郭 宇，姜城紅，楊玉嬋，張 瑤，王東旭，郭元新

（江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇省糧食生物加工工程研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212100）

小麥胚芽不僅含有蛋白、脂肪、礦物質(zhì)以及維生素等營養(yǎng)元素，還含有黃酮類、谷胱甘肽等生物活性物質(zhì)，被譽(yù)為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”。小麥胚芽蛋白（wheat germ protein，WGP）為完全蛋白，氨基酸構(gòu)成比例接近聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）推薦的模式值，且氨基酸總量高于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，是一種優(yōu)質(zhì)的、可持續(xù)的植物蛋白來源[1-3]。但由于WGP主要以球蛋白和白蛋白為主，結(jié)構(gòu)致密，缺乏靈活性，其溶解性、乳化性、發(fā)泡性、持水性、持油性等很多功能特性不能滿足生產(chǎn)、加工和貯藏的需求，嚴(yán)重限制了其在食品中的應(yīng)用。因此，研究WGP的功能特性并擴(kuò)寬其應(yīng)用范圍具有極為重要的意義。

為改善蛋白質(zhì)的加工特性，研究人員通常利用物理、化學(xué)、酶法對(duì)其進(jìn)行加工和修飾以提高蛋白質(zhì)的表面活性[4-5]。微波改性具有加熱均勻、效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。微波處理能夠改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的反應(yīng)基團(tuán)暴露，改變分子間作用力，從而引起結(jié)構(gòu)和功能特性的改變。Sun Xiaohong等[5]的研究表明，木豆蛋白經(jīng)過微波處理后粒徑減小，二級(jí)結(jié)構(gòu)的靈活性提高，體外消化率提高了1.32 倍。王思蒙[6]研究發(fā)現(xiàn)微波處理對(duì)萌發(fā)后苦蕎蛋白的溶解性、持水力、乳化性和乳化穩(wěn)定性等功能特性產(chǎn)生了積極的影響。目前將微波用于小麥胚芽的研究主要集中在改善小麥胚芽的品質(zhì)穩(wěn)定性及提高WGP提取率等方面，而關(guān)于微波對(duì)小麥胚芽功能特性的影響的研究甚少。李永恒等[7]采用微波輔助堿法提取WGP，提取率高達(dá)90%，且所提取的WGP有較好的溶解性、持水性、乳化活性，并表明蛋白質(zhì)的乳化性和起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）與溶解性有直接關(guān)系，隨著溶解度的增大，蛋白質(zhì)更容易向水-油界面擴(kuò)散，其乳化性和FC改善。因此，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砜梢蕴岣咧参锏鞍撞糠止δ芴匦?。俞凌等[8]在微波功率600 W條件下將WGP處理2 min后，其提取率大幅降低，溶解性、持水性、持油性均顯著降低，蛋白的穩(wěn)定性被破壞。因此，大功率和長時(shí)間的微波處理對(duì)WGP的營養(yǎng)價(jià)值及功能特性會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。

