李 錦，王 迪，陳勝軍，吳燕燕，李春生，王悅齊

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南省深遠(yuǎn)海漁業(yè)資源高效利用與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572018）

組胺中毒是全球范圍內(nèi)因水產(chǎn)品消費(fèi)而引發(fā)的食品安全問題[1-2]。通常情況下，食用含有高于1000 mg/kg組胺水平的魚類后，中毒癥狀可能在數(shù)分鐘至3 h內(nèi)出現(xiàn)[3]，組胺引起的中毒反應(yīng)，包括潮紅、頭痛、水腫、蕁麻疹、腹瀉、抽筋和嘔吐等典型的過敏樣食物中毒反應(yīng)[4-6]。近年來，我國(guó)因攝入含有組胺的水產(chǎn)品而引發(fā)的食物中毒屢見不鮮[7]，也曾報(bào)道過引發(fā)死亡的組胺中毒事件[8]。水產(chǎn)品中組胺的生成與積累主要是由于微生物的作用，伴隨著捕獲后魚體的死亡，魚體內(nèi)微生物開始大量繁殖，其中產(chǎn)組胺微生物產(chǎn)生的組氨酸脫羧酶可將魚體中的組氨酸轉(zhuǎn)化為組胺。組胺一旦在食品中生成，普通的冷凍、加熱、微波、煙熏等加工方式無法將其破壞[9]。各國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品中組胺含量都有明確的限量規(guī)定，其中歐盟允許鮮魚中存在的組胺含量最高不得高于200 mg/kg，其他水產(chǎn)品中最高不得超過400 mg/kg[10]；美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）要求水產(chǎn)品中組胺濃度的安全標(biāo)準(zhǔn)為不高于50 mg/kg；我國(guó)GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》中也對(duì)水產(chǎn)品中組胺含量做了明確的限量規(guī)定，其中青皮紅肉魚類不得高于400 mg/kg，其余水產(chǎn)品中組胺含量應(yīng)小于200 mg/kg[11]。組胺生成菌廣泛存在于海水、魚的腸道、鰓與體表中[12]。在高于等于15 ℃的條件下培養(yǎng)48 h，組胺生成菌在金槍魚魚汁或含1%～2%L-組氨酸的胰蛋白胨大豆肉湯（L-histidine tryptone soy broth，TSBH）培養(yǎng)基中生成組胺量超過1000 mg/L，則可以將其定義為具有高組胺生成能力的組胺生成菌，低于500 mg/L定義為具有低組胺能力的組胺生成菌[13-14]。常見的組胺生成菌有Morganella morganii[15]、Photobacteriumdamselae[16]、P.phosphoreum[17]、Klebsiella oxytoca[18]、M.psychrtolerans[19]等，其中P.phosphoreum與M.psychrotolerans可在低溫下生長(zhǎng)并生成組胺[20]。

M.psychrotolerans作為在2006年首次被分離并命名的菌株[20-23]，其與M.morganii的16S rRNA基因序列分析相似性高達(dá)98.6%，常被誤判為中溫性組胺生成菌M.morganii。但M.psychrotolerans菌株7 個(gè)蛋白編碼管家基因（atpD、dnaN、gyrB、hdc、infB、rpoB和tuf）在兩株菌之間的序列相似性均小于90.9%[20]。M.psychrotolerans可在0 ℃生長(zhǎng)，而M.morganii在低于7 ℃條件下則無法生長(zhǎng)[20]。研究表明，M.psychrotolerans廣泛存在于日本、丹麥和美國(guó)等海水與水產(chǎn)品中，且其分離株均顯示出較高的組胺生成能力[22-24]，且M.psychrotolerans在日本與丹麥均引起過食物中毒[22,25]反應(yīng)的發(fā)生。目前M.psychrotolerans在我國(guó)水產(chǎn)品中的污染情況尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。劉紅等[26]從秋刀魚中分離的M.morganii在4 ℃培養(yǎng)24 h后檢測(cè)到了22 mg/kg組胺。鑒于M.morganii無法在4 ℃條件下生長(zhǎng)，有理由懷疑我國(guó)市售水產(chǎn)品中也存在M.psychrotolerans。因此，本研究對(duì)廣東省市售水產(chǎn)品中M.psychrotolerans情況開展調(diào)查研究，并對(duì)其分離株組胺生成能力開展研究，為有效控制我國(guó)水產(chǎn)品中組胺積累問題提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中使用的水產(chǎn)品均隨機(jī)購(gòu)自于廣東省內(nèi)的水產(chǎn)品市場(chǎng)與超市，選購(gòu)大小均一的同種商品，將其分類置于冰水中，并于4 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。水產(chǎn)品具體來源詳見表1。

