崔子璇，高 旭，常 姍，楊曉露，惠 偉

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

虎皮病是梨在貯藏中后期極易發(fā)生的一種生理性病害，一般在冷庫(kù)中發(fā)病不明顯，出庫(kù)后迅速發(fā)病，表現(xiàn)為果皮出現(xiàn)不規(guī)則形的褐色或黑色病斑，但不傷及果肉，一旦發(fā)病則無(wú)法補(bǔ)救，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前梨虎皮病的發(fā)病機(jī)理還沒(méi)有完全闡明，普遍認(rèn)為其虎皮病發(fā)生與α-法尼烯代謝以及活性氧積累密切相關(guān)[1-3]。但是，也有研究表明，α-法尼烯及其氧化產(chǎn)物共軛三烯的含量與虎皮病并不直接相關(guān)[4-6]，某些梨品種發(fā)生的虎皮病可能不是由α-法尼烯被氧化引起的[7]。因此，很多研究將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向于其下游的氧化產(chǎn)物6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-methyl-5-hepten-2-one，MHO）[8-9]。共軛三烯的氧化產(chǎn)物MHO比α-法尼烯和共軛三烯的毒性更強(qiáng)，被認(rèn)為和虎皮病的發(fā)生密切相關(guān)，并且用MHO熏蒸處理梨和蘋(píng)果后出現(xiàn)了虎皮病的癥狀[10-11]，但是也有相反結(jié)果的報(bào)道[12]。有研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)內(nèi)的H2O2含量高、抗氧化酶活性低導(dǎo)致的抗氧化失衡是虎皮病的誘因[13]。已有的研究認(rèn)為，在虎皮病果果皮內(nèi)，活性氧清除系統(tǒng)的過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，致使活性氧大量積累，使表皮細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而誘發(fā)虎皮病[14]。果實(shí)中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）將酚類物質(zhì)氧化生成醌類物質(zhì)而誘發(fā)褐變，這個(gè)過(guò)程與虎皮病密切相關(guān)[15]。目前，MHO與梨虎皮病發(fā)生和活性氧代謝的關(guān)系并不清楚。碭山酥梨是中國(guó)栽培面積和產(chǎn)量最大的品種，易感虎皮病，本實(shí)驗(yàn)以碭山酥梨為材料，研究了MHO處理對(duì)果皮內(nèi)源MHO含量、抗氧化酶活性、活性氧含量以及虎皮病發(fā)生的影響，以期為虎皮病發(fā)病機(jī)制的研究提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碭山酥梨采自陜西省蒲城縣商業(yè)果園，選取成熟度一致、規(guī)格相近、無(wú)損傷和病蟲(chóng)害的果實(shí)。果實(shí)采收當(dāng)天運(yùn)回陜西華圣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司，貯于（0±0.5）℃冷庫(kù)（相對(duì)濕度90%～95%）。

MHO標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；H2O2測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

100 μm厚的PDMS固相微萃取頭 美國(guó)Supelco公司；6890N氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 MHO處理

內(nèi)源MHO含量伴隨著貯藏期延長(zhǎng)不斷增加，虎皮病發(fā)病對(duì)外源MHO的敏感性可能不斷增加，因此，冷藏期間每30 d取一次樣，每次取樣后進(jìn)行MHO處理，參照J(rèn)u Zhiguo等[12]的方法稍有改進(jìn)。每處理組取30 個(gè)果實(shí)放入30 L的密閉罐中，分別加入盛有7.5、15 mL和30 mL MHO的培養(yǎng)皿，即其處理使用劑量分別為0.25、0.5 mL/L和1.0 mL/L，每處理組重復(fù)3 次。20 ℃避光處理48 h后，在25 ℃培養(yǎng)箱里觀察發(fā)病情況，于第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)。削取果皮，混勻后測(cè)定生理指標(biāo)。對(duì)照組在密封罐中不放置含有MHO試劑的培養(yǎng)皿，其他步驟與MHO處理組操作相同。

