的干燥方式而得名，在綠茶揉捻后即直接烘干，可最大限度保留來自茶樹品種本身的天然風(fēng)味，往往作為綠茶良種選育的首選加工工藝[4]。查明不同品種烘青綠茶的風(fēng)味物質(zhì)組成，可為高香茶樹品種選育、綠茶風(fēng)味品質(zhì)的定向加工與調(diào)控等提供科學(xué)理論依據(jù)。

香氣作為茶葉風(fēng)味的主要影響因子，對(duì)其品質(zhì)起著重要作用，關(guān)乎到茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣，影響著消費(fèi)者喜好度[5]。茶葉香氣的實(shí)質(zhì)是上百種揮發(fā)性成分以不同濃度組合而成的有機(jī)混合物，主要來源于茶樹鮮葉及后期加工中的生物合成途徑及糖苷、類胡蘿卜素、脂肪酸、氨基酸等前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[6]。迄今為止，已從茶葉中分離并鑒定出700 種以上揮發(fā)性物質(zhì)[7]，然而由于各化合物的氣味特征及氣味閾值差別迥異，并非所有揮發(fā)性物質(zhì)都對(duì)茶葉香氣品質(zhì)形成具有直接貢獻(xiàn)，僅有一部分具有高香氣強(qiáng)度（aroma intensity，AI）值或高香氣活度值的嗅感物質(zhì)對(duì)茶葉香氣品質(zhì)起著關(guān)鍵作用。目前茶葉中約有184 種嗅感物質(zhì)被鑒定出，包括醛、酮、醇、酚、吡嗪、硫化物、呋喃、呋喃酮、酸、酯、吲哚、吡咯、吡咯啉、氧化物、噻唑、二氫噻唑、硫酚、芳香族化合物、萜烯等[8]。研究表明，芳樟醇、香葉醇、反式β-紫羅蘭酮、庚醛、2-戊基呋喃、水楊酸甲酯等是許多烘青綠茶的關(guān)鍵嗅感成分，但不同品種或產(chǎn)地的烘青綠茶中嗅感物質(zhì)組成也不盡相同[9-11]。

由于揮發(fā)性化合物總量?jī)H占茶葉干質(zhì)量的0.01%左右，所以茶葉香氣的提取方法至關(guān)重要。目前茶葉香氣的提取方法眾多，如頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）[12]、減壓蒸餾萃取（vaccum distillation extraction，VDE）[13]、同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）[14]、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）[15]、動(dòng)態(tài)頂空（dynamic headspace，DHS）萃取[16]、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）[17]等。HS-SPME是目前最廣泛使用的茶葉香氣富集方法，操作簡(jiǎn)便，但不同纖維涂層對(duì)不同類型的物質(zhì)吸附程度不同，且吸附容量小、易過載；VDE可以在較為溫和的條件下提取出茶葉香氣成分，但耗時(shí)長(zhǎng)，且需要的茶葉用量大；SDE是傳統(tǒng)提取方法，雖操作簡(jiǎn)便、溶劑用量少、萃取效率較高、重現(xiàn)性好，但提取溫度過高，易發(fā)生降解反應(yīng)，所獲得的茶葉香氣物質(zhì)往往失真；SAFE法雖然萃取過程較為溫和、能夠較全面提取樣品中的揮發(fā)性成分，但價(jià)格昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)操作者的操作技能及嫻熟度有較高要求；SBSE與HS-SPME的吸附原理相似，而吸附量是HS-SPME的10 倍之多，是一種理想的提取方式，但成本較高，且對(duì)茶湯上方的低沸點(diǎn)香氣成分吸附效果欠佳；DHS萃取不僅適用于復(fù)雜基質(zhì)中揮發(fā)性較高的組分，對(duì)較難揮發(fā)及濃度較低的組分也同樣有效，且因其具有所需樣品量少、重現(xiàn)性好、靈敏度高、全自動(dòng)化等特點(diǎn)，能較好地反映茶葉中揮發(fā)性成分的整體輪廓[18]，已逐漸引起研究者們的關(guān)注[19-21]，但該方法也有一定缺陷，傾向于萃取疏水性化合物，對(duì)親水性化合物富集效果一般，需要不斷優(yōu)化技術(shù)[19]。Ochiai等[19]采用全樣品蒸發(fā)-動(dòng)態(tài)頂空多次萃取模式確認(rèn)了日本綠茶中的50 種香氣成分，王顧希等[20]采用動(dòng)態(tài)頂空萃取聯(lián)合熱脫附/氣相色譜-質(zhì)譜（DHS-thermal desorption/gas chromatography-mass spectrometry，DHS-TD/GC-MS）結(jié)合主成分分析（principle component analysis，PCA）法鑒定出了11 個(gè)產(chǎn)區(qū)綠茶中的50 種共有香氣成分及27 種特征香氣成分，田甜等采用類似方法確認(rèn)了不同季節(jié)凌云白毫綠茶中37 種香氣成分的分布差異[21]。雖然DHS結(jié)合化學(xué)計(jì)量法在茶葉領(lǐng)域有了上述應(yīng)用，但通過該技術(shù)與氣相色譜-嗅覺測(cè)量-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）聯(lián)用法[22]的綜合應(yīng)用從而篩選出能被直觀嗅聞的嗅感物質(zhì)等研究?jī)?nèi)容罕有相關(guān)報(bào)道。

