張紹君,張文樂,孫守峰,段宇萌,王 英
(新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊 830052)
赭曲霉毒素是由曲霉菌屬和青霉菌屬產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物,由A、B、C、D等7 種化合物組成,主要對人和動物腎臟有嚴重危害,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是毒性最大、也是對農(nóng)作物的污染最嚴重的一種[1]。OTA因其對肝、腎的毒性和致畸、致癌性,于1993年被國際癌癥研究機構劃分為2B類致癌物[2]。在多種真菌毒素中,OTA在農(nóng)產(chǎn)品、食品和動物飼料中都有廣泛的分布,例如谷類、谷類制品、葡萄酒、飲料、干果和咖啡中都有被檢測到[3],它的毒性和對農(nóng)產(chǎn)品污染的嚴重性僅次于黃曲霉毒素,因而引起了很多國家和有關組織的關注[4]。在2019年9月,歐盟食品飼料類快速預警系統(tǒng)發(fā)布通報,原產(chǎn)于我國的葡萄干中OTA的檢測結果為21.91 μg/kg,嚴重超過歐盟規(guī)定在葡萄干中OTA的限量規(guī)定(10.0 μg/kg)[5],嚴重影響了我國的葡萄干進出口貿易。
傳統(tǒng)的控制真菌毒素的方法可分為物理法、化學法和生物降解法,主要包括紫外降解[6]、電子束輻照[7]、熱處理[8]、物理吸附[9]、氧化降解[10]、微生物降解法[11]等,但這些方法存在效果不穩(wěn)定、化學物質殘留、降解成本高、營養(yǎng)成分損失較大、難以規(guī)模化生產(chǎn)等缺點。等離子體是一種含有多種離子、電子、激發(fā)態(tài)的原子等活性物質的電離氣體,其活性物質常常被認為是導致微生物的DNA、蛋白質、脂質以及脂質膜損傷的主要原因,從而能夠有效地滅活果汁、牛奶、肉類、水果、蔬菜等食品表面上的產(chǎn)孢和腐敗/致病菌,并且能使真菌毒素的分子鍵斷裂,形成低毒或是無毒的小分子物質,從而降解真菌毒素[12-13]。Wang Shiqing等[14]在300 W條件下進行10 min的低溫射頻等離子體處理,黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的降解率達到88.3%。烘焙咖啡中OTA經(jīng)冷等離子體在輸入功率為30 W、輸出電壓為850 V、氦氣流量為1.5 L/min的條件下處理30 min,咖啡中OTA的含量明顯降低了50%[15]。榛子中的AFB1經(jīng)以N2和O2的混合物為載體氣體的介質阻擋放電等離子體在1000 W處理12 min后,降解率達到了70%[16]。Iqdiam等[17]使用大氣冷等離子體處理10 min后,小麥籽粒中T-2毒素和HT-2毒素顯著下降,分別降低了79.80%和70.40%。常壓冷等離子體能夠有效降解大麥粒中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),且對大麥粒的蛋白質和β-葡聚糖無顯著影響[18]。綜上研究表明,等離子體在降解真菌毒素和提高工藝效率方面具有較高應用潛力。
然而,目前利用等離子體技術降解真菌毒素的機理還不完全,對其降解產(chǎn)物的種類、結構和毒性等問題還缺乏深入的認識。高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(high performance liquid chromatographyquadrupole-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry,HPLC-Q-Orbitrap-HRMS)具有分辨率高、定性定量能力好、檢測快速高效等特點,被廣泛應用于天然產(chǎn)物或降解產(chǎn)物中已知化合物和未知化合物的鑒定。高分辨質譜可以利用目標化合物母離子的精確質量數(shù)對其進行直接定量,可以提供精確分子質量和預測分子式,為鑒定未知化合物和代謝產(chǎn)物提供更多的信息[19]。
