陳晨 占啟剛 盛琦 張晶晶 應(yīng)燕玲 章偉 朱發(fā)明 何吉

臍帶血、成人骨髓、外周血來源的造血干（祖）細胞及胚胎干細胞、誘導多能干細胞等可在體外大量誘導生成紅細胞[1]。然而在體外培養(yǎng)生成的紅細胞中，能實現(xiàn)脫核的紅細胞只占極少數(shù)，多數(shù)紅系細胞停留在晚幼紅細胞階段，不能完成脫核步驟。已證實只有脫核的成熟紅細胞才能發(fā)揮正常的生理功能，而有核紅細胞的攜氧功能明顯較低。因此，脫核是體外生成成熟紅細胞能否成功應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一；但在體外培養(yǎng)過程中脫核效率較低[2-3]。為了提高造血干細胞生成成熟紅細胞的能力，根據(jù)實驗室前期研究基礎(chǔ)，本實驗選擇可能促進紅系細胞脫核的磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol trihydroxykinase，PI3K）、細胞松弛素B 和組蛋白脫乙酰化酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）作為脫核劑，探討這3 種脫核劑促紅系脫核過程中的作用，以建立體外生成紅細胞高效脫核體系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 CD34+細胞免疫磁珠分選試劑、CD34+細胞分選緩沖液Buffer（德國美天旎公司）；1.077 Ficoll淋巴細胞分離液（美國GE 公司）；pH 7.2 PBS（美國Gibco 公司）；無血清培養(yǎng)基（Stem SpanTMSFEM，加拿大Stem Cell 公司）；促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、干細胞生長因子（stem cell factor，SCF）、IL-3（美國PeproTech Inc 公司）；CD235-FITC 抗體（美國Biolegend 公司）、SYTO-64 核酸染料（美國Invitrogen 公司）；人2,3-二磷酸甘油酸（2,3-Diphosphoglycerate，2,3-DPG）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（美國Sigma 公司）；ATP 測定試劑盒（美國Promega 公司）；細胞松弛素B（英國abcam 公司）、PI3K（英國Millipore 公司）、HDAC2（美國Cayman Chemical 公司）。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血采集 臍帶血來自浙江省臍帶血造血干細胞庫自愿無償捐獻者，均簽訂知情同意書。正常健康產(chǎn)婦足月順產(chǎn)胎兒娩出后，立即斷臍，消毒行靜脈穿刺，用臍帶血收集袋收集臍帶血。本研究經(jīng)浙江省血液中心醫(yī)學倫理委員會審查通過（批準文號：省血液中心倫審2023 年研第002 號）。

1.2.2 臍帶血單個核細胞分離 用0.9%氯化鈉溶液1∶1 稀釋臍帶血，加到比重為1.077 g/mL 的淋巴細胞分離液上，1 500 r/min（423 g）離心35 min，收集中間的單個核細胞層。加入PBS 溶液重懸，2 000 r/min（751 g）離心10 min，去上清液，重復上述操作。最后用CD34+細胞分選緩沖液Buffer 300 μL 重懸細胞。

1.2.3 CD34+細胞分選富集 采用CD34+細胞免疫磁珠分選試劑（包含F(xiàn)cR Blocking Reagent、microbeads），嚴格按試劑盒說明書操作。加100 μL FcR Blocking Reagent 于上述細胞懸液中，混勻，加100 μL microbeads，混勻，2～8 ℃冰箱中孵育30 min，加10 mL Buffer，1 000 r/min（300 g）離心10 min，去上清液，加500 μL Buffer 懸浮細胞。將分選柱子放入磁鐵中，加500 μL Buffer 于柱中濕潤柱子，將細胞懸液加到柱中過柱，加500 μL Buffer 洗3 次。將柱子移出磁鐵，放入收集管中，加1 000 μL Buffer 于柱中，加壓使細胞洗下來，重復磁珠分選步驟。

1.2.4 臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞體系的構(gòu)建 將富集的CD34+細胞用無血清培養(yǎng)基混勻后，以104個細胞/mL 濃度接種至無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系為10 mL。置37 ℃、5% CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，第4、7、11、15、18 天半量換液。第7 天將細胞濃度調(diào)整至105個細胞/mL，第11 天細胞濃度調(diào)整至5×105～1×106個細胞/mL，第15 天將細胞濃度調(diào)整至5×106～10×106個細胞/mL。添加細胞因子如下：第0、4 天：EPO（33.3 ng/mL）+SCF（100 ng/mL）+IL-3（5 ng/mL）。第7 天：EPO（33.3 ng/mL）+SCF（100 ng/mL）。第11、15、18 天：僅添加EPO（33.3 ng/mL）。