由于DHS涉及的實(shí)驗(yàn)參數(shù)較多，如孵化及捕集溫度、吹掃速率及總量等，均會(huì)影響茶葉香氣的提取效率。為了更加全面地了解烘青綠茶的香氣化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用DHS-TD/GC-MS技術(shù)建立了烘青綠茶香氣成分的最優(yōu)提取方法，繼而采用DHS-TD/GC-O-MS及多元統(tǒng)計(jì)分析手段分析并比較了不同品種烘青綠茶中的主要揮發(fā)性成分及嗅感物質(zhì)，以期為綠茶的加工技術(shù)提升和香氣品質(zhì)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)《中國(guó)無性系茶樹品種志》[4]指導(dǎo)，選擇烘青綠茶適制品種：龍井43、中茶108、福鼎大白茶為研究對(duì)象，在2022年3月于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所嵊州茶葉綜合實(shí)驗(yàn)基地，以統(tǒng)一的一芽一葉為采摘標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采摘。

無水乙醇、正構(gòu)烷烴（C8～C40）北京百靈威科技有限公司；純凈水 杭州娃哈哈有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6 C C H-63 型電炒鍋、6-C H M-901 型碧螺春烘干機(jī) 浙江春江茶葉機(jī)械有限公司；6-CRM-25型茶葉揉捻機(jī) 浙江綠峰機(jī)械有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、20 mL頂空玻璃瓶、HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）美國(guó)Agilent科技有限公司；DHS自動(dòng)采樣系統(tǒng)、ODP-3嗅辯儀、Tenax TA吸附管 德國(guó)Gerstel股份有限公司；AB104-S電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Tube Mill 100 control研磨儀 德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠茶的制備與處理

采用統(tǒng)一的烘青加工工藝（攤放、殺青、揉捻、烘干）制備成相應(yīng)品種的烘青綠茶。具體加工工藝：一芽一葉鮮葉→攤放（室內(nèi)自然攤放10～12 h至葉片含水率為70%左右）→殺青（鍋溫260 ℃、葉溫約90 ℃）→揉捻（空壓（10 min）-輕壓（10～15 min）-空壓（10 min））→初烘（烘干溫度120 ℃、時(shí)間20 min）→復(fù)烘（烘干溫度120 ℃、時(shí)間10 min）。

將各品種的烘青綠茶均勻研磨后，0～4 ℃密封保存待用。從各品種樣中分別取出1 g并混合，制備成質(zhì)量控制樣本，用于DHS分析方法的優(yōu)化。

1.3.2 茶葉感官審評(píng)

委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心對(duì)樣品進(jìn)行感官審評(píng)，并對(duì)各樣品的外形、湯色、香氣、滋味和葉底等指標(biāo)進(jìn)行打分。

1.3.3 DHS萃取方法

DHS自動(dòng)采樣系統(tǒng)由安裝在GC-MS系統(tǒng)上的MPS-2自動(dòng)進(jìn)樣平臺(tái)和Maestro軟件完成（德國(guó)Gerstel股份有限公司）。分別向20 mL頂空進(jìn)樣瓶中加入20、40、60、80、100、200 mg和250 mg混合茶粉，并迅速注入1.0 mL沸蒸餾水。DHS傳輸線溫度設(shè)置為150 ℃，恒溫振蕩器待機(jī)溫度為60 ℃，振蕩模式設(shè)置為振蕩10 s后停止1 s，轉(zhuǎn)速設(shè)置為500 r/min。DHS自動(dòng)采樣系統(tǒng)首先將含待測(cè)樣的頂空進(jìn)樣瓶抓取至恒溫振蕩器中，分別在70、75、80、85 ℃和90 ℃條件下平衡振蕩3 min后，分別采用300、350、400 mL和600 mL的高純氮?dú)猓?9.999%）將頂空瓶中的揮發(fā)性成分吹掃捕集至Te n a x-TA解吸附管，流速分別設(shè)置為10、20、30、40 mL/min和50 mL/min，捕集溫度分別為45、50、55、65 ℃和70 ℃。捕集完成后，用100 mL高純氮?dú)鈱?duì)解吸附管進(jìn)行干燥處理，流速設(shè)置為10、25、50、75 mL/min和100 mL/min，干燥溫度為60 ℃。干燥完成后，將Tenax-TA解吸附管轉(zhuǎn)移至含熱脫附及冷進(jìn)樣系統(tǒng)的進(jìn)樣口中，解吸附后采用上述GC-MS條件分析。各個(gè)品種烘青綠茶的DHS萃取及分析實(shí)驗(yàn)分別做3 次技術(shù)重復(fù)。