本研究采用低溫放電等離子體對葡萄干中OTA進行降解,并對不同初始質量濃度和放電電壓下葡萄干中OTA的降解效果進行評價。然后,在此基礎上采用HPLC-Q-Orbitrap-HRMS鑒定經(jīng)等離子體處理的OTA降解產(chǎn)物,參考相關文獻[20-23]推測其降解途徑,并對處理前后葡萄干品質進行測定,以期為低溫放電等離子體降解食品中OTA的實際研究提供參考。
無核白葡萄干(不含OTA),采購于新疆烏魯木齊市北園春干果市場,果實大小均一、無機械損傷。
OTA標準品(純度≥99.8%)美國Sigma-Aldrich公司;乙腈(色譜級)天津市致遠化學試劑有限公司;葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸銅、碳酸氫鈉、亞甲基藍、酒石酸鉀鈉、草酸、酚酞、鹽酸、乙酸鋅、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(以上均為分析純)天津市光復科技發(fā)展有限公司;2,6-二氯靛酚鈉鹽、鄰苯二甲酸氫鉀、抗壞血酸、吐溫-20 上海源葉生物科技有限公司;免疫親和柱 深圳逗點生物技術有限公司。
20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)配制:0.62 g NaH2PO4·2H2O+5.73 g Na2HPO4·12H2O+9 g NaCl,蒸餾水溶解并定容至1000 mL,調pH值至7.4。
DBD-50低溫等離子體空氣常壓實驗反應器 南京蘇曼等離子體科技有限公司;LC-20A高效液相色譜儀日本島津(中國)有限公司;7890B-5977系列氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司;Q-Exactive plus型四極桿-軌道阱-高分辨質譜系統(tǒng) 德國賽默飛世爾科技公司;3nh SC-10手持色差儀 廣東三恩時智能科技有限公司;FK-16A快速水分測定儀 廈門弗布斯檢測設備有限公司。
1.3.1 OTA標準溶液的配制
OTA標準品10 mg溶于色譜乙腈溶液中,定容至100 mL,配制成100 μg/mL的OTA標準原液,置于-20 ℃冰箱中冷藏備用。用乙腈對標準原液進行稀釋,得到10、30、50 μg/mL的OTA標準工作液,置于4 ℃冰箱。
1.3.2 染毒葡萄干的制備
稱取60 g無核白葡萄干3 份(未測出OTA)置于培養(yǎng)皿,分別采用10、30、50 μg/mL的OTA標準工作液對葡萄干進行浸泡染毒,保證OTA在葡萄干中均勻分布,于通風櫥風干備用。
1.3.3 低溫放電等離子體處理
以低溫放電等離子體處理葡萄干中OTA的降解效果為考察指標,固定其他因素,基于圖1的等離子體設備分別探討不同初始質量濃度和放電電壓對OTA降解效果的影響。將不同濃度的染毒葡萄干置于等離子體處理室,使用空氣作為載氣,放電電壓為75 kV、放電間距為0.9 cm的螺旋電極(高壓電極)與接地電極之間產(chǎn)生絲狀放電,從而產(chǎn)生大量臭氧、過氧化氫、羥自由基以及激發(fā)態(tài)粒子等活性物質降解OTA,每個處理重復進行3 次。
圖1 低溫放電等離子體裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of low-temperature discharge plasma generation device
1.3.4 不同低溫放電等離子體條件下葡萄干中OTA的降解實驗
1.3.4.1 不同初始質量濃度對葡萄干中OTA的降解實驗
固定放電間距0.9 cm,放電電壓25 kV,探究不同初始質量濃度(10、30、50 μg/mL)對葡萄干中OTA的降解效果。
1.3.4.2 不同放電電壓對葡萄干中OTA的降解實驗
固定葡萄干中OTA初始質量濃度50 μg/mL,放電間距0.9 cm,探究放電電壓(25、50、75 kV)對葡萄干中OTA的降解效果。
1.3.5 HPLC法測定OTA的降解率
1.3.5.1 試樣的制備