1.2.5 臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞體系3 種脫核劑濃度和添加時間的優(yōu)化選擇 PI3K、細胞松弛素B、HDAC2 3 種脫核劑分別設(shè)置4 個濃度和添加時間。利用4 因素4 水平的正交設(shè)計進行實驗分組。在培養(yǎng)期間加入脫核劑時轉(zhuǎn)為6 孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為2 mL，細胞數(shù)為5.5×105個/孔。設(shè)置不加脫核劑孔作為對照組。4 因素為：脫核劑PI3K、HDAC2、松弛素B 和加入脫核劑時間。每個因素有4 個水平：PI3K 濃度為0、20、50、100 ng/mL；HDAC2 濃度為0、60、150、300 ng/mL；松弛素B 濃度為0、25、50、75 ng/μL；加入脫核劑的時間為第7、11、15、18 天。見表1。采用L16（44）正交實驗設(shè)計表，分成16 組，見表2。以紅細胞脫核率為評價指標，考察各個因素對紅細胞脫核的影響。

表1 實驗因素和水平

表2 正交實驗設(shè)計表

1.2.6 優(yōu)化條件的驗證實驗 根據(jù)正交實驗得到的優(yōu)化條件作為優(yōu)選組，以不加脫核劑作為對照組，用1.2.4 構(gòu)建的體系，加入脫核劑，進行臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞培養(yǎng)，評估紅細胞脫核的效果。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測 取50 μL 細胞懸液加入流式管中，加入流式抗體CD235-FITC 2 μL，每106個細胞加入稀釋的SYTO-64 核酸染液1 ml（1 μL SYTO-64 核酸原染料加1 mL 0.9%氯化鈉稀釋），輕微振蕩混勻，避光孵育30 min，洗去未結(jié)合的熒光抗體后，使用流式細胞儀上機檢測和分析。脫核率（%）=SYTO-64-細胞比例/CD235+細胞比例×100%。

1.2.8 細胞染色觀察 取10 μL 培養(yǎng)細胞懸液到載玻片上涂開，形成直徑1 cm 左右的涂片，自然晾干，瑞氏吉姆薩染色，按試劑盒說明書操作。

1.2.9 細胞電鏡檢測 對培養(yǎng)的紅細胞通過固定、洗滌、染色、脫水、干燥后將樣本轉(zhuǎn)移到S-3000N 掃描電子顯微鏡（日本日立公司）載樣臺上，噴鉑金，電鏡檢測。

1.2.10 紅細胞2,3-DPG 含量檢測 采用ELISA 法檢測紅細胞2,3-DPG，嚴格按試劑盒說明書操作。取1 mL PBS稀釋后的細胞懸液，置-20 ℃冰箱冷凍20 min。取出融化后2 000 r/min 離心20 min，取上清液作為樣本。配置標準品。在酶標包被板上分別設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣品孔。加50 μL 樣品于酶標板孔底部，37 ℃溫育30 min 后，洗板，加酶溫育30 min，洗板，顯色，加終止液。根據(jù)標準品OD 值作出回歸曲線，并得出曲線方程，將待測樣品的OD 值代入方程，得出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即得到待測樣品細胞內(nèi)的2,3-DPG 含量。

1.2.11 紅細胞ATP 含量檢測 采用化學發(fā)光法檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。用PBS 稀釋細胞懸液成1×107/mL。配制標準品，分別設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣品孔。加100 μL 樣品，每孔做復孔。每孔加入100 μL celltiter-glo 試劑，室溫孵育10 min 穩(wěn)定熒光信號值。發(fā)光檢測儀記錄發(fā)光值。根據(jù)標準品發(fā)光值作出回歸曲線，并得出曲線方程，將待測樣品的發(fā)光值代入方程，得出待測樣品細胞內(nèi)的ATP 含量。

1.2.12 檢測紅細胞計數(shù) 采用Sysmex xs-900i 血細胞計數(shù)儀（日本希森美康公司）測RBC。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件設(shè)計正交方案。采用GraphPad Prism 8.0 軟件處理驗證數(shù)據(jù)。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞體系脫核劑濃度和加入時間選擇 根據(jù)正交設(shè)計實驗計算出的R值可知，各因素對脫核率的影響大小依次為松弛素B、加脫核劑時間、PI3K、HDAC2，即松弛素B 對脫核率影響最大。通過K值判斷，優(yōu)選條件為第15 天加脫核劑、PI3K 濃度100 ng/mL、HDAC2 濃度150 ng/mL、松弛素B濃度75 ng/μL，以此優(yōu)選條件作為優(yōu)選組。見表3。

表3 體外生成紅細胞體系脫核劑濃度和加入時間

2.2 優(yōu)選條件的驗證實驗結(jié)果 優(yōu)選組與對照組CD235+細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。優(yōu)選組SYTO-64-細胞數(shù)及脫核率明顯高于對照組（均P＜0.05）。優(yōu)先組與對照組紅細胞內(nèi)ATP、2,3-DPG比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。按照優(yōu)選條件培養(yǎng)至第21 天的結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化條件的驗證實驗結(jié)果

2.3 RBC 和形態(tài)分析結(jié)果 初始104個CD34+細胞經(jīng)本實驗體系培養(yǎng)后，第21 天RBC 平均可達2×1010/L。培養(yǎng)至第18 天出現(xiàn)成熟無核紅細胞，見圖1（插頁）。

圖1 培養(yǎng)至第18 天時細胞形態(tài)