1.3.4 熱脫附及冷進(jìn)樣口系統(tǒng)條件

熱脫附采用溶劑排空模式，傳輸線溫度設(shè)置為300 ℃，初始溫度設(shè)為30 ℃，延遲1.0 min，保留1.0 min，以100 ℃/s速率升溫至250 ℃，保持4.0 min。冷進(jìn)樣口采用液氮冷卻至-100 ℃，平衡1.0 min后，以12 ℃/s升溫到280 ℃，保持3.0 min。

1.3.5 GC-MS測(cè)定條件

傳輸線溫度設(shè)為250 ℃，高純氦氣（99.999%）為載氣，流速為1.6 mL/min，采用不分流進(jìn)樣模式。柱溫程序初始溫度為50 ℃，保持3.0 min后以4 ℃/min升至265 ℃，并保持5.0 min。質(zhì)譜條件：EI電離能量為-70 eV；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；運(yùn)行全掃描模式，質(zhì)譜傳輸線溫度為250 ℃，掃描質(zhì)量范圍30～450 u；溶劑延遲3.0 min。

1.3.6 GC-O-MS測(cè)定條件

GC-MS測(cè)定條件與1.3.5節(jié)保持一致；GC-O-MS的嗅辯儀端與MS端1∶1分流進(jìn)樣；嗅聞口溫度150 ℃；傳輸線溫度220 ℃；補(bǔ)償氣為高純氮?dú)猓?9.999%，流速50 mL/min）。嗅聞分析組由6 名具有豐富審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的健康審評(píng)員組成，所有嗅聞人員對(duì)GC-O有較好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并經(jīng)過了至少30 h的標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)際茶樣培訓(xùn)；在實(shí)驗(yàn)過程中若至少有3 名評(píng)價(jià)員在同一嗅聞時(shí)間處得到相同的感官描述，則將該記錄記入最終結(jié)果，并進(jìn)行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)鑒定。感官評(píng)價(jià)員不僅要描述化合物的氣味性質(zhì)，還要確定化合物的AI值。AI用數(shù)值“1～4”表示，“1”表示香氣強(qiáng)度弱，“2”表示香氣強(qiáng)度中等，“3”表示香氣強(qiáng)度強(qiáng)，“4”表示香氣強(qiáng)度非常強(qiáng)。取各審評(píng)人員的AI平均值作為最終數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

茶葉揮發(fā)性成分的定性通過：1）NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動(dòng)檢索、與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)（相似度＞75%）；2）結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)分析、排除干擾物質(zhì)；3）保留指數(shù)（retention index，RI）驗(yàn)證（計(jì)算值與報(bào)道值差值小于20）；4）部分重要化合物（如嗅感物質(zhì)）的標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證等步驟完成。揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量采用峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算。柱狀圖采用Excel 2013（美國(guó)Microsoft公司）完成；PCA、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）采用SIMCA 14.1軟件（瑞典Umetrics公司）完成，原始數(shù)據(jù)均采用unit variance scaling（UV）歸一化處理；非參數(shù)檢驗(yàn)、單因素方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS Statistics 20.0（美國(guó)IBM公司）完成；層次聚類分析使用MeV生物信息學(xué)分析軟件（美國(guó)Oracle公司）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHS分析方法的建立

為探明DHS-TD/GC-MS的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行了如下單因素試驗(yàn)，并對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。盡管茶湯的濃度與茶葉中蘊(yùn)含的揮發(fā)性物質(zhì)在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，但隨著茶葉用量的增加，茶湯里的溶質(zhì)處于飽和狀態(tài)后，揮發(fā)性物質(zhì)的含量增加變緩，甚至可能出現(xiàn)下降趨勢(shì)[23]。本實(shí)驗(yàn)首先考察了茶葉用量（20～250 mg）對(duì)茶葉揮發(fā)性成分的影響，以統(tǒng)一的方法沖泡后，在其他條件一致的情況下，分別經(jīng)過DHSTD/GC-MS提取并檢測(cè)后，以識(shí)別到的化合物（未精確定性）的總峰面積和數(shù)量評(píng)價(jià)萃取效果。如圖1A所示，當(dāng)茶葉用量為200 mg時(shí)，所獲得的總峰面積最高（P＜0.05），化合物數(shù)量最多（P＜0.05），因此，茶葉用量為200 mg時(shí)DHS的萃取效率最佳。

圖1 各因素對(duì)DHS萃取效率的影響Fig.1 Effect of various factors on the extraction efficiency of DHS