金屬離子不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)-溶劑間的疏水相互作用，還會(huì)影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的疏水交互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的變化。有研究表明，不同鹽種類及濃度對(duì)蛋白的功能特性影響存在明顯差異，在一定濃度范圍內(nèi)，增加金屬離子濃度能提高蛋白質(zhì)的溶解度、乳化性和乳化穩(wěn)定性，但濃度繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和沉淀，蛋白質(zhì)的溶解度降低，F(xiàn)C和泡沫穩(wěn)定性增加[9]。郭元新[10]和余南靜[11]等研究發(fā)現(xiàn)，在孵育小麥胚芽時(shí)添加適量濃度的Zn2+、Mn2+和Ca2+等金屬離子可以激活小麥胚芽內(nèi)源蛋白酶，提高多肽含量，這可能會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。Liu Fengru等[12]在酸性條件下通過添加CaCl2能使小麥胚芽中球蛋白表面靜電排斥力增大，蛋白簇分散，蛋白質(zhì)溶解性提高，從而提高小麥胚芽中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。Go??biowski等[13]在研究Zn2+與蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)Zn2+改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。將微波與金屬離子聯(lián)合是否可以使蛋白質(zhì)的功能特性達(dá)到更好效果的研究鮮見報(bào)道，且具有一定的研究價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以未經(jīng)脫脂的離體小麥胚芽為原料，采用堿溶酸沉法提取WGP，利用微波、金屬離子（ZnSO4、MnSO4和C a C l2）和微波聯(lián)合金屬離子3 種方式對(duì)其進(jìn)行改性，測(cè)定改性前后W G P 的溶解性、持水力、持油力、乳化性和乳化穩(wěn)定性、FC和氣泡穩(wěn)定性等功能特性，采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析改性前后WGP多級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，以期為WGP功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽由丹陽市蓮湖面粉有限公司提供，小麥胚芽離體后立即放入-18 ℃貯藏；大豆油 金龍魚集團(tuán)有限公司。

檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸鋅、硫酸錳、無水氯化鈣、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、甘氨酸、SDS、磷酸氫二鉀、冰醋酸、溴化鉀等（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris（分子生物學(xué)級(jí)）、考馬斯亮藍(lán)G250、磷酸（分析純）生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白Marker（非變性非還原型）、40%Acr/bis（29∶1）、4×Tris/SDS分離膠緩沖液、4×Tris/SDS濃縮膠緩沖液、過硫酸銨、四甲基乙二胺、5×蛋白上樣緩沖液 北京蘭杰柯科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250（≥90%）阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛血清白蛋白（98%）福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ZW-bp120變頻實(shí)驗(yàn)微波爐 蕪湖眾維教研儀器研發(fā)有限公司；LGJ-12D冷凍干燥機(jī) 四環(huán)科儀（天津）科技有限公司；PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JY300C電泳儀、JY-SCZ2+電泳槽 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Tanon 2500B凝膠圖像分析系統(tǒng) 南京麥高德生物科技有限公司；Phenom ProX臺(tái)式SEM 復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；YP-2壓片機(jī) 天津諾雷信達(dá)科技有限公司；NICOLET 380 FTIR儀 美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

參考課題組前期研究成果[10]，將實(shí)驗(yàn)設(shè)為4 組，得到不同條件下孵育后的小麥胚芽粉乳液。1）對(duì)照組：將小麥胚芽粉按照料液比1∶10（g/mL）溶于0.1 mol/L pH 3.0檸檬酸緩沖液中，置于49 ℃水浴鍋中孵育6 h；2）微波組：參照對(duì)照組加入緩沖液，在微波功率400 W條件下處理10 s后置于49 ℃水浴鍋中孵育6 h；3）金屬離子組：在上述緩沖液中加入濃度為1.0 mmol/L的ZnSO4、濃度為1.6 mmol/L的MnSO4及濃度為1.4 mmol/L的CaCl2，參照對(duì)照組進(jìn)行孵育；4）微波聯(lián)合金屬離子組：參照3）在緩沖液中加入金屬離子，參照2）進(jìn)行微波處理后進(jìn)行孵育。

1.3.2 WGP的提取

參考曾祺等[14]的方法，將孵育后的小麥胚芽粉乳液勻漿，4 ℃、4000 r/min離心20 min，將沉淀按料液比1∶16（g/mL）溶于蒸餾水中，并調(diào)節(jié)pH值至10.0，在60 ℃提取1 h，離心，取上清液，調(diào)pH值至4.0，在60 ℃水浴2 h后在4 ℃離心20 min，水洗沉淀多次，直至pH值呈中性，真空冷凍36 h后得到凍干WGP。

1.3.3 溶解性的測(cè)定

參考Meng Yueyue等[15]的方法并加以改進(jìn)。將WGP與0.2 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液混合，配制成1 mg/mL WGP溶液，以8000 r/min離心10 min。取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定可溶性WGP的質(zhì)量濃度（以0～0.1 mg/mL的牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y＝0.3547x，R2＝0.9987），0.1 mL PBS作為空白對(duì)照。按照式（1）計(jì)算溶解性：