表1 水產(chǎn)品來源Table 1 Sampling locations of commercial fish in this study

胰蛋白胨、酵母提取物 英國(guó)Oxoid公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸黏菌素、盧哥氏碘液、去離子水北京Solarbio科技有限公司；L-組氨酸鹽酸鹽一水合物、溴甲酚紅紫、碳酸鈣 上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂、DNA Marker L（50～500 bp）生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉、氯化鐵 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）蘭杰柯科技有限公司；生理鹽水、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）、大豆酪蛋白瓊脂（tryptose soya agar，TSA）培養(yǎng)基、苯丙氨酸 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；組胺測(cè)定試劑盒 日本Kikkoman公司；Emerald Amp?Max PCR Master Mix日本Takara公司；酒精 美國(guó)Supelco公司；結(jié)晶紫染色液 北京康佳宏原生物科技有限公司；沙黃復(fù)染液上海源葉生物科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶試劑盒、過氧化氫酶試劑盒 北京盒子生工科技有限公司；硝酸鹽還原試劑盒、葡萄糖發(fā)酵管 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

M.psychrotoleransJCM16473T模式菌株購(gòu)自廣東省微生物保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器、IN612C低溫培養(yǎng)箱日本Yamato公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；Milli-Q純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)NanoDrop公司；電泳儀凝膠成像系統(tǒng) 北京百思佳特科技有限責(zé)任公司；Mastercycler nexus型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 德國(guó)艾本德股份公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；拍打式無菌均質(zhì)機(jī) 杰瑞安科技有限責(zé)任公司；金屬浴 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡 德國(guó)Leica公司；渦旋混勻儀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

1×Morganella enrichment（MOE）液體培養(yǎng)基[22]：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、磷酸二氫鉀7 g/L、磷酸氫二鉀7 g/L、L-組氨酸鹽酸鹽一水合物10 g/L、溴甲酚紅紫0.03 g/L，蒸餾水1 L，用1 mol/L的鹽酸/氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 5.1，121 ℃滅菌15 min。

2×MOE液體培養(yǎng)基[22]：胰蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、磷酸二氫鉀14 g/L、磷酸氫二鉀 14 g/L、L-組氨酸鹽酸鹽一水合物20 g/L、溴甲酚紅紫0.06 g/L，蒸餾水1 L，用鹽酸/氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 5.1，121 ℃滅菌15 min。

按照Niven等[27]的方法制備Niven’s agar固體培養(yǎng)基。

TSBH液體培養(yǎng)基：在TSB液體培養(yǎng)基加入0.01 g/mLL-鹽酸組氨酸，用1 mol/L的鹽酸/氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 6，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 魚類水產(chǎn)品中M.psychrotolerans的分布污染情況調(diào)查

本研究采用最大可能數(shù)法-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（most probable number-polymerase chain reaction，MPN-PCR）法對(duì)樣品中的M.psychrotolerans污染情況進(jìn)行調(diào)查。

在實(shí)驗(yàn)開始前，先在配制完成的MOE培養(yǎng)基中加入硫酸黏菌素（32 mg/L；1×MOE培養(yǎng)基中加入0.1 mL，2×MOE培養(yǎng)基中加入0.2 mL）。在超凈臺(tái)的無菌環(huán)境中將切好的25 g魚肉樣品加入225 mL配制好的無菌PBS中，均質(zhì)拍打3 min后，分別取1 mL和0.1 mL分別加入到體積為9 mL和9.9 mL的1×MOE培養(yǎng)基中，取10 mL樣品液加入到體積為10 mL的2×MOE培養(yǎng)基中，渦旋。制備成不同梯度濃度的MOE培養(yǎng)基，每個(gè)梯度設(shè)置3 組平行。將MOE篩選培養(yǎng)基置于12 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察培養(yǎng)基顏色變化并記錄[28]。