溫度也是影響茶葉香氣的揮發(fā)及提取效率的一個(gè)關(guān)鍵因素[24]?；谧罴巡枞~用量，本實(shí)驗(yàn)依次探究了不同捕集溫度及孵化溫度及對(duì)DHS萃取效率的影響。當(dāng)捕集溫度為70 ℃時(shí)，總峰面積及化合物數(shù)量均顯著優(yōu)于其他溫度（P＜0.05，圖1B）；隨著孵化溫度的提高，總峰面積呈顯著下降趨勢(shì)，而化合物數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在75 ℃時(shí)最多，綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)孵化溫度為70 ℃時(shí)，萃取效率最高（圖1C）。

由于DHS萃取的核心操作原理是利用氣體動(dòng)態(tài)吹掃樣品，從而使樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)被氣流源源不斷地帶入至具有吸附劑的捕集裝置中，因此吹掃的氣體總流量也是DHS的重要參數(shù)[25]?；谝呀?jīng)優(yōu)化好的上述參數(shù)，設(shè)置了300～600 mL的吹掃總量，考察相應(yīng)的萃取效率。如圖1D所示，吹掃總流量對(duì)化合物的總峰面積具有一定顯著影響，對(duì)化合物數(shù)量無顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)吹掃總流量為350 mL時(shí)，總峰面積最高；當(dāng)吹掃總流量為400 mL時(shí)，化合物數(shù)目略高于其他流量。綜合分析得出，DHS萃取方法的最佳吹掃總流量為350 mL。

當(dāng)吹掃總流量固定后，DHS的吹掃速率決定了萃取時(shí)間，而萃取時(shí)間在一定程度上與茶葉香氣總量呈正比[26]。對(duì)DHS的吹掃速率進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1E所示，隨著吹掃速率的不斷增加，總峰面積和化合物數(shù)量呈先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)吹掃速率為10 mL/min時(shí)，DHS萃取效率最高，對(duì)應(yīng)的萃取時(shí)間為35 min。最后探究最優(yōu)干燥速率，如圖1F所示，隨著干燥速率的增加，總峰面積顯著降低。而干燥速率在10～50 mL/min時(shí)，化合物數(shù)量無顯著變化，當(dāng)干燥速率升至75 mL/min時(shí)，化合物數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。因此，DHS萃取方法的最優(yōu)干燥速率為10 mL/min。

綜上，當(dāng)茶葉用量為200 mg、捕集溫度為70 ℃、孵化溫度為70 ℃、吹掃總流量為350 mL、吹掃速率為10 mL/min、干燥速率為10 mL/min時(shí)，烘青綠茶揮發(fā)性成分的萃取效率最高，為DHS-TD/GC-MS的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 不同品種烘青綠茶的感官審評(píng)結(jié)果

為探究茶樹品種對(duì)茶葉揮發(fā)性成分的影響，選取3 個(gè)代表性茶樹品種（龍井43、中茶108、福鼎大白茶），以統(tǒng)一加工工藝制備成烘青綠茶，并通過感官審評(píng)衡量茶葉品質(zhì)。3 個(gè)不同品種的烘青綠茶的感官審評(píng)結(jié)果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)，各項(xiàng)指標(biāo)得分均在85.0～93.5之間，達(dá)到了優(yōu)良綠茶感官審評(píng)的標(biāo)準(zhǔn)，其中龍井43總體得分最高（90.9 分）。從香氣得分來看，3 個(gè)品種的烘青綠茶得分介于92.5～93.5之間，主要呈現(xiàn)“清香”“花香”“栗香”等香氣特征，具有較好的烘青綠茶的代表性。這3 種烘青綠茶香氣特征描述略有不同，龍井43、中茶108主要體現(xiàn)“清香”“花香”特征，但中茶108的“花香”更為明顯，而福鼎大白茶則略有“栗香”，這說明茶葉品種對(duì)烘青綠茶的香氣品質(zhì)有著顯著影響，不同品種的烘青綠茶其化學(xué)成分的種類及含量存在差異，因此這也為后續(xù)GC-O實(shí)驗(yàn)的開展奠定了良好的基礎(chǔ)。

表1 3 個(gè)不同品種烘青綠茶的感官審評(píng)結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of baked green teas made from three different varieties

2.3 不同品種烘青綠茶中的揮發(fā)性成分輪廓分析

采用優(yōu)化過的DHS-TD/GC-MS方法對(duì)3 個(gè)不同品種烘青綠茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取分析，并通過譜庫檢索、結(jié)構(gòu)分析、RI驗(yàn)證等方式進(jìn)行定性，最終共鑒定出不同品種的烘青綠茶中的揮發(fā)性物質(zhì)74 種，其中龍井43烘青綠茶74 種，中茶108烘青綠茶71 種，福鼎大白茶烘青綠茶74 種。根據(jù)揮發(fā)性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為醇類19 種、烯類19 種、酯類11 種、醛類10 種、酮類9 種、芳香族化合物5 種以及含氮化合物1 種。采用峰面積歸一化法對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