式中：ρsp為上清液蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρtp為樣液總蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 持水性和持油性的測(cè)定

參考Chavan等[17]的方法，取0.1 g樣品于離心管，稱質(zhì)量記為m1，加入10 mL水/大豆油混勻，于室溫靜置30 min后，4 ℃、4000 r/min離心20 min，棄去上清液，稱質(zhì)量記為m2。按照式（2）計(jì)算持水性和持油性：

式中：m0為樣品質(zhì)量/g；m1為樣品與離心管的質(zhì)量之和/g；m2為沉淀物與離心管的質(zhì)量之和/g。

1.3.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Malik等[18]的方法，將WGP溶于水，配制為0.1 g/100 mL的WGP溶液，pH值調(diào)至7.0，按照體積比3∶1與大豆油混合并均質(zhì)1 min，轉(zhuǎn)速為1000 r/min。取0.2 mL底部乳液以1∶50的比例與0.1%的SDS溶液混勻，靜置10 min，500 nm處測(cè)定吸光度A1，設(shè)SDS溶液為對(duì)照。按照式（3）和（4）計(jì)算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）：

式中：A0為對(duì)照組吸光度；N為稀釋倍數(shù)；ρ為樣液蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；V為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)/%；A1為靜置10 min后樣液吸光度。

1.3.6 FC和起泡穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）的測(cè)定參考Yu Mei等[19]的方法。將WGP按照料液比1∶100溶于水后混勻，調(diào)節(jié)pH值至中性，記體積為V0，以轉(zhuǎn)速1000 r/min均質(zhì)2 min，測(cè)量記為V1，30 min后再次讀數(shù)，記為V2。按照式（5）和（6）計(jì)算FC和FS：

式中：V0為樣液體積/mL；V1為均質(zhì)2 min后的體積/mL；V2為靜置30 min后的體積/mL。

1.3.7 WGP的結(jié)構(gòu)研究

1.3.7.1 SDS-PAGE分析

根據(jù)Gao Chaofan[20]和Zhou Xuan[21]等的方法。配制5%的蛋白質(zhì)溶液，4000 r/min離心1 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。樣品與上樣緩沖液以1∶4的比例混勻，煮沸5 min。采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備12%的分離膠和4%的濃縮膠，將Tris、Gly和SDS混合制成電極緩沖液。樣品上樣量為10 μL，調(diào)節(jié)樣品濃縮膠階段電壓為80 V，保持該電壓電泳20 min，分離膠階段調(diào)至電壓為120 V，至染料到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染色2 h后，于乙醇-冰醋酸脫色液中脫色至條帶清晰，用Tanon 2500 B型凝膠成像儀拍攝成像。

1.3.7.2 SEM觀察

在樣品臺(tái)上粘少量導(dǎo)電膠，用棉簽取微量干燥樣品，涂于導(dǎo)電膠上，對(duì)樣品進(jìn)行真空噴金鍍膜處理后用SEM放大2000 倍觀察。

1.3.7.3 FTIR分析

將樣品與溴化鉀按照質(zhì)量比1∶100混勻，研磨后壓成薄片。在FTIR儀中進(jìn)行全波段掃描（400～4000 cm-1），掃描32 次，分辨率為4 cm-1。使用PeakFit 4.12軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP功能特性的影響