1.3.2 虎皮病發(fā)病率測(cè)定

發(fā)病率按下式計(jì)算：

1.3.3 虎皮病病情指數(shù)測(cè)定

參考Zanella[16]的方法，根據(jù)果皮褐變面積所占比例（S）分為4 級(jí)，0級(jí)：未發(fā)??；1級(jí)：0%＜S≤25%；2級(jí)：25%＜S≤50%；3級(jí)：S＞50%。病情指數(shù)按下式計(jì)算：

1.3.4α-法尼烯和共軛三烯含量的測(cè)定

參照Anet[17]的方法，并作改進(jìn)。稱取2 g果皮放入試管，加10 mL正己烷避光浸提2 h。將浸提液過(guò)Florisil柱并洗脫定容至5 mL，測(cè)232 nm處的OD值，計(jì)算α-法尼烯的含量；于281 nm和290 nm處測(cè)OD值，計(jì)算共軛三烯的含量，單位為nmol/g。

1.3.5 MHO含量的測(cè)定

使用固相微萃取-氣相色譜法[18]。將1 g混勻果皮加入15 mL樣品瓶中，加2 mL NaCl溶液（200 g/L）密閉3 h。用老化后的萃取頭萃取20 min后進(jìn)行氣相色譜分析。進(jìn)樣口解吸2 min，設(shè)置為不分流進(jìn)樣；柱初溫40 ℃保持2 min后，以50 ℃/min的速率升至250 ℃，運(yùn)行2 min；用氫離子火焰檢測(cè)器，溫度為250 ℃。用外標(biāo)法定性，單位μL/kg。

1.3.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定

參考Mao Linchun等[19]的方法測(cè)定，單位為mmol/g。稱取1 g果皮加入液氮充分研磨后，加入裝有4 mL 10%三氯乙酸溶液的試管中后，充分混勻，于12000 r/min條件下離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL 0.67%的硫代巴比妥酸溶液后沸水浴15 min，水浴后冷卻至室溫離心10 min，取上清液，測(cè)450、532 nm和600 nm處的吸光度，結(jié)果以nmol/g表示。

1.3.7 H2O2含量的測(cè)定

參考許婷婷等[20]的方法，稱取2 g果皮，加入適量丙酮作為提取液研磨，于12000 r/min條件下離心20 min，取上清液，加入0.1 mL 10%四氯化碳-鹽酸溶液和0.2 mL濃氨水，向反應(yīng)所得的沉淀物中加入3 mL 2 mol/L硫酸溶液進(jìn)行比色測(cè)定，單位為mmol/g。

1.3.8 超氧陰離子自由基釋放速率的測(cè)定

參考Duan Xuewu等[21]的方法稍作改進(jìn)測(cè)定，取2 g果皮，加15 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液，研勻后4 ℃離心15 min（5000×g）。取0.5 mL上清液，加入1 mL磷酸緩沖液和0.5 mL 10 mmol/L鹽酸羥胺溶液，25 ℃溫育20 min后加入1 mL 17 mmol/L對(duì)氨基苯磺酸溶液和1 mL 7 mmol/Lα-萘胺溶液，溫育20 min后測(cè)530 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果，單位為μmol/（min·g）。

1.3.9 CAT活力的測(cè)定

使用測(cè)試盒測(cè)定，根據(jù)說(shuō)明書(shū)稍作修改，取0.1 g果皮，液氮研磨后加入0.9 mL生理鹽水，振蕩渦旋后2500 r/min離心10 min，取上清液0.05 mL，加入1 mL試劑一和0.1 mL試劑二作為測(cè)定管，對(duì)照管不加上清液，其他操作同測(cè)定管。將測(cè)定管和對(duì)照管在37 ℃水浴1 min后加入試劑三和試劑四終止反應(yīng)，對(duì)照管最后加入0.05 mL上清液。在405 nm處測(cè)定吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.3.10 POD活力的測(cè)定

參考高俊鳳[22]的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，在470 nm處測(cè)定吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.3.11 SOD活力的測(cè)定參考高俊鳳[22]的方法，采用氮藍(lán)四唑法進(jìn)行測(cè)定，在560 nm處測(cè)定吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.3.12 總酚含量的測(cè)定