相對(duì)定量分析結(jié)果表明，3 個(gè)品種的烘青綠茶的揮發(fā)性化合物種類相同，但在相對(duì)含量分布上具有一定差異。如圖2、表2所示，在3 種綠茶中，醇類化合物均占有最高比例，介于40%～43%之間，其中香葉醇均具有最高相對(duì)含量，介于9.36%～14.76%之間。醛類在龍井43及中茶108中的相對(duì)含量?jī)H次于醇類，比例達(dá)20%及以上，顯著高于其他種類化合物，而在福鼎大白中含量與其他化合物類別差異不顯著；庚醛在3 種茶葉中均為醛類物質(zhì)中相對(duì)含量最高的化合物，但含量差別迥異，介于3.63%～8.88%之間，在中茶108中最高，福鼎大白茶中最低。酯類和烯類化合物在3 種綠茶中的相對(duì)含量均大于等于10%，其中酯類在中茶108烘青綠茶中的相對(duì)含量占比最高（19%）；棕櫚酸甲酯（2.56%～7.53%）、檸檬烯（4.83%～6.34%）分別是酯類和烯類中相對(duì)含量最高的化合物。福鼎大白茶中酮類化合物的相對(duì)含量顯著高于其余兩個(gè)綠茶，其中苯乙酮（5.81%）和環(huán)己酮（3.28%）的相對(duì)含量最高，前者在中茶108綠茶中也為相對(duì)含量最高的酮類物質(zhì)，但其相對(duì)含量?jī)H為0.71%；而龍井43綠茶所含酮類化合物中相對(duì)含量最高的異亞丙基丙酮（1.53%）在其他兩種綠茶中相對(duì)含量較低。芳香族化合物中鄰異丙基甲苯在3 種綠茶中的相對(duì)含量也相對(duì)較高，介于1.27%～3.49%之間。此外，唯一的含氮化合物二丁基甲酰胺在福鼎大白茶中的相對(duì)含量顯著高于其他兩種茶，達(dá)8.50%。

表2 不同品種的烘青綠茶香氣的關(guān)鍵差異性成分含量Table 2 Contents of key differential aroma components in different baked green teas

圖2 龍井43（A）、中茶108（B）和福鼎大白茶（C）中的揮發(fā)性化合物含量比較Fig.2 Comparison of volatile compounds in LJ43 (A),ZC108 (B),and FDDB (C) tea samples

2.4 不同品種烘青綠茶中的關(guān)鍵差異性揮發(fā)性成分分析

為研究不同品種烘青綠茶間的香氣組成差異，基于上述揮發(fā)性成分的定量離子峰面積進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。PCA結(jié)果顯示，在得分圖中3 個(gè)不同品種的烘青綠茶樣品可以較好地被區(qū)分，其中中茶108及龍井43樣品較為接近，主要分布在第二、三象限，而福鼎大白茶分布在第四象限（圖3A），這表明3 種茶葉在香氣組成上具有較為明顯的差異，但前兩者化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)相對(duì)接近。接下來，采用有監(jiān)督的PLS-DA模型對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行進(jìn)一步分析，獲得了理想的區(qū)分效果和理想的擬合參數(shù)（＝0.991，Q2＝0.927），3 種茶葉的樣品散點(diǎn)分別分布在第一（龍井43）、第三（福鼎大白茶）及第四（中茶108）象限（圖3B），分析結(jié)果表明，共有41 種揮發(fā)性成分的變量重要性因子（variable important for the projection，VIP）值＞1，可能是3 種烘青綠茶的潛在關(guān)鍵差異性揮發(fā)性成分。然而，上述PLS-DA模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示雖然Q2與Y軸的截距小于0（-0.159），但R2與Y軸的截距較大（0.884）（圖3C，n＝200），存在一定的過擬合現(xiàn)象。為了排除干擾，進(jìn)一步采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)潛在的41 種關(guān)鍵差異性揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，共篩選出18 種化合物的含量在3 種綠茶中存在顯著性差異（P＜0.05），包括異亞丙基丙酮、環(huán)己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛、3-蒥烯、2-乙基-1-己醇、苯乙酮、芳樟醇、二丁基甲酰胺、古巴烯、β-蓽澄茄油烯、3,5-杜松二烯、γ-衣蘭油烯、蓽澄茄醇、δ-杜松烯、菖蒲烯、蓽澄茄油烯及表蓽澄茄油烯醇。

圖3 不同品種烘青綠茶的PCA（A）、PLS-DA（B）得分圖及其驗(yàn)證模型（C）Fig.3 PCA score plot (A),PLS-DA score plot (B) and permutation test plot (C) of baked green tea samples from different cultivars