2.1.1 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP溶解性的影響

蛋白質(zhì)的溶解度是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或溶劑相互作用達(dá)到平衡的熱力學(xué)表現(xiàn)形式，影響蛋白質(zhì)增稠、起泡、乳化和凝膠等功能性質(zhì)，可評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)潛在應(yīng)用價(jià)值[22]。圖1表明，對(duì)照組的溶解性為22.46%，微波、金屬離子及其聯(lián)合處理均顯著提高了WGP的溶解性（P＜0.05），提高了46.86%～86.61%。短時(shí)的微波加熱也可顯著提高蛋白的溶解性，這與趙愛迪[23]對(duì)牛乳清蛋白的研究結(jié)果一致。帶電荷的蛋白質(zhì)同金屬離子相互作用使帶相反電荷的相鄰蛋白質(zhì)分子之間的靜電作用降低，且二價(jià)金屬離子能在相鄰多肽的特殊氨基酸殘基之間形成交聯(lián)，從而使蛋白溶解度增加。微波處理和金屬離子處理對(duì)WGP的溶解性提高具有協(xié)同作用，微波及金屬離子處理可以進(jìn)一步增強(qiáng)孵育過程中WGP內(nèi)源蛋白酶活力，顯著提高可溶性肽的含量，使分子表面電荷增加，與水分子相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致溶解度上升；微波與金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的減少導(dǎo)致表面疏水性基團(tuán)減少，使分子的親水性提高。Tan Li等[24]在研究羅非魚-大豆蛋白共沉淀物水溶性與二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，羅非魚-大豆蛋白因含有較低的α-螺旋和較高的β-折疊結(jié)構(gòu)，具有更高的水溶性。

圖1 不同處理方式對(duì)WGP溶解性的影響Fig.1 Effect of different treatments on the solubility of WGP

2.1.2 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP持水性和持油性的影響

蛋白質(zhì)的持水性和持油性是食品加工過程中重要的功能特性和質(zhì)量控制指標(biāo)，它與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，受離子強(qiáng)度、疏水基團(tuán)、溶解性等多種因素單獨(dú)或共同作用影響而波動(dòng)[25]。良好的持水性有利于提高焙烤面團(tuán)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而良好的吸油性有利于肉制品、奶制品等的加工生產(chǎn)。如圖2所示，微波聯(lián)合金屬離子可顯著提高WGP的持水性、持油性（P＜0.05）。微波處理后持水性提高22.68%，持油性提高26.09%，這是因?yàn)槲⒉ㄌ幚砜梢源龠M(jìn)WGP分子表面結(jié)構(gòu)展開，松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提高了蛋白質(zhì)與水、油的結(jié)合能力，且多肽側(cè)鏈極性基團(tuán)上的水、油結(jié)合位點(diǎn)暴露，導(dǎo)致持水力與持油力提高[26]。經(jīng)過金屬離子處理后，持水性變化不顯著，而持油性由2.12%提高至2.62%，變化顯著（P＜0.05），可能是因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)與金屬離子形成絡(luò)合物，構(gòu)成一種疏松多孔的結(jié)構(gòu)，易于容納溶劑，顯著提高了WGP的持油性。在微波和金屬離子協(xié)同作用下持水力和持油力分別比對(duì)照組提高了22.86%、82.16%，蛋白質(zhì)的二硫鍵斷裂變?yōu)閹€基，蛋白大分子被降解，分子質(zhì)量變小，且內(nèi)部吸附基團(tuán)暴露，有利于水分和油分的進(jìn)入。微波聯(lián)合金屬離子能夠更有效地改善WGP的持水、持油能力。

圖2 不同處理方式對(duì)WGP持水性、持油性的影響Fig.2 Effect of different treatments on the water and oil retention capacity of WGP