準確稱取5 g粉碎的葡萄干及1 g氯化鈉,加入80%甲醇溶液25 mL,用高速振蕩器振蕩混勻(10 min),離心5 min(4000 r/min)。取離心后的上層清液5 mL于燒杯中,再加入20 mmol/L PBS(20 mL)充分混勻,用玻璃纖維濾紙過濾,收集濾液備用。
1.3.5.2 試樣的凈化
免疫親和柱的上端連接10 mL注射器,取10 mL處理好的濾液以1~2 滴/s的流速通過柱子,棄掉流出的液體。然后加入10 mL 0.1% 吐溫-20 PBS淋洗,再次棄掉流出的液體,用注射器將免疫親和柱中的水分吹干,加入2 mL甲醇進行洗脫,流速約為2~3 滴/s,收集全部洗脫液于棕色樣品瓶中,用于HPLC檢測。
1.3.5.3 OTA HPLC標準曲線繪制
分別配制質量濃度為0、5、10、50、100、200 ng/mL的OTA標準工作溶液200 μL,采用HPLC分析,得到標準曲線回歸方程:y=772.519x-248.959(R2=0.9998,其中x表示OTA溶液的質量濃度,y表示OTA的峰面積),數(shù)據(jù)顯示線性擬合良好。
1.3.5.4 OTA HPLC條件
色譜柱:C18柱,柱長250 mm,內徑4.6 mm,粒徑5 μm;柱溫:40 ℃;流動相A:乙酸-水(1∶45,V/V),流動相B:乙腈;總流速:1.0 mL/min(45% A+55% B);等度洗脫15 min;進樣量:20 μL;激發(fā)波長:333 nm;發(fā)射波長:460 nm。
1.3.5.5 OTA降解率的計算
參照GB/T 5009.96—2016《食品中赭曲霉毒素A的測定》,分別按式(1)、(2)計算樣品中OTA含量和降解率:
式中:C為葡萄干中的OTA含量/(μg/kg);ρ為外標法測得的試樣中OTA質量濃度/(ng/mL);V為甲醇洗脫液的體積/mL;m為試樣質量/g;f為稀釋倍數(shù)。
式中:X為低溫放電等離子體處理OTA的降解率/%;C為等離子體處理后葡萄干中OTA的含量/(μg/kg);C0為等離子體處理前葡萄干中OTA的含量/(μg/kg)。
1.3.6 OTA降解產(chǎn)物分析條件
HPLC條件:Agilent XDB-C18色譜柱(1.8 μm,4.6 mm×50 mm);柱溫:30 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:5 μL;激發(fā)波長:365 nm;發(fā)射波長:436 nm;流動相:0.1%甲酸-水溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脫條件見表1。
表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions
MS條件:電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),電離電壓:-2.8 kV(正離子:3.2 kV);鞘氣壓力:40 arb;輔助氣壓力:10 arb;氣簾氣壓力:35 psi;離子源溫度:350 ℃;毛細管溫度:300 ℃;聚焦電壓:-350 V,去簇電壓:-10 V;整個過程采用氮氣;樣品分析采用數(shù)據(jù)依賴性采集模式:Q-Orbitrap采集范圍m/z100~1500,碎片離子掃描范圍m/z50~1500;碰撞氣:20%、40%、60%;MS分辨率:70000 FWHM(m/z200);MS2分辨率:17600 FWHM(m/z200)。
1.3.7 品質指標測定
對等離子體處理前后染毒葡萄干的可滴定酸(titratable acid,TA)[24]、還原糖[25]、總糖[25]、抗壞血酸[25]、褐變度[26]、水分含量[27]、色差[28]等品質指標進行測定,每個指標分別重復測定3 次。
1.3.8 色差的測定及計算方法
色差儀用白色校準板進行校正,測量等離子體處理前后葡萄干的L*、a*、b*值,讀數(shù)一式3 份。計算公式如下:
式中:ΔL*、Δa*和Δb*分別為通過等離子體處理前后葡萄干的亮度差、紅綠度差和黃藍度差;ΔE表示色差,表征顏色變化的幅度。
1.3.9 揮發(fā)性化合物的測定
1.3.9.1 揮發(fā)性化合物的富集