從顏色發(fā)生變化的培養(yǎng)基中吸取1 mL培養(yǎng)液，10000 r/min離心2 min，棄去上層液體，保留菌體沉淀，在沉淀中加入400 μL的Triton-100，渦旋后放入金屬浴中，99 ℃處理10 min，將此作為DNA擴(kuò)增模板。

對(duì)M.psychrotolerans的VasD基因進(jìn)行PCR定向擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增體系見表2、3，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)，接著72 ℃終延伸4 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)后觀察是否存在VasD基因特異性條帶。

表2 PCR實(shí)驗(yàn)引物[29]Table 2 Primer sequences used for PCR[29]

表3 PCR擴(kuò)增體系Table 3 Composition of PCR amplification system

1.3.3 魚類水產(chǎn)品中M.psychrotolerans菌株的分離及鑒定

從1.3.2節(jié)中得到的陽(yáng)性試管中取培養(yǎng)液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，涂布于Niven’s agar固體培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)72 h，挑取平板上具有顏色變化的菌落進(jìn)行劃線分離，并將分離得到的單菌落繼續(xù)依照1.3.2節(jié)中的PCR方法進(jìn)行VasD基因擴(kuò)增驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

將分離后的M.psychrotolerans菌株進(jìn)一步進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，包括革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)（酒精擦拭玻片，在酒精燈上干燥后，用接種環(huán)挑取一環(huán)生理鹽水到載玻片上，挑取少量純培養(yǎng)物在水滴上涂抺至均勻分散，將涂片在酒精燈火焰上滅活、固定；滴加結(jié)晶紫染色液1～2 滴，染1 min，用去離子水水洗；待干，滴加革蘭氏碘液，1 min后用去離子水水洗；滴加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，直至無紫色脫落為止，用去離子水水洗；油鏡鏡檢、氧化酶實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)（從TSA培養(yǎng)基上挑取培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)18～24 h后，加入氯化鐵溶液4～5 滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，觀察結(jié)果）、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、D-半乳糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[19,28-30]。

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果存在VasD基因擴(kuò)增條帶，且菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為革蘭氏陰性、氧化酶陰性、過氧化氫酶陽(yáng)性、苯丙氨酸酶陽(yáng)性、硝酸鹽還原性、葡萄糖發(fā)酵性、D-半乳糖的非酸產(chǎn)生性。PCR與生理生化鑒定雙重實(shí)驗(yàn)確保分離單菌落為M.psychrotolerans。

1.3.4M.psychrotolerans分離株組胺生成能力測(cè)定

將分離得到的M.psychrotolerans菌株進(jìn)行組胺生成能力的測(cè)定。勾取TSA平板中分離株單菌落接種于TSB培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)20 h，吸取菌液1 mL，經(jīng)PBS洗滌兩次（10000 r/min、2 min、4 ℃）后，取100 μL接入5 mL TSBH液體培養(yǎng)基中（初始接菌落總數(shù)約為1×105CFU/mL），20 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)定菌落總數(shù)與組胺含量。組胺測(cè)定：取1 mL上述TSBH培養(yǎng)基菌液，100 ℃金屬浴15 min后，以10000 r/min離心2 min，取上清液依照試劑盒中的實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定組胺。

1.3.5 分離株與模式菌株生長(zhǎng)與組胺生成能力比較

將上述分離到的產(chǎn)組胺能力最強(qiáng)的菌株與模式菌株進(jìn)行生長(zhǎng)與組胺生成能力的比較分析。將分離株與模式菌株分別接入TSB，25 ℃培養(yǎng)20 h，對(duì)預(yù)培養(yǎng)菌液稀釋100 倍，取0.1 mL稀釋培養(yǎng)液加入到9.9 mL TSBH（pH 6.0）中（初始接菌落總數(shù)約4×103CFU/mL），分別置于4 ℃和20 ℃培養(yǎng)，并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣分別對(duì)菌落總數(shù)和組胺含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 魚類水產(chǎn)品中M.psychrotolerans污染調(diào)查