參考高俊鳳[22]的方法，取1 g果皮于50 mL錐形瓶中，加25 mL 60%甲醇溶液，55 ℃密封水浴3 h后過(guò)濾，以75%甲醇溶液，定容至50 mL。取0.3 mL提取液加1 mL福林-酚試劑、3 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至10 mL，室溫靜置2 h后測(cè)765 nm處吸光度，單位為mg/g。

1.3.13 PPO活力的測(cè)定

使用測(cè)試盒測(cè)定，根據(jù)說(shuō)明書(shū)稍作修改，取0.1 g果皮加入0.9 mL提取液，4 ℃離心10 min（8000 r/min），取上清液待測(cè)。測(cè)定管加入150 μL上清液、600 μL試劑二、150 μL試劑三，對(duì)照管中將上清液換為同等體積煮沸處理的上清液。37 ℃密封水浴10 min后沸水浴5 min，10000 r/min離心10 min。測(cè)定420 nm處吸光度，單位為U/（mg·min）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有測(cè)定指標(biāo)重復(fù)3 次，用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.001為差異高度顯著。用Graphpad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MHO處理誘發(fā)梨果虎皮病的效果

本實(shí)驗(yàn)室前期研究認(rèn)為，內(nèi)源MHO含量與梨虎皮病關(guān)系密切，可能是比共軛三烯更直接的致病因子。圖1為冷藏150 d時(shí)從冷庫(kù)取出健康果實(shí)，分別用0.25、0.5、1.0 mL/L的MHO處理并模擬7 d貨架期的發(fā)病情況。結(jié)果表明，果實(shí)出庫(kù)時(shí)（第0天）并未發(fā)病，未處理果實(shí)（CK）7 d后發(fā)生了虎皮病，MHO處理果實(shí)的發(fā)病情況隨處理濃度的升高而愈發(fā)嚴(yán)重。說(shuō)明外源MHO可以誘發(fā)梨的虎皮病。

圖1 MHO處理對(duì)碭山酥梨（150 d）虎皮病的影響Fig.1 Effect of MHO treatment on superficial scald of ‘Dangshansuli’pear fruit (stored for 150 days)

果實(shí)冷藏至90、120、150 d和180 d后分別用MHO處理后模擬7 d貨架期，結(jié)果如圖2所示，MHO處理組在90 d貨架期時(shí)開(kāi)始發(fā)病，對(duì)照組在120 d貨架期才開(kāi)始發(fā)病，果實(shí)發(fā)病率和病情指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，MHO處理果實(shí)的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），且MHO濃度越高，發(fā)病越嚴(yán)重。根據(jù)以上結(jié)果初步推測(cè)MHO處理加深了碭山酥梨的虎皮病。

圖2 MHO處理對(duì)碭山酥梨虎皮病發(fā)病率（A）和病情指數(shù)（B）的影響Fig.2 Effect of MHO treatment on the incidence (A) and disease index (B) of superficial scald in ‘Dangshansuli’ pear fruit

2.2 MHO對(duì)梨果皮α-法尼烯代謝的影響

α-法尼烯代謝途徑產(chǎn)物是虎皮病的誘發(fā)因子，共軛三烯是α-法尼烯的自氧化產(chǎn)物，而MHO是共軛三烯的氧化產(chǎn)物，內(nèi)源共軛三烯和MHO都與虎皮病有顯著相關(guān)性。由圖3A可知，α-法尼烯含量呈先升后降的趨勢(shì)，在冷藏120 d后的貨架期時(shí)達(dá)到峰值，在貯藏30～180 d時(shí)，MHO處理與對(duì)照之間差異顯著（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。且在120 d時(shí)，1.0 mL/L MHO處理組的α-法尼烯含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖3 MHO處理對(duì)碭山酥梨α-法尼烯（A）、共軛三烯（B）和MHO（C）的影響Fig.3 Effect of MHO treatment on contents of α-farnesene (A),conjugated trienes (B) and MHO (C) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