揮發(fā)性化合物的富集采用頂空固相微萃取的方式進行富集。取無核白葡萄干((25±1)g)用25 mL水浸泡過夜后勻漿,稱取樣品10 g,取2 g氯化鈉加入20 mL頂空瓶內,平衡30 min后,40 ℃萃取40 min。利用GC-MS聯(lián)用儀分析葡萄干揮發(fā)性化合物的組成成分,由GC-MS中NIST 14質譜數(shù)據(jù)庫匹配度和保留時間對香氣物質進行檢索,確定特征揮發(fā)性化合物的成分[29]。
1.3.9.2 GC-MS條件
電子電離源的電子能量為70 eV,進樣口溫度260 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃。輔助加熱250 ℃,掃描范圍35~550 u,不分流進樣,載氣He,流量1 mL/min,升溫程序:40 ℃保持5 min,3 ℃/min升至120 ℃保持5 min,10 ℃/min升至250 ℃,保持10 min。
所有實驗均重復進行3 次。使用Origin作圖和SPSS 26對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,OTA的Q-Exactive plus條件數(shù)據(jù)采集及分析采用Xcalibur 4.2軟件處理。
2.1.1 初始質量濃度對葡萄干中OTA降解效果的影響
圖2是葡萄干中不同OTA初始質量濃度(10、30、50 μg/mL)的降解效果。等離子體處理5 min,初始質量濃度為10、30、50 μg/mL葡萄干中OTA的降解率分別為96.26%、96.52%、90.79%,均達到了90%以上;各濃度處理組隨著時間的延長都得到較為明顯的降解效果,5~10 min時OTA的降解率增加緩慢,趨于100%。分析原因可能是隨著處理時間的延長,葡萄干中OTA與等離子體產(chǎn)生的活性物質反應有限。Chen Xinlu等[30]的研究發(fā)現(xiàn),隨著處理時間延長,小麥中的成分會與DON競爭活性物質,進而影響DON的降解率。
圖2 初始質量濃度對OTA降解效果的影響Fig.2 Effect of initial OTA concentration on OTA degradation
2.1.2 不同放電電壓對葡萄干中OTA降解效果的影響
如圖3所示,隨著放電電壓的增加,葡萄干中OTA的降解率也增加。等離子體處理3 min后,OTA呈現(xiàn)比較明顯的降解效果,降解率分別為81.52%(25 kV)、90.77%(50 kV)、93.88%(75 kV);隨著處理時間的延長,放電電壓為75 kV時對OTA的降解效果優(yōu)于50 kV時對OTA的降解效果,25 kV時降解效果最差;處理10 min后,放電電壓對OTA的降解沒有顯著變化,75 kV時處理的OTA被完全降解。分析原因可能是高電壓放電是獲得等離子體最普遍的途徑,放電電壓增大,產(chǎn)生較大的折合場強,從而導致活性粒子運動速度加快,能量密度變強,使得OTA降解率增加[31]。Shi Hu等[32]在利用低溫等離子體降解黃曲霉毒素的研究中,也證實了隨著電壓的升高,黃曲霉毒素的降解效果也隨之增強的規(guī)律。
圖3 放電電壓對OTA降解效果的影響Fig.3 Effect of discharge voltage on OTA degradation
2.2.1 OTA降解產(chǎn)物的形成
為避免葡萄干中雜質的影響,采用OTA標準品測定其降解產(chǎn)物。將OTA標準品經(jīng)等離子體處理后,采用HPLCQ-Orbitrap-HRMS鑒定經(jīng)等離子體處理的OTA降解產(chǎn)物。
由圖4可知,OTA經(jīng)過低溫放電等離子體處理后,除了A(OTA)物質外,還出現(xiàn)了兩個新的峰,分別標示為物質B、C。在0 min時,圖中只有A物質;A物質隨著處理時間的延長逐漸減少,處理10 min后A物質完全消失;B物質在處理3 min后開始出現(xiàn),其峰高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在處理10 min后也完全消失;而C物質一直呈穩(wěn)定增加趨勢,但在B物質之后才出現(xiàn),由此推測B物質可能是OTA降解過程中的一個中間產(chǎn)物。