為了更加形象直觀地呈現(xiàn)各揮發(fā)性香氣化合物在各茶葉樣本中的含量分布情況，采用層序聚類分析法對(duì)這18 種關(guān)鍵差異性揮發(fā)性的含量分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。熱圖中方塊顏色越接近黃色說明化合物含量越高，而越接近藍(lán)色說明化合物含量越低，黑色為各樣品中相應(yīng)化合物的含量中位數(shù)。根據(jù)分布趨勢(shì)，可將化合物分為3 類：1）異亞丙基丙酮及芳樟醇在龍井43烘青綠茶中的含量顯著高于其他兩類茶；2）2-乙基-1-己醇、蓽澄茄醇、γ-衣蘭油烯、3-蒥烯、二丁基甲酰胺、菖蒲烯、β-蓽澄茄油烯、3,5-杜松二烯、δ-杜松烯、蓽澄茄油烯在福鼎大白茶的分布最為豐富，在龍井43中也具有較高含量，而中茶108烘青綠茶中含量顯著較低；3）6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛、環(huán)己酮、苯乙酮、古巴烯、表蓽澄茄油烯醇僅在福鼎大白茶中具有最高含量，而在其余兩種烘青綠茶中的含量顯著低于前者。以上化合物的鑒定為不同品種烘青綠茶的品質(zhì)判別提供了新的技術(shù)思路，也為高香綠茶的香氣品質(zhì)形成機(jī)理研究奠定了理論基礎(chǔ)。

圖4 不同品種烘青綠茶間關(guān)鍵差異性揮發(fā)性化合物的含量分布熱圖Fig.4 Heatmap of the contents of key differential volatile components among baked green tea samples from different cultivars

2.5 不同品種烘青綠茶中的嗅感物質(zhì)分析

為查明各烘青綠茶中對(duì)香氣品質(zhì)形成具有直接貢獻(xiàn)的嗅感物質(zhì)組成，進(jìn)一步采用DHS-TD/GC-O-MS對(duì)烘青綠茶的香氣提取物進(jìn)行分析，如表3所示，從3 種茶葉樣品中共鑒定出28 種嗅感物質(zhì)，其中龍井43中28 種，中茶108中26 種，福鼎大白茶中28 種。

表3 3 種烘青綠茶中嗅感物質(zhì)的氣味特征及強(qiáng)度Table 3 Odor descriptions and aroma intensities of odorants in three types of baked green tea

如表3所示，上述28 種嗅感物質(zhì)根據(jù)氣味屬性可以分為青香、清新、花果香、草本香、木香、甜香及其他。其中青香、清新型化合物有9 種，數(shù)目最多；花果香和草本香、木香化合物數(shù)目次之，均為8 種；而甜香及其他化合物數(shù)目最少，只有1～2 種。在AI總和方面，3 種綠茶呈現(xiàn)出龍井43（68.59）＞福鼎大白茶（65.26）＞中茶108（50.50）的排列順序。3 種綠茶中不同香氣屬性的分布情況如圖5所示，它們的香氣輪廓相似度較高，均呈現(xiàn)出花果香屬性最高（18.00～23.75），青香、清新屬性次之（13.58～21.25）的分布趨勢(shì)，且兩種屬性中均是在龍井43中最高，中茶108最低。草本香、木香屬性在福鼎大白茶中的貢獻(xiàn)最為突出（18.09），在龍井43綠茶中該數(shù)值也較為接近（17.17），在中茶108中顯著低于其他兩種茶葉（13.17）。由于甜香及其他屬性的化合物個(gè)數(shù)較少，導(dǎo)致其AI數(shù)值均低于10，其中甜香屬性呈現(xiàn)出福鼎大白茶＞中茶108＞龍井43的趨勢(shì)，而其他屬性呈現(xiàn)出龍井43＞中茶108＞福鼎大白茶的趨勢(shì)。

圖5 3 種烘青綠茶嗅感物質(zhì)的氣味屬性雷達(dá)圖Fig.5 Radar map of odor attributes of odorants in three baked green tea samples

β-月桂烯（青氣、鐵銹）是龍井43和中茶108烘青綠茶中香氣強(qiáng)度最高的青香型化合物，但在前者中略高于后者。結(jié)合各茶樣的感官審評(píng)結(jié)果推測(cè)，該物質(zhì)可能對(duì)龍井43及中茶108烘青綠茶的“清香”品質(zhì)起到較大的促進(jìn)作用。壬醛（清新、黃瓜、泥土）在龍井43中的香氣強(qiáng)度與β-月桂烯相同，在中茶108中的含量?jī)H次于β-月桂烯。而福鼎大白茶烘青綠茶中，呈現(xiàn)青椒、辛辣、青氣特征的反式-3-己烯丁酸酯呈現(xiàn)最高的香氣強(qiáng)度，β-月桂烯次之。己醛（青葉香、青蘋果、青草氣）是3 種綠茶樣品中香氣強(qiáng)度均最低的具有青香特性的嗅感物質(zhì)，AI值均低于2。此外，水楊酸甲酯（冬青油、薄荷）、香葉基丙酮（清新、新鮮、清香）等在龍井43和福鼎大白茶烘青綠茶中AI值尚可的嗅感物質(zhì)在中茶108中未能被識(shí)別，這可能是導(dǎo)致中茶108綠茶“花香”屬性更為突出的間接原因。