表4顯示，在101～102MPN/100 g范圍內(nèi)的樣本數(shù)為16 個(gè)（16%），在102～103MPN/100 g范圍內(nèi)的樣本數(shù)為11 個(gè)（11%），在103～104MPN/100 g范圍內(nèi)的樣本數(shù)為5 個(gè)（5%），超過104MPN/100 g的樣本數(shù)為2 個(gè)（2%）。研究結(jié)果表明在隨機(jī)檢測(cè)的廣東省在售的100 個(gè)水產(chǎn)品樣本中，陽(yáng)性樣品率為34%，34 個(gè)陽(yáng)性樣本中包括鯖魚13 個(gè)（38.24%）、金槍魚10 個(gè)（29.41%）、三文魚5 個(gè)（14.71%）、沙丁魚3 個(gè)（8.82%）、竹莢魚2 個(gè)（5.88%）、鰈魚1 個(gè)（2.94%）；其中78 個(gè)青皮紅肉魚類樣品中呈現(xiàn)28 個(gè)陽(yáng)性樣本（35.9%），22 個(gè)白肉魚類樣品中呈現(xiàn)6 個(gè)陽(yáng)性樣本（27.3%）（圖1）。綜上，M.psychrotolerans在廣東在售水產(chǎn)品中廣泛存在，尤其是青皮紅肉魚類水產(chǎn)品，需重點(diǎn)關(guān)注。

圖1 陽(yáng)性樣品和陰性樣品占總樣品的比例和不同種類魚在陽(yáng)性樣品中的占比Fig.1 Proportions of positive and negative samples among total samples and proportions of different kinds of fish in positive samples

表4 魚類水產(chǎn)品中MPN-PCR陽(yáng)性樣品數(shù)Table 4 Number of MPN-PCR positive samples in different kinds of fish

2.2 水產(chǎn)品中M.psychrotolerans的篩選與分離鑒定

如圖2所示，其中16 株分離株顯示出VasD特征基因條帶，同時(shí)16 株分離株生理生化實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，分離株符合M.psychrotolerans的生理生化特征，表現(xiàn)為革蘭氏陰性、氧化酶陰性、過氧化氫酶陽(yáng)性、苯丙氨酸酶陽(yáng)性、硝酸鹽還原性、葡萄糖發(fā)酵性、D-半乳糖的非酸產(chǎn)生性。其中，16 株M.psychrotolerans分別來自金槍魚（1～4 分離株）、鯖魚（5～14分離株）與三文魚（15～16 分離株）。

圖2 分離株VasD特征基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of the characteristic gene VasD from isolated strains

2.3 M.psychrotolerans分離株的組胺生成能力

對(duì)分離到的16 株M.psychrotolerans進(jìn)行生長(zhǎng)與組胺生成能力的測(cè)定。如圖3所示，在TSBH培養(yǎng)基中經(jīng)20 ℃（室溫）培養(yǎng)48 h后，菌落總數(shù)均上升至9（lg（CFU/mL））左右，但未顯示出顯著差異（P＞0.05），對(duì)其組胺生成量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，分離菌株經(jīng)20 ℃培養(yǎng)48 h后的組胺生成量在1903～4281 mg/L之間，分離株1呈現(xiàn)最強(qiáng)組胺生成能力，分離株13呈現(xiàn)出最弱組胺生成力，但分離株組胺生成量均超過1000 mg/L，符合Staruszkiewicz等[13]對(duì)于高組胺生成菌的定義。不同菌株之間組胺生成量呈現(xiàn)顯著差異。分離株M.psychrotolerans1的組胺生成量為4281 mg/L，略高于模式菌株的組胺生成量（4147 mg/L）。

圖3 M.psychrotolerans菌株生長(zhǎng)及組胺生成能力Fig.3 Growth and histamine-producing capacity of M.psychrotolerans