從圖3B可知，共軛三烯的含量均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，且以1.0 mL/L MHO處理果內(nèi)源共軛三烯濃度最大，在貯藏期間，1.0 mL/L MHO處理組的共軛三烯含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）。

圖3C表明貯藏期間果皮中的內(nèi)源MHO釋放量依次隨外源濃度的升高而升高，且不同濃度MHO處理后果皮內(nèi)的MHO含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01、P＜0.001），1.0 mL/L MHO處理組具有最大值。

以上結(jié)果表明，MHO處理可能通過(guò)提高碭山酥梨果皮內(nèi)部的α-法尼烯、共軛三烯和MHO含量，使果皮的虎皮病加劇。

2.3 MHO對(duì)梨果皮MDA、H2O2和超氧陰離子自由基水平的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，MDA含量越高，膜脂過(guò)氧化程度越高。由圖4A可知，果皮MDA含量在冷藏前期的貨架期上升較為緩慢，后期迅速升高。對(duì)MHO處理果實(shí)，貯藏期越長(zhǎng)，果皮中積累的MDA越多，并且MHO處理濃度越高，果皮中MDA含量越高。貯藏至180 d時(shí)模擬貨架期，對(duì)照組的MDA含量達(dá)到0.74 mmol/g，而0.25、0.5 mL/L和1.0 mL/L MHO處理的MDA含量分別為0.98、1.05 mmol/g和1.25 mmol/g，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.01、P＜0.001）。

圖4 MHO處理對(duì)碭山酥梨MDA（A）、H2O2（B）和超氧陰離子自由基（C）的影響Fig.4 Effect of MHO treatment on levels of MDA (A),H2O2 (B) and (C) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

活性氧是植物病害的誘發(fā)因子，其中H2O2和超氧陰離子自由基是果實(shí)內(nèi)的主要活性氧形式。如圖4B所示，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，3 個(gè)處理組和對(duì)照組貨架期果皮中的H2O2含量逐漸升高，與虎皮病發(fā)病趨勢(shì)相同。MHO處理顯著提高了果皮內(nèi)的H2O2含量（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），且處理的濃度越高，果皮內(nèi)H2O2含量越高。

如圖4C所示，果皮中超氧陰離子自由基釋放速率也隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，碭山酥梨對(duì)照組由剛?cè)霂?kù)時(shí)的0.28 μmol/（min·g），在貯藏180 d時(shí)升至0.97 μmol/（min·g）。同時(shí)，使用MHO處理后，超氧陰離子自由基釋放速率顯著增加，在貯藏前期顯著高于對(duì)照組，且MHO處理的濃度越高，增加越明顯。

綜合膜脂過(guò)氧化程度和活性氧指標(biāo)來(lái)看，外源MHO提高了果皮的活性氧水平，加劇了膜脂過(guò)氧化，進(jìn)而誘發(fā)虎皮病。

2.4 MHO對(duì)梨果皮抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)主要的活性氧清除系統(tǒng)，CAT、POD、SOD是其重要組分，在活性氧清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

由圖5 A 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果皮內(nèi)的CAT活力先升后降，且在貯藏至120 d后達(dá)到峰值（23.37 U/（mg·min））。在MHO處理后，CAT活力均顯著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），處理的MHO濃度越高，CAT活力越低。

圖5 MHO處理對(duì)碭山酥梨CAT（A）、POD（B）和SOD（C）活力的影響Fig.5 Effect of MHO treatment on activities of CAT (A),POD (B) and SOD (C) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

由圖5B可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果皮內(nèi)的POD活力先升后降，其活力在貯藏150 d后達(dá)到峰值（3.27 U/（mg·min）），1.0 mL/L MHO處理后，POD活力均顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），且處理的MHO濃度越高POD活力越低。

由圖5C可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果皮內(nèi)的SOD活力也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，在貯藏120 d后達(dá)到峰值（32.66 U/（mg·min））。處理的MHO濃度越高，SOD活力越低，且在貯藏后期，1.0 mL/L MHO處理組的SOD活力均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）。