在龍井43中，呈現(xiàn)花果香的化合物的香氣強(qiáng)度整體上顯著高于其他兩個(gè)品種。對(duì)龍井43花果香貢獻(xiàn)最大的是香葉醇（花香、玫瑰，3.50），該物質(zhì)也是所有鑒定出來的嗅感物質(zhì)中香氣強(qiáng)度最高的化合物，其次是苯乙醛（玫瑰香、蜜香，3.25）和芳樟醇（花香、清新，3.25），貢獻(xiàn)最小的是癸醛（花香、甜香，2.50）和苯甲酸異丁酯（玫瑰、濃膩，2.50）。對(duì)中茶108綠茶花果香屬性貢獻(xiàn)最大的嗅感物質(zhì)是苯乙醛（3.00）和香葉醇（3.00），苯甲酸異丁酯、反式β-紫羅蘭酮（紫羅蘭、粉質(zhì)花香、幽雅果香，2.50）次之，貢獻(xiàn)度最小的是3-十一烷酮（鳶尾花香、清香，1.25）。對(duì)福鼎大白茶花果香屬性貢獻(xiàn)度最大的嗅感物質(zhì)是芳樟醇（3.25），辛醛（檸檬果香、花香、花蜜香）、苯乙醛、香葉醇次之，強(qiáng)度均為3.00，而貢獻(xiàn)度最低的是也是3-十一烷酮。雖然龍井43及中茶108烘青綠茶的總體香氣均呈現(xiàn)“花香”特性，但綜合GC-O-MS嗅聞結(jié)果可知，龍井43綠茶中的青香屬性物質(zhì)也較為突出，可能與“花香”物質(zhì)存在一定的香氣互作效應(yīng)，從而導(dǎo)致其“花香”特性低于中茶108烘青綠茶。

草本香、木香氣味特征的化合物的香氣強(qiáng)度普遍弱于前兩種香氣屬性，其中順式呋喃型芳樟醇氧化物（草本、泥土，2.75）和β-環(huán)檸檬醛（草藥、草本，2.75）對(duì)龍井43烘青綠茶的草本香貢獻(xiàn)最明顯，反式吡喃型芳樟醇氧化物（草本、泥土）在中茶108和福鼎大白茶的草本香化合物中均具有最高的香氣強(qiáng)度值，分別為2.00和2.75。龍井43烘青綠茶中大部分草本香嗅感物質(zhì)的AI值大于等于2.00，僅α-杜松醇的AI值為1.67；福鼎大白茶中草本類嗅感物質(zhì)的香氣強(qiáng)度也普遍大于等于2.00，但β-環(huán)檸檬醛、雪松醇例外；相反，在中茶108烘青綠茶中僅反式吡喃型芳樟醇氧化物AI值達(dá)到2.00，其余嗅感物質(zhì)的AI值介于1.50～1.75。

在3 個(gè)品種的綠茶樣品中共鑒定出的2 種具有甜香屬性的嗅感物質(zhì)均為酯類，其中甲基苯甲酸甲酯在龍井43、中茶108和福鼎大白茶中均具有較強(qiáng)的香氣強(qiáng)度，是對(duì)甜香貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)。此外，在3 個(gè)品種的烘青綠茶中還鑒定出了具有熟香、油脂氣味的庚醛，且該物質(zhì)在龍井43中的AI值（2.75）顯著高于另外兩種茶。

2.6 不同品種烘青綠茶中的關(guān)鍵差異性嗅感物質(zhì)鑒定

綜合多元統(tǒng)計(jì)分析和嗅聞分析結(jié)果可知，芳樟醇、菖蒲烯、δ-杜松烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛醛是2 種分析結(jié)果中共同存在的化合物，可能是不同品種烘青綠茶中的潛在關(guān)鍵差異性嗅感物質(zhì)。為了進(jìn)一步探究不同品種烘青綠茶中關(guān)鍵差異性嗅感物質(zhì)的含量與香氣強(qiáng)度之間的關(guān)系，將3 種烘青綠茶中上述化合物的定量離子峰面積與AI值進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果如圖6所示。各化合物在不同茶樣中的含量及香氣強(qiáng)度基本呈現(xiàn)一致的分布趨勢(shì)，且它們?cè)邶埦?3和福鼎大白茶中的含量及AI值均顯著高于中茶108。芳樟醇在龍井43和福鼎大白茶烘青綠茶中的香氣強(qiáng)度值相同，但其含量在龍井43綠茶中顯著高于另外2 種茶，被認(rèn)為是龍井43中的特征性嗅感物質(zhì)。菖蒲烯、δ-杜松烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮的峰面積和AI值均呈現(xiàn)出一致的“福鼎大白茶＞龍井43＞中茶108”分布趨勢(shì)；而辛醛的AI值在福鼎大白茶和龍井43中相同，但含量前者顯著高于后者，考慮是由于辛醛的氣味閾值較低[27]導(dǎo)致嗅聞的強(qiáng)度值普遍較高從而無法體現(xiàn)差異。因此，以上4 種化合物被認(rèn)為是福鼎大白茶烘青綠茶中的特征性嗅感物質(zhì)。由于感官審評(píng)結(jié)果中，福鼎大白茶烘青綠茶體現(xiàn)出了其他兩種綠茶未呈現(xiàn)的“栗香”，因此它們也可能是導(dǎo)致該香型的關(guān)鍵嗅感物質(zhì)。