2.4 M.psychrotolerans分離株1與模式菌株生長(zhǎng)和組胺生成能力

將分離株1與M.psychrotoleransJCM16473T模式菌株在4 ℃（冷藏）和20 ℃（室溫）條件下的生長(zhǎng)曲線和組胺生成能力進(jìn)行比較研究，結(jié)果如圖4所示。在4 ℃條件下培養(yǎng)時(shí)，分離株1 的初始接菌量約為3.9（lg（CFU/mL）），模式菌株的初始接菌量約為3.2（lg（CFU/mL））。在培養(yǎng)2 d后，兩株菌的菌落總數(shù)上升至4.5（lg（CFU/mL））；培養(yǎng)4 d后，菌落總數(shù)上升至7（lg（CFU/mL））左右（圖4a），且檢測(cè)到了組胺的生成，分離株1的組胺生成量為208.4 mg/L，模式菌株的組胺生成量為197.2 mg/L（P＞0.05）（圖4b）；在培養(yǎng)8 d后，菌落總數(shù)雖未呈現(xiàn)快速上升，但菌株組胺積累量呈現(xiàn)顯著上升，分離株1與模式菌株組胺生成量分別為2531.57 mg/L與2177.67 mg/L；培養(yǎng)10 d后，分離株1與模式菌株組胺生成量分別上升至4224.17 mg/L與3960 mg/L,分離株1的組胺生成量顯著高于模式菌株（P＜0.05）。在20 ℃（室溫）條件下，分離株1與模式菌株生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)相似趨勢(shì)（圖4c），培養(yǎng)12 h后檢測(cè)到組胺生成，培養(yǎng)36 h后，兩株菌的組胺生成量均大于1000 mg/L，且模式菌株的組胺生成量略高于分離株1，但并未呈現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)培養(yǎng)至48 h，分離株1組胺生成量顯著高于模式菌株分離株1（P＜0.05）；在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，模式菌株組胺生成量上升至3937.67 mg/L，顯著高于分離株1（P＜0.05）（圖4d）。

圖4 不同溫度條件下分離株1與模式菌株在TSBH中的生長(zhǎng)和組胺生成情況Fig.4 Growth and histamine-producing capacity of isolate 1 and type strain in TSBH at different temperatures

3 討論

水產(chǎn)品是優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源之一，其高蛋白質(zhì)、低熱量、高不飽和脂肪酸的特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛，是居民膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，居民對(duì)水產(chǎn)品的消費(fèi)比重不斷增加，但水產(chǎn)品易發(fā)生品質(zhì)劣化且存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，其中組胺作為影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素之一。隨著冷鏈物流的發(fā)展，冷鏈已可以解決由中溫性組胺生成菌引起的組胺積累的問題，但由耐冷性組胺生成菌引起的組胺積累問題并未減少，即使在冷鏈物流發(fā)達(dá)的美國(guó)與日本亦是如此。M.psychrotolerans作為2006年才被分離出的耐冷性組胺生成菌，研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的組胺生成能力，并且能夠在0 ℃條件下生長(zhǎng)并生成組胺，且廣泛存在于日本在售水產(chǎn)品中，其在北海道水產(chǎn)中的污染率達(dá)42.6%，在青皮紅肉魚和白肉魚中的污染率分別為31.6%和62.5%[25]。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)比較發(fā)現(xiàn)，M.psychrotolerans在北海道在售水產(chǎn)品與廣東省在售魚類水產(chǎn)品中污染率均達(dá)到30%以上。此外，Bjornsdottir-Butler等[31]從美國(guó)阿拉巴馬州當(dāng)?shù)爻械恼婵瞻b的鬼頭刀魚中也分離出了M.psychrotolerans；Frith等[32]在研究環(huán)境和水質(zhì)變量對(duì)墨西哥灣北部組胺生成菌濃度和種類的影響中發(fā)現(xiàn)，M.psychrotolerans占所有分離菌株的1%。以上研究結(jié)果均表明M.psychrotolerans廣泛存在海水與水產(chǎn)品中。因此，需更多關(guān)注由M.psychrotolerans引起的水產(chǎn)品中組胺積累問題。

