兀琦,楊靜依,陳啟梅,王安美,孫藝軒,張加余,楊愛琳

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 煙臺 264003)

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一,據(jù)2020年GLOBOCAN項目研究表明肝癌的死亡率位居世界第三,占癌癥總死亡率的8.3%[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌最常見的一種類型。早期發(fā)現(xiàn)可通過手術(shù)切除、射頻消融術(shù)、肝移植等方法治療,然而大多數(shù)肝癌患者確診時已為中晚期[2]。截至目前,化療依舊是晚期肝癌治療的主要方法,但在臨床治療中,化療往往會引起一系列不良反應(yīng),例如肝功能異常、高血壓、腹瀉等。因此迫切需要開發(fā)新的有效、低毒性抗肝癌藥物。

中醫(yī)藥有著悠久的歷史,近年來在抗腫瘤領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。中醫(yī)藥能夠增強(qiáng)化療療效,提高生存期。華蟾素是從蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍(BufoBufogargarizansCantor)蟾蜍干皮中提取所得,其主要活性成分為蟾蜍二烯內(nèi)酯、生物堿和肽類[3]。華蟾素膠囊、華蟾素注射液等廣泛應(yīng)用于臨床肝癌的治療[4-5]。臨床研究表明,華蟾素聯(lián)合化療藥物能夠顯著提高晚期癌癥患者藥物療效和生活質(zhì)量[6]。另外,有研究表明華蟾素能夠通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和抑制腫瘤血管生成等多方面機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤功效[7]。

鐵死亡是由于失去對膜脂質(zhì)過氧化的控制而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的形式,其發(fā)生過程中伴隨鐵依賴性脂質(zhì)累積、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)功能異常、活性氧(ROS)升高和還原型谷胱甘肽(GSH)含量下降[8-9]。GSH是人體內(nèi)重要的抗氧化劑,能夠清除活性氧。此外,有研究表明GSH合成障礙導(dǎo)致脂質(zhì)活性氧累積,導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生[10]。GSS催化λ-谷氨酰半胱氨酸與甘氨酸反應(yīng)生成還原性GSH,不受GSH反饋抑制的調(diào)節(jié)[11]。另有資料顯示,在肝癌細(xì)胞中,核糖核苷酸還原酶M2肽(RRM2)依賴于GSS刺激GSH合成,從而抑制鐵死亡[12],且有研究表明通過藥物誘導(dǎo)鐵死亡為目前腫瘤治療的新策略及研究熱點(diǎn)[13]。關(guān)于華蟾素能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡及作用機(jī)制目前鮮有報道,本研究從鐵死亡角度探討華蟾素抑制肝癌細(xì)胞生長的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物華蟾素膠囊(批號:OD04)來自于陜西東泰制藥有限公司。

1.2 細(xì)胞系人肝癌HepG2細(xì)胞(American Type Culture Collection)。

1.3 試劑DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素混合液和0.25%的胰蛋白酶(美國康寧公司);CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑、還原型谷胱甘肽(批號:BN27005,北京百瑞極生物科技有限公司);鐵螯合劑(DFO,批號:D9533,Sigma公司);MDA檢測試劑盒、GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);GSS(批號:sc-166882)和β-actin(批號:sc-47778)(美國Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.4 儀器SpectraMAX M2型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);LightCycler 96型實(shí)時熒光定量PCR(德國羅氏公司);DYY-6D電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司);C600多功能熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(Azure Biosystems公司);TUS-200P震蕩型恒溫金屬浴(上海恒科有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活性檢測將細(xì)胞培養(yǎng)在含89% DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10% FBS和1%的青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基中,放入含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。通過細(xì)胞活性檢測實(shí)驗研究華蟾素對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響。首先,將HepG2細(xì)胞(3.5 × 103個/孔)鋪于96孔板中,24 h后,吸出上清,將細(xì)胞與華蟾素藥液0、2、4、6、8 μg·mL-1單獨(dú)或者分別與DFO 50 μmol·L-1、GSH 5 mmol·L-1聯(lián)合處理48 h。之后,吸出上清,每孔加入100 μL 10% CCK-8工作液,將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱敷育1 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下進(jìn)行檢測。