圖6 不同品種烘青綠茶中的關(guān)鍵差異性嗅感物質(zhì)含量及AI的變化趨勢(shì)Fig.6 Trends in the contents and aroma intensities of key differential olfactory substances in roasted green teas made from different cultivars

由于本研究中不同品種的烘青綠茶是在一致條件下制備，因此以上關(guān)鍵嗅感物質(zhì)的含量及AI值差異可能主要來源于品種本身的物質(zhì)基礎(chǔ)差異。芳樟醇是茶葉中常見且最重要的香氣物質(zhì)之一，主要以游離態(tài)和糖苷鍵合態(tài)的形式存在，游離態(tài)芳樟醇從鮮葉到攤放的過程中含量急劇升高，經(jīng)高溫殺青后大量揮發(fā)，在成品綠茶中的含量顯著低于鮮葉[28]，糖苷鍵合態(tài)的芳樟醇主要以櫻草糖苷和葡萄糖苷最為常見，主要在采摘后水解酶活性尚未完全喪失的階段（如綠茶攤放、紅茶萎調(diào)及發(fā)酵等過程）經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[29]。芳樟醇幾乎在所有種類的茶葉中均可被檢測(cè)到，而在龍井43炒青綠茶[30]及中茶108烘青綠茶中[31]均被報(bào)道為關(guān)鍵嗅感物質(zhì)。菖蒲烯、δ-杜松烯是茶葉中常見的倍半萜類物質(zhì)，含量上遠(yuǎn)低于芳樟醇，其形成主要來源于茶樹中萜烯類化合物的生物合成途徑[32]，雖然在茶葉中經(jīng)常被檢測(cè)出，但罕被報(bào)道為關(guān)鍵香氣物質(zhì)。6-甲基-5-庚烯-2-酮是類胡蘿卜素衍生的香氣物質(zhì)，主要來源于酶促降解途徑和非酶促氧化途徑，綠茶中酶促降解主要發(fā)生在攤放階段，而非酶促氧化途徑主要是自氧化反應(yīng)及熱降解反應(yīng)，往往發(fā)生在殺青、揉捻及干燥等過程中[33]。辛醛主要來源于脂肪酸途徑，其前體可能是α-亞麻酸、亞油酸等，在脂氧合酶及脂氫過氧化物裂解酶的作用下經(jīng)多級(jí)裂解后生成，在各種茶葉中均可被檢測(cè)到[34]。

3 結(jié)論

本研究建立了烘青綠茶揮發(fā)性成分的最優(yōu)DHS-TD/GC-MS分析方法，當(dāng)茶葉用量為200 mg、捕集溫度為70 ℃、孵化溫度為70 ℃、吹掃總流量為350 mL、吹掃速率為10 mL/min、干燥速率為10 mL/min時(shí)，揮發(fā)性成分的萃取效果最佳。繼而對(duì)3 種不同品種烘青綠茶的香氣成分進(jìn)行分析，共鑒定出74 種化合物，包括醇類19 種、烯類19 種、酯類11 種、醛類10 種、酮類9 種、芳香族化合物5 種以及含氮化合物1 種。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，3 個(gè)不同品種烘青綠茶中存在18 種關(guān)鍵差異性揮發(fā)性成分，如異亞丙基丙酮、環(huán)己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮等。進(jìn)一步的DHS-TD/GC-O-MS分析結(jié)果表明，3 種烘青綠茶中存在28 種嗅感物質(zhì)，如香葉醇、β-月桂烯、苯乙醛、反式-3-己烯丁酸酯等，主要呈現(xiàn)青香、清新、花果香、草本香、木香、甜香等氣味屬性，其中花果香屬性的香氣強(qiáng)度總和最高，青香、清新屬性次之。綜合多元統(tǒng)計(jì)分析及嗅聞分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芳樟醇、菖蒲烯、δ-杜松烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛醛是3 個(gè)不同品種烘青綠茶間的關(guān)鍵差異性嗅感物質(zhì)，芳樟醇在龍井43烘青綠茶中貢獻(xiàn)顯著，而后四者對(duì)福鼎大白茶烘青綠茶的香氣品質(zhì)形成貢獻(xiàn)顯著。后續(xù)將根據(jù)上述研究結(jié)果，對(duì)不同品種烘青綠茶的關(guān)鍵嗅感物質(zhì)的形成機(jī)制進(jìn)行研究，以期為高香綠茶品種選育、綠茶香氣品質(zhì)的提升與調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。