為了更好地調(diào)查M.psychrotolerans在廣東市售水產(chǎn)品中的污染分布情況，本研究利用MPN-PCR法在12 ℃條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該溫度可以有效抑制中溫性組胺生成菌的生長(zhǎng)[25]，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加硫酸黏菌素，可以有效抑制其他微生物的生長(zhǎng)，但由于M.psychrotolerans具有硫酸黏桿菌抗生素抗性[20]，M.psychrotolerans可在此培養(yǎng)基中很好地生長(zhǎng)。此外，M.psychrotolerans因與M.morganii具有高度相似性，本研究利用PCR法對(duì)M.psychrotolerans的特征基因VasD進(jìn)行擴(kuò)增，有效地區(qū)分了M.morganii與M.psychrotolerans。本研究采用MPN-PCR法可高效實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中M.psychrotolerans污染調(diào)查。本研究目前分離16 株M.psychrotolerans，其中14 株均來自青皮紅肉魚類水產(chǎn)品，占全部分離株的87.5%，分析其主要原因是由于青皮紅肉魚中組氨酸含量高于白肉魚，約為幾千到幾萬(wàn) μg/g[33]，水產(chǎn)品中組胺含量與水產(chǎn)品中組氨酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)。14 株分離株又均來自金槍魚與鯖魚，主要可能由于金槍魚與鯖魚在青皮紅肉魚中其魚肉中組氨酸含量也較高，含量約為24000 μg/g和13500 μg/g，是FDA重點(diǎn)關(guān)注的具有組胺中毒風(fēng)險(xiǎn)的水產(chǎn)品；此外，本研究在三文魚中也分離到2 株M.psychrotolerans，分析其原因可能是由于M.psychrotolerans不僅為組胺生成菌，同時(shí)也是三文魚致病菌[34]。金槍魚、鯖魚、三文魚作為全球流通的水產(chǎn)品，廣泛存在于全球各國(guó)與各個(gè)城市的水產(chǎn)品市場(chǎng)中，研究結(jié)果提示需要重點(diǎn)關(guān)注這些水產(chǎn)品，同時(shí)對(duì)分離出M.psychrotolerans的水產(chǎn)品開展溯源調(diào)查研究，明確M.psychrotolerans主要污染源頭。

本研究中16 株M.psychrotolerans分離株均顯示出較強(qiáng)的組胺生成能力，且分離株組胺生成能力不盡相同（圖3、4），這與Kato等[22]的研究結(jié)果一致，其分離到的菌株也與模式菌株呈現(xiàn)出不同的組胺生成能力。這可能是由于組胺生成與多個(gè)酶相關(guān)，包括組氨酸脫羧酶、轉(zhuǎn)運(yùn)組胺和組氨酸的相關(guān)蛋白的酶和編碼組織蛋白酶RNA合成酶[35-37]，經(jīng)過對(duì)比NCBI現(xiàn)有的M.psychrotolerans全基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼不同M.psychrotolerans菌株的組胺生成相關(guān)基因存在不同，這可能引起與組胺生成相關(guān)酶活力呈現(xiàn)不同；同時(shí)組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)與組胺轉(zhuǎn)出還與菌株細(xì)胞膜蛋白相關(guān)，這些原因均可能引起分離株組胺生成能力存在不同。在4 ℃培養(yǎng)2 d后的分離株1和模式菌株均未檢測(cè)到組胺的生成（圖4b），這主要是因?yàn)榧?xì)菌在新環(huán)境中的生長(zhǎng)早期階段，通常會(huì)優(yōu)先利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，而不是產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，并且在較低的溫度下，微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)都有所減緩，組胺的積累主要發(fā)生在微生物生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期與平穩(wěn)期[38]；在4 ℃培養(yǎng)4 d后模式菌株和分離株1的組胺生成量分別達(dá)到了197.2 mg/L和208.4 mg/L，均超過了FDA規(guī)定的組胺質(zhì)量濃度安全標(biāo)準(zhǔn)（50 μg/mL），在北海道金槍魚和沙丁魚等水產(chǎn)品中分離到的M.psychrotolerans在4 ℃培養(yǎng)8 d組胺生成量達(dá)到了2800 mg/L[22]，接種了丹麥分離的M.psychrotolerans的金槍魚罐頭在4 ℃培養(yǎng)6 d，組胺生成量超500 mg/kg[24]。結(jié)合本研究與文獻(xiàn)中報(bào)道中的研究結(jié)果表明，M.psychrotolerans廣泛存在于全球水產(chǎn)品中且低溫下具有高組胺生成能力的組胺生成菌。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)M.psychrotolerans首次開展了其在水產(chǎn)品中污染情況的調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)M.psychrotolerans在廣東省市售水產(chǎn)品中廣泛存在且其分離株均具有較強(qiáng)組胺生成能力。本研究結(jié)果表明需重點(diǎn)關(guān)注水產(chǎn)品中的M.psychrotolerans控制由其可能帶來的水產(chǎn)品中組胺積累的問題，開發(fā)新型抑菌劑與抑菌技術(shù)有效控制M.psychrotolerans，同時(shí)開展耐冷性產(chǎn)胺菌生物胺生成與積累機(jī)制研究。本研究為水產(chǎn)品中M.psychrotolerans污染情況提供理論數(shù)據(jù)，對(duì)切實(shí)保障水產(chǎn)品品質(zhì)與質(zhì)量安全具有重要科學(xué)意義。