虎皮病的發(fā)生和抗氧化酶系統(tǒng)有著密切聯(lián)系。隨著外源MHO濃度增加，抗氧化酶的活性逐漸降低，說(shuō)明MHO處理可能通過(guò)抑制抗氧化酶的活性，誘發(fā)虎皮病。

2.5 MHO對(duì)梨果皮總酚含量和PPO活力的影響

酚類物質(zhì)有著雙重作用，可作為酶促褐變的底物，也可以提高對(duì)活性氧的抗性。PPO可將酚類物質(zhì)氧化，是引起果皮褐變的主要酶類，因此果皮中的總酚含量和PPO活力的變化與果皮褐變有緊密的聯(lián)系。

由圖6 A 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組果皮總酚含量也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，且在150 d達(dá)到峰值。在M H O 處理后，總酚含量均顯著降低（P＜0.01、P＜0.001）。

圖6 MHO處理對(duì)碭山酥梨總酚含量（A）和PPO活力（B）的影響Fig.6 Effect of MHO treatment on the total phenol content (A) and PPO activity (B) in ‘Dangshansuli’ pear fruit

由圖6B可知，在冷藏90 d后果皮PPO活力快速升高，120 d出現(xiàn)一個(gè)峰值，冷藏0、120、150 d和180 d的果實(shí)經(jīng)MHO處理后，PPO活力均升高。

以上結(jié)果表明，外源MHO可能通過(guò)降低總酚含量，降低果皮的抗氧化能力，同時(shí)增強(qiáng)了PPO的活力，加劇了果皮褐變。

2.6 果皮MHO釋放量與活性氧相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

由表1可知，碭山酥梨果皮內(nèi)MHO含量與MDA、H2O2和超氧陰離子自由基極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與CAT、POD和SOD活力顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與PPO活力顯著正相關(guān)（P＜0.05）。表明MHO含量與活性氧代謝密切相關(guān)，也可能通過(guò)活化PPO誘導(dǎo)虎皮病。

表1 碭山酥梨MHO與活性氧相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性Table 1 Pearson correlation between MHO and other ROS related indicators in ‘Dangshansuli’ pear fruit

2.7 果皮MHO、H2O2與虎皮病的相關(guān)性

目前普遍認(rèn)為，內(nèi)源H2O2與虎皮病發(fā)生相關(guān)性最高，因此，分析其與發(fā)病率和病情指數(shù)的相關(guān)性，與MHO對(duì)比見(jiàn)表2，MHO與碭山酥梨發(fā)病率及病情指數(shù)均極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而H2O2與發(fā)病率及病情指數(shù)均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。因此，MHO與虎皮病的相關(guān)性更高。

表2 碭山酥梨MHO、H2O2與虎皮病的相關(guān)性Table 2 Pearson correlation between levels of MHO and H2O2 and superficial scald in ‘Dangshansuli’ pear fruit

3 討論

虎皮病是梨在冷藏的中后期極易發(fā)生的生理性病害，盡管黑褐色的病斑不深入果肉，但果肉風(fēng)味劣變，嚴(yán)重影響果品的外觀品質(zhì)，使其失去商品價(jià)值，給果農(nóng)、客商及貯藏企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。本研究用MHO熏蒸的方式處理碭山酥梨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHO可誘導(dǎo)果皮褐變，并且與自然狀態(tài)下的虎皮病癥狀幾乎完全一致（圖1），即MHO可誘發(fā)梨虎皮病，這與以前在蘋(píng)果上的研究結(jié)果一致[10-11]。

虎皮病的發(fā)生與α-法尼烯代謝關(guān)系緊密，有研究發(fā)現(xiàn)其下游的氧化產(chǎn)物MHO也與虎皮病的發(fā)生有一定聯(lián)系[8]。在本研究中，MHO處理后果皮內(nèi)的MHO含量升高，且有濃度效應(yīng)（圖3C），虎皮病癥狀也加重，且發(fā)病率與MHO呈極顯著正相關(guān)（r＝0.998，P＜0.01）（表2）。MHO處理后，果皮α-法尼烯和共軛三烯的含量與對(duì)照相比增加（圖3A、B）；而MHO處理能顯著提高虎皮病的發(fā)病率和病情指數(shù)（圖2），這說(shuō)明與α-法尼烯和共軛三烯相比，MHO與梨虎皮病發(fā)生的關(guān)系更為密切。