圖4 OTA的降解產(chǎn)物一級質譜圖Fig.4 Primary mass spectra of degradation products of OTA
2.2.2 OTA降解產(chǎn)物的鑒定
利用Q-Orbitrap質譜和ESI 對等離子體處理后OTA的兩種降解產(chǎn)物的結構在負離子模式下進行分析,選取A(m/z404.0895)、B(m/z426.0715)、C(m/z158.1540)作為母核進行二級質譜分析。
圖5為OTA的結構式,目前相對于AFB1的研究,OTA的研究還處于初步狀態(tài)。目前的研究發(fā)現(xiàn)其具有肝毒性、腎毒性、致畸、致癌、免疫毒性、胚胎毒性[33-36],但對OTA結構中的主要毒性活性位點目前未查閱到相關文獻有明確表明。但有研究表明,OTA碳原子C-14和氮原子之間裂解時,會生成基本無毒的OTα和OTα酰胺[20]。當毒素分子結構被破壞,缺少苯丙氨酸部分時,其降解產(chǎn)物的細胞毒性較OTA均有大幅降低[37]。
圖5 OTA結構式[20]Fig.5 Structural formula of OTA[20]
OTA 與降解產(chǎn)物的二級質譜碎片信息見表2。根據(jù)A(m/z404.0895)、B(m/z426.0715)與C(m/z158.1540)的二級質譜信息,可推斷出物質A、B、C可能的裂解途徑。圖6a~c分別為OTA(A)及其兩種降解產(chǎn)物的二級質譜圖(上方)及每種物質對應結構的碎片信息。
表2 OTA與降解產(chǎn)物的二級質譜碎片信息Table 2 Information about MS/MS fragments of OTA and its degradation products
圖6 OTA及其降解產(chǎn)物的二級質譜及對應的結構碎片F(xiàn)ig.6 MS/MS spectra and possible fragments of OTA and its degradation products
2.2.3 OTA降解途徑
在低溫放電等離子體處理過程中,會產(chǎn)生大量的臭氧、過氧化氫、羥自由基和激發(fā)態(tài)粒子等活性物質,這些物質具有極高的活性,能夠有效地降解溶液中的化合物。其中羥自由基具有很強的氧化性,能與多種自由基、不飽和鍵、苯環(huán)等發(fā)生加成反應;氫離子可以與未成對的H、未成對的電子、芳香族化合物以及不飽和化合物發(fā)生加成反應[38]。
正如之前的研究所報道,OTA可通過對OTA酰胺基的水解作用,釋放出OTα和L-苯丙氨酸,這種反應極有可能是由羧肽酶或者類似的酶介導的[39]。OTα是OTA的多種降解產(chǎn)物中毒性最小的一種[20,40]。
根據(jù)降解產(chǎn)物分子質量和二級質譜鑒定結果,推斷出低溫放電等離子體降解OTA的可能降解途徑,見圖7。圖中紅色虛線部分為斷裂結構,A物質的a處因水解開環(huán)形成羥基和羧基,而羧基被進一步還原成羥基(B物質中藍色圈出部分);b處的羰基因質子化被水解形成了2 個羥基。OTA經(jīng)過水解、羥基化、內酯打開等途徑可以產(chǎn)生更多的羥基代謝物,其中4-羥基-赭曲霉毒素A和10-羥基-赭曲霉毒素A被證明是毒性較小的羥基代謝物[41]。B物質的NH—CO(圖7B物質,c處)發(fā)生斷裂進而得到C物質,而C的結構與彭春紅[38]的電子束輻照降解產(chǎn)物相同,是毒性遠低于OTA的L-苯丙氨酸,等離子體將OTA降解成OTα的過程還需要進一步的探索。
圖7 OTA的可能降解途徑Fig.7 Possible degradation pathway of OTA
由表3可知,葡萄干經(jīng)過低溫放電等離子體處理3、5 min后,葡萄干的TA、還原糖、總糖、抗壞血酸(VC)、褐變度、水分質量分數(shù)無顯著差異(P>0.05)。在Feizollahi等[18]的研究中,常壓冷等離子體有效降低了大麥中的DON,但大麥粒的發(fā)芽質量、蛋白質含量、水分含量和β-葡聚糖均無明顯變化。Paix?o等[42]也觀察到了類似的結果,他們的研究結果稱等離子體處理過的Siriguela果汁中VC和色素沒有明顯變化,但總酚類化合物、抗氧化活性和B族維生素有所增加。綜上,等離子體對食品中的真菌毒素有良好的降解效果,但考慮到食品基質的復雜性,等離子體處理對食品本身的影響會有略微不同。