2.1.3 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

EAI是指所測(cè)蛋白質(zhì)能夠參與溶液而形成乳濁液的一種能力，而ESI代表蛋白質(zhì)參與形成乳濁液之后，在一定時(shí)間內(nèi)保持住乳濁液狀態(tài)，既不出現(xiàn)絮凝、分層等現(xiàn)象，又能夠有效地降低已形成的現(xiàn)濁液體系界面張力的能力[27-29]。由圖3可見，微波處理后，WGP的EAI顯著增加，而ESI顯著降低。Jiang Zanmei等[30]在研究微波處理對(duì)漆酶交聯(lián)α-乳白蛋白的結(jié)構(gòu)及乳化性能的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)微波可以改善α-乳白蛋白和漆酶的交聯(lián)度，從而提高EAI，也印證了微波處理可以提高蛋白的乳化性。而ESI降低可能是因?yàn)槲⒉ù偈沟鞍琢呀獬啥屉?，削弱了蛋白在油水界面上的相互作用的?qiáng)烈程度，阻礙穩(wěn)定薄膜的形成。金屬離子處理后WGP的EAI比對(duì)照組提高了161.58%，而ESI變化不顯著，這表明金屬離子可用于改善蛋白質(zhì)的乳化性能。微波聯(lián)合金屬離子處理后EAI、ESI分別比對(duì)照組提高了120.90%、15.64%，聯(lián)合作用可以顯著提高WGP的EAI，但比單獨(dú)使用金屬離子處理效果差。經(jīng)過微波和金屬離子聯(lián)合處理后WGP的分子質(zhì)量降低，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展，溶解性增加，蛋白質(zhì)分子更易向氣-水或水-油界面擴(kuò)散，分子具備更強(qiáng)的柔韌性，有助于提高WGP的乳化能力[31]。微波聯(lián)合金屬離子處理后仍具有維持穩(wěn)定的能力，是因?yàn)槿闋钜褐械牟蝗苄詧F(tuán)聚體轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘膱F(tuán)聚體，形成剛性薄膜，隔斷了油相和水相，使油水界面清晰分明，阻止了油滴聚集，進(jìn)而維持溶液整體的ESI[32]。

圖3 不同處理方式對(duì)WGP EAI、ESI的影響Fig.3 Effect of different treatments on the emulsifying activity index and emulsion stability index of WGP

2.1.4 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP FC和FS的影響

FC是指蛋白質(zhì)在氣-液界面形成堅(jiān)韌的薄膜使大量氣泡并入并穩(wěn)定的能力[33]。有良好FC的蛋白質(zhì)能夠快速地?cái)U(kuò)散到氣-水界面，在界面上發(fā)生吸附、定向、伸展，并通過分子間相互作用形成黏彈性的界面膜。功能空間構(gòu)象、表面電荷密度的變化能夠改變蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，影響其起泡功能[34]。圖4表明，微波處理使WGP的FC提高了80.76%，金屬離子對(duì)FC無顯著影響，聯(lián)合處理對(duì)FC的影響為協(xié)同作用，使WGP的FC比對(duì)照組提高了116.91%，效果極顯著，這得益于蛋白溶解性的增加，使得蛋白更易于向油-水或氣-水界面擴(kuò)散，蛋白結(jié)構(gòu)展開，表面張力降低，從而有利于起泡。經(jīng)過微波和金屬離子處理的WGP維持泡沫穩(wěn)定的能力較差，微波、金屬離子的聯(lián)合作用使蛋白大分子裂解成大量短肽，使得溶液黏度和液體表面張力降低，不利于形成穩(wěn)定的泡沫薄膜[35]。

圖4 不同處理方式對(duì)WGP FC、FS的影響Fig.4 Effect of different treatments on the foaming capacity and foam of WGP

2.2 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP組分亞基的影響

圖5為對(duì)照組和微波聯(lián)合金屬離子處理后的WGP在非還原條件下的電泳圖，對(duì)照組的WGP的分子質(zhì)量在130 kDa以下分布，主要有5 條譜帶，分別為115、90、35、34、30 kDa，在17～21 kDa觀察到了低質(zhì)量的聚合物，說明其主要由小分子蛋白質(zhì)組成。經(jīng)過3 種方法處理的WGP分子質(zhì)量分布并未有明顯差異，微波聯(lián)合金屬離子處理的WGP 25 kDa以上的條帶相較于對(duì)照組顏色較淺，說明微波聯(lián)合金屬離子降低了大分子蛋白的含量，這可能是因?yàn)槲⒉?lián)合金屬離子使蛋白內(nèi)部離子鍵斷裂，發(fā)生了折疊，影響了WGP的功能特性。經(jīng)過金屬離子處理的WGP電泳條帶清晰，且存在拖尾現(xiàn)象，可能是因?yàn)榧尤氲慕饘匐x子使WGP溶解性增大，各亞基之間發(fā)生了交聯(lián)。