已有研究表明，虎皮病的發(fā)生與果皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累密切相關(guān)[23]。果皮發(fā)生虎皮病時(shí)，病果內(nèi)部的抗氧化系統(tǒng)遭到損傷，活性氧大量積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，進(jìn)而使原來(lái)被分隔開(kāi)的PPO和酚類物質(zhì)發(fā)生接觸，最終酚類物質(zhì)被氧化成了黑褐色的醌類物質(zhì)，導(dǎo)致果皮褐變或變黑[15,24-26]。研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、CAT和POD與虎皮病的發(fā)生密切相關(guān)[27-29]。在本研究中，MHO處理均顯著降低了CAT、POD和SOD活力（圖5）。表1的相關(guān)性分析也顯示，梨果皮的MHO含量與這3 種酶活力呈負(fù)相關(guān)，這說(shuō)明MHO誘發(fā)虎皮病可能通過(guò)損傷細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，H2O2與虎皮病的發(fā)生有顯著性關(guān)性，但MHO含量與虎皮病發(fā)生的相關(guān)性高于H2O2（表2）?？梢?jiàn)在梨虎皮病的發(fā)病過(guò)程中，MHO含量更具有預(yù)測(cè)發(fā)病的作用，也暗示MHO可能是虎皮病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)的信號(hào)。已有的研究認(rèn)為，活性氧積累與虎皮病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。因?yàn)镠2O2是許多植物生理過(guò)程中的信號(hào)分子，也是誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的信號(hào)[25]，張?jiān)F(tuán)隊(duì)研究表明，蘋(píng)果的虎皮病發(fā)病過(guò)程屬于PCD[30]，梨虎皮病部分還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，也可能涉及PCD。MHO是否通過(guò)誘發(fā)H2O2積累或爆發(fā)引發(fā)PCD是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

目前認(rèn)為，共軛三烯自氧化形成了MHO[24]，但并不清楚MHO如何引發(fā)虎皮病的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MHO處理顯著增加了果皮H2O2和超氧陰離子自由基的含量（圖4B、C）。而且果皮的MHO含量與H2O2及超氧陰離子自由基的含量呈極顯著正相關(guān)（表1），說(shuō)明MHO可能引起活性氧的積累。

MDA含量代表膜脂過(guò)氧化的程度，也是和虎皮病發(fā)病密切相關(guān)的指標(biāo)[27]。Lin Yixiong等[31]認(rèn)為H2O2導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，進(jìn)而積累MDA。MDA含量也是和虎皮病發(fā)病密切相關(guān)性的指標(biāo)。MHO處理的梨果皮中MDA顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明MHO加速了膜脂過(guò)氧化的過(guò)程。而且，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MHO處理也顯著增加了PPO活力（圖6B），PPO活力也與果皮MHO含量呈顯著相關(guān)（表1），和MDA積累一樣，這些可能都是活性氧積累的伴隨反應(yīng)。

綜上所述，推斷碭山酥梨虎皮病發(fā)病過(guò)程如下：在冷藏過(guò)程中，果皮細(xì)胞積累了大量的MHO，MHO打破了果皮細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡，破壞了細(xì)胞自身的抗氧化系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累，活性氧造成了果皮細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使原來(lái)被分隔開(kāi)的PPO和酚類物質(zhì)接觸，并使PPO活性升高，最終酚類物質(zhì)被氧化成了黑褐色的醌類物質(zhì)，導(dǎo)致果皮褐變，也可能MHO誘導(dǎo)的活性氧爆發(fā)引發(fā)的PCD，從而誘發(fā)了虎皮病，其中的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果顯示，MHO可以作為預(yù)測(cè)虎皮病發(fā)病的信號(hào)分子，可為梨虎皮病的研究提供參考。