表3 不同時間低溫放電等離子體處理對葡萄干品質指標的影響Table 3 Effects of low-temperature discharge plasma treatment time on quality indexes of raisins
L*值、a*值、b*值和ΔE值幾個指標是決定葡萄干外觀的直接指標。從表4可以看出,經(jīng)低溫放電等離子體處理后,葡萄干的L*值、a*值、b*值沒有顯著差異(P>0.05),總色差ΔE顯著下降(P<0.05),可能是因為葡萄干的基質成分與等離子體的活性物質發(fā)生反應。
表4 不同時間低溫放電等離子體處理對葡萄干色澤的影響Table 4 Effects of low-temperature discharge plasma treatment time on the color of raisins
低溫放電等離子體在不同時間處理葡萄干中的揮發(fā)性化合物共檢測出31 種,主要由酸類、醛類、醇類、酮類和其他物質組成。其中甲酸、乙酸、己酸、3-甲基丁酸、己醛、3-甲基丁醛、(Z)-2-庚醛、3-甲基-2-丁醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇等物質為葡萄干的主要風味物質。
由表5可知,低溫放電等離子體處理3、5 min后,葡萄干除酸類物質中3-甲基丁酸、乙酸、辛酸含量有明顯的下降,甲酸、戊酸、2-乙基己酸含量有明顯上升外,大部分的酸、醛、醇和酮類物質的相對含量未出現(xiàn)明顯變化,可能是因為葡萄干經(jīng)過不同時間低溫放電等離子體處理過程中酸類物質發(fā)生相互轉換。綜上所述,采用低溫放電等離子體處理葡萄干后,其揮發(fā)性物質的變化并不明顯。
表5 低溫放電等離子體處理對葡萄干揮發(fā)性化合物的影響Table 5 Effect of low-temperature discharge plasma treatment time on volatile compounds in raisins
本研究采用低溫放電等離子體對葡萄干中OTA進行降解,研究不同初始質量濃度、放電電壓對葡萄干中OTA降解率的影響。結果表明,低溫放電等離子體降解葡萄干中OTA效果顯著,葡萄干中OTA初始質量濃度為50 μg/mL,經(jīng)等離子體在放電電壓75 kV時處理10 min基本能被完全降解。低溫放電等離子體處理對葡萄干的品質指標未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05);色澤指標L*值、a*值、b*值未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05);揮發(fā)性化合物僅有少部分出現(xiàn)微量變化。Mohammadi等[43]的研究表明等離子體因穿透深度低、對食物和植物基質的損害較小,從而可在有效降解植物或者食物表面真菌毒素的同時保留食品內部的營養(yǎng)成分。
利用HPLC-Q-Orbitrap-HRMS檢測并鑒定經(jīng)低溫放電等離子體處理的OTA降解產(chǎn)物,結合質譜圖的碎片信息,對B(m/z426.0715)和C(m/z158.1540)2 種主要降解產(chǎn)物的結構進行分析,并對等離子體降解OTA的可能途徑進行推測。本實驗最終產(chǎn)物與彭春紅[38]、鄒東[44]實驗的最終產(chǎn)物相似,但未出現(xiàn)較多的中間產(chǎn)物,可能是由于中間產(chǎn)物不穩(wěn)定的性質以及低溫放電等離子體高效率的性質,從而使得本實驗中未出現(xiàn)過多中間產(chǎn)物。上述研究結果表明,低溫放電等離子體是一種高效降解OTA的非熱加工技術,可為OTA污染的食品降解研究提供理論依據(jù),但降解產(chǎn)物的安全性還需要動物實驗和細胞實驗進一步驗證。