圖5 不同處理方式下WGP的非還原電泳圖像Fig.5 Non-reducing electrophoresis images of WGP under different treatments

2.2.2 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP微觀結(jié)構(gòu)的影響

微觀結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)蛋白應(yīng)用潛力的重要因素。如圖6所示，經(jīng)過微波和金屬離子處理的WGP在外觀和形態(tài)上發(fā)生了較大變化。對(duì)照組的WGP大多呈現(xiàn)塊狀及片狀，緊密堆疊在一起，局部有細(xì)微的孔眼，且塊狀顆粒形狀不規(guī)則，表面凹凸不平整，疏水基團(tuán)更容易暴露在表面。經(jīng)過微波改性后，WGP顆粒變得松散，體積變小，整體更加疏松，這可能是微波處理可使深埋在蛋白分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來，分子柔韌性增強(qiáng)，蛋白分子在界面上的展開與形態(tài)改變更容易。這也是微波可提高WGP乳化活性的微觀原因。經(jīng)金屬離子改性后的WGP呈現(xiàn)聚集而成的團(tuán)塊狀且形狀不規(guī)則，這可能是由于金屬離子和多肽形成了絡(luò)合物，加劇了蛋白間的相互作用。經(jīng)微波聯(lián)合金屬離子改性后的WGP，部分蛋白顆粒聚集成小團(tuán)，部分顆粒松散且形狀較小，可能是由于大塊的蛋白-金屬離子絡(luò)合物受微波作用而分解。所以微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP的微觀結(jié)構(gòu)有明顯影響。

圖6 不同處理方式對(duì)WGP微觀結(jié)構(gòu)分布的影響Fig.6 Effect of different treatments on the microstructure of WGP

2.2.3 微波聯(lián)合金屬離子對(duì)WGP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

FTIR是測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的重要手段之一。由圖7可見，微波及金屬離子處理并沒有導(dǎo)致新的特征吸收峰出現(xiàn)，在酰胺III帶（1200～1300 cm-1）、酰 胺I I 帶（1500～1600 c m-1）、酰 胺I 帶（1600～1700 cm-1）處都出現(xiàn)了典型的酰胺帶振動(dòng)。酰胺I帶（1600～1700 cm-1）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化最為敏感，故作進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)Gao Chaofan[20]和Dong Xin[36]的等研究，將酰胺I帶劃分為β-折疊（1613～1637、1682～1696 cm-1）、無規(guī)卷曲（1637～1645 cm-1）、α-螺旋（1645～1662 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1662～1682、1630 cm-1）。α-螺旋通常由氨基氫（NH—）和羰基氧（—CO）基團(tuán)之間的分子內(nèi)氫鍵形成，代表蛋白質(zhì)分子的有序性。β-折疊由多肽鏈之間的鏈間氫鍵決定的，相對(duì)穩(wěn)定。β-轉(zhuǎn)角是由微弱的氫鍵結(jié)構(gòu)形成的，具有較大的自由度。而無規(guī)卷曲是由未折疊的構(gòu)型形成的，與蛋白質(zhì)的靈活性有關(guān)。β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)均反映蛋白質(zhì)分子松散程度[37]。