2.4 紅細胞電鏡觀察結(jié)果 培養(yǎng)第21 天的細胞通過電鏡觀察可見典型的雙凹圓盤狀，見圖2（插頁）。

圖2 培養(yǎng)第21 天的紅細胞電鏡照片

3 討論

對于嚴重貧血或需要外科手術(shù)輸血的患者，紅細胞輸注是一種成熟且不可替代的治療方法。然而，全球范圍內(nèi)異體血液供應(yīng)存在嚴重緊缺狀態(tài)，而且異體輸血時涉及血液傳播疾病以及輸血后并發(fā)癥等問題，因此尋找紅細胞的替代來源在血液領(lǐng)域十分迫切和必要[4]。目前，紅細胞替代來源的研究主要集中在全氟化碳、Hb 氧載體和干細胞誘導紅細胞等方面，其中干細胞誘導生成紅細胞是指通過使用胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞在體外經(jīng)過一系列誘導分化產(chǎn)生紅細胞的過程[5-6]。體外生成紅細胞是模擬體內(nèi)紅細胞形成的過程，需要經(jīng)過脫核步驟才能形成成熟的無核紅細胞，脫核過程則是紅細胞成熟終末階段發(fā)生的關(guān)鍵事件。在體外培養(yǎng)生成紅細胞體系中，脫核效率低下是一個較常見的問題[7-9]，目前在誘導干細胞紅系分化的體系中，只有在基質(zhì)細胞的輔助下誘導造血干（祖）細胞才能實現(xiàn)較為高效的成熟和脫核效率，但基質(zhì)細胞會影響其后續(xù)的應(yīng)用；而無基質(zhì)細胞體系或是以胚胎干細胞、誘導多能干細胞為起始細胞的誘導體系中，紅細胞成熟和脫核效率仍然有待提高。研究表明，在體外條件下通過誘導人胚胎干細胞可以獲得脫核紅細胞，但是其脫核率在60%左右[10-11]；多能干細胞在體外誘導條件下可以獲得晚幼紅細胞，但是其脫核率僅有4%～10%[12]。因此如何提高體外培養(yǎng)體系紅細胞脫核率就顯得尤為重要，值得繼續(xù)深入研究。

早期研究觀察到細胞松弛素B 能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠L 細胞發(fā)生脫核作用；隨后的研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的條件下，細胞松弛素B 對人紅白血病K562 細胞也有誘導脫核的作用[13-14]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)在紅細胞脫核的過程中，還有眾多的蛋白質(zhì)及因子參與其中，其中組蛋白去乙?；? 對紅細胞的脫核有重要的調(diào)控作用[15-17]。使用組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾谹 和丙戊酸作用于即將脫核的細胞，能明顯地抑制染色體的凝集、肌動蛋白收縮環(huán)的形成以及細胞的脫核。Chao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)當紅細胞脫核時，PI3K 的產(chǎn)物磷脂酰二磷酸和磷脂酰三磷酸在細胞膜的胞質(zhì)側(cè)聚集，抑制PI3K 功能可阻礙細胞極化，導致細胞脫核受阻，提示紅細胞去核過程依賴于PI3K 調(diào)控的細胞極化。進一步研究發(fā)現(xiàn)此過程是由微管介導PI3K 信號通路的活化，引發(fā)肌動蛋白的不對稱聚集，從而導致細胞極化現(xiàn)象的產(chǎn)生，并且這種現(xiàn)象的產(chǎn)生對下一步細胞核的移位及最終細胞核的排出有重要的意義。

本實驗室前期進行了PI3K、細胞松弛素B 和HDAC2 對紅細胞脫核作用的單因素分析，結(jié)果顯示3種因子分別對紅細胞脫核均有促進作用，脫核率可達40%～60%，這提示如果3 種脫核劑共同作用或能更好地促進脫核，提高脫核率。因此，本實驗設(shè)計4 因素4水平正交實驗，3 種脫核劑不同濃度、不同加入時間共16 個組合分析脫核效果。實驗得出優(yōu)化條件為第15天加脫核劑，PI3K 濃度為100 ng/mL，HDAC2 濃度為150 ng/mL，松弛素B 濃度為75 ng/μL。并根據(jù)此優(yōu)化條件作為優(yōu)選組進行驗證，結(jié)果顯示與對照組相比，優(yōu)選組SYTO-64-細胞數(shù)及脫核率明顯高于對照組，脫核率達74.30%。而且成熟紅細胞形態(tài)和功能正常，說明3 種脫核劑存在協(xié)同作用，這為體外誘導分化紅細胞脫核提供了一種可行的方法。

綜上所述，目前有關(guān)體外生成紅細胞脫核過程的具體機制尚不完全清楚，而干細胞體外生成紅細胞過程中紅細胞脫核率較低，這已成為體外獲取功能性紅細胞的主要技術(shù)瓶頸之一。盡管本研究提升了紅細胞脫核率，但仍不能滿足臨床需求，今后將進一步研究建立體外生成紅細胞高效脫核培養(yǎng)體系，為臨床輸血提供一種新的來源，有利于提升血液安全。