圖7 不同處理方式下WGP的FTIR圖Fig.7 FTIR spectra of WGP under different treatments

使用PeakFit 4.12軟件進(jìn)行反卷積和曲線擬合，通過擬合子峰各波段的峰面積量化WGP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如表1所示。未經(jīng)處理的WGP的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β-折疊（34.64%）、無規(guī)卷曲（8.07%）、β-轉(zhuǎn)角（15.58%）和α-螺旋（41.7%）組成。其中α-螺旋和β-折疊占比很大，形成了WGP緊密的無空腔結(jié)構(gòu)及較好的構(gòu)象穩(wěn)定性和緊密程度，而α-螺旋具有廣泛的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，形成了疏水性強(qiáng)的特點(diǎn)，致使WGP溶解性較差。通過微波及金屬離子處理后，WGP中α-螺旋、β-折疊含量顯著降低（P＜0.05），無規(guī)卷曲及β-轉(zhuǎn)角顯著增加（P＜0.05），增加了WGP的靈活性。在微波的作用下，WGP發(fā)生解螺旋現(xiàn)象，α-螺旋的相對(duì)含量由41.70%降至32.32%，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲分別提高至24.26%、16.86%，蛋白質(zhì)的無序性增加，結(jié)構(gòu)更加疏松，這可能是由于微波的非熱效應(yīng)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加舒展所致。Sun Xiaohong等[5]的研究表明，微波處理后，木豆蛋白粒徑相對(duì)減小，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊減少了5%，無規(guī)卷曲增加了5%，形成了更多的未折疊結(jié)構(gòu)和更高的結(jié)構(gòu)靈活性，有助于蛋白質(zhì)-蛋白酶相互作用，從而提高了體外消化率。金屬離子處理過的WGP無規(guī)卷曲比對(duì)照組提高了115.49%，是3 種改性方式中最高的，這可能是因?yàn)榻饘匐x子通過對(duì)分子間靜電作用的屏蔽和對(duì)溶劑氫鍵的影響，改變了蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，也可能是金屬離子與蛋白質(zhì)表面的巰基、胺基、羥基等基團(tuán)形成絡(luò)合物，無序性增強(qiáng)。劉西海[38]在探討各種金屬離子對(duì)腌制鴨蛋蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，金屬離子腌蛋后大大增加了蛋清蛋白質(zhì)β-折疊的含量，使得分子展開，蛋清蛋白加熱后α-螺旋減少，進(jìn)一步增加了分子的無序性，同時(shí)加熱使肽鏈伸展，疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)表面疏水性增加，與本研究結(jié)果類似?？傊⒉?lián)合金屬離子可以改變WGP的構(gòu)象，且聯(lián)合改性與單獨(dú)改性趨勢(shì)一致。

表1 不同處理?xiàng)l件下WGP二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化Table 1 Changes in secondary structure contents of WGP under different treatment conditions

3 結(jié)論

微波聯(lián)合金屬離子通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象有效地提高了WGP的功能特性。聯(lián)合處理用于改善WGP的功能特性效果優(yōu)于微波和金屬離子單獨(dú)處理。聯(lián)合處理過的WGP溶解性、持水性、持油性、EAI、ESI、FC分別提高了86.61%、22.86%、82.16%、120.90%、15.64%、116.91%，微波及金屬離子處理后的WGP分子質(zhì)量并未有明顯變化，結(jié)構(gòu)更疏松，二級(jí)結(jié)構(gòu)向著無序化方向進(jìn)行，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占比由15.58%提高至24.63%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占比由8.07%提高至14.05%，提高了蛋白結(jié)構(gòu)的靈活性。因此，微波聯(lián)合金屬離子是一種可以有效實(shí)現(xiàn)小麥胚芽資源高值化利用的處理方法。改性可以進(jìn)一步擴(kuò)大WGP的應(yīng)用范圍，如功能性蛋白飲料、復(fù)合營養(yǎng)粉、烘焙食品等，應(yīng)用前景廣闊。此外，微波聯(lián)合金屬離子技術(shù)對(duì)不同蛋白的功能特性研究較少，相關(guān)機(jī)制尚不完善，以及微波聯(lián)合金屬離子改性后的蛋白用于開發(fā)產(chǎn)品時(shí)營養(yǎng)及品質(zhì)變化有待進(jìn)一步研究。