1.5.2 細(xì)胞MDA含量檢測將肝癌細(xì)胞鋪于6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到90%時進(jìn)行藥物干預(yù),設(shè)置華蟾素濃度為0、8 μg·mL-1,培養(yǎng)24 h。細(xì)胞樣品處理方法:用胰蛋白酶消化后,加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)液吹打收集細(xì)胞,1 000×g 離心5 min。移除上清,將細(xì)胞用1 mL PBS清洗,再次離心5 min,移除上清,加入70 μL PBS。細(xì)胞樣品采用反復(fù)凍融的方法進(jìn)行裂解細(xì)胞,將其放入-80 ℃冷凍,10 min后取出冷凍的細(xì)胞放置于37 ℃金屬浴融化5 min。反復(fù)凍融4次后,收集上清。之后根據(jù)MDA檢測試劑盒說明書對細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測。MDA含量通過樣品的蛋白濃度歸一化,蛋白濃度由BCA蛋白測定試劑盒測定。

1.5.3 細(xì)胞內(nèi)GSH含量檢測將肝癌細(xì)胞鋪于6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到90%時進(jìn)行藥物干預(yù),設(shè)置華蟾素濃度為0、8 μg·mL-1,培養(yǎng)24 h。之后根據(jù)試劑盒說明書對細(xì)胞樣品進(jìn)行處理檢測。GSH含量通過細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行歸一化。

1.5.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定將肝癌細(xì)胞鋪于6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到90%時進(jìn)行藥物干預(yù),設(shè)置華蟾素濃度為0、8 μg·mL-1,培養(yǎng)24 h。之后收集細(xì)胞,懸浮于稀釋好的DCFH-DA(1∶1 000)中。放置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光敷育20 min,并每間隔5 min顛倒混勻一下,使探針與細(xì)胞充分接觸。敷育結(jié)束后,用無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。最后將細(xì)胞懸浮于200 μL PBS中,在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。采用FlowJo軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.5.5 實(shí)時熒光定量PCR (QRT-PCR)將肝癌細(xì)胞鋪于6 cm皿中,待密度達(dá)到85%時進(jìn)行藥物干預(yù),設(shè)置華蟾素藥物濃度為0、8 μg·mL-1,培養(yǎng)24 h。使用E.Z.N.A.?Total RNA Kit I (OMEGA) 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行總RNA抽提。使用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度。使用Takara PrimeScript RT Reagent Kit進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。以下引物用于QRT-PCR:

Human actin(Forward):5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′

Human actin (Reverse):5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′

Human GSS (Forward):5′-GTACTCACTGGATGTGGGTGAAGA-3′

Human GSS (Reverse):5′-CGGCTCGATCTTGTCCATCAG-3′

1.5.6 Western blotting肝癌細(xì)胞用不同濃度的華蟾素藥液(0、2、4、8 μg·mL-1)處理24 h。細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌兩次,加入細(xì)胞裂解液,充分裂解后收集細(xì)胞裂解物。在SDS-PAGE凝膠上分離細(xì)胞裂解物,之后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在4 ℃下用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉過夜。第2天,將膜與特異性一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜,將膜用TBST緩沖液洗滌40 min,然后與HRP偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜。最后,用TBST緩沖液洗滌40 min后,使用ECL超敏發(fā)光液檢進(jìn)行蛋白檢測,并通過凝膠圖像系統(tǒng)(Azure Biosystems C600,美國)顯示條帶。

1.5.7 siRNA轉(zhuǎn)染將肝癌細(xì)胞鋪于6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到50%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Lipofectamine 2000 5 μL與opti-MEM培養(yǎng)液250 μL混合在一起,用槍輕輕吹勻。將siRNA 10 μL加到opti-MEM培養(yǎng)液250 μL中,與加有Lipofectamine 2000的opti-MEM培養(yǎng)液混合在一起,室溫靜置20 min。之后將6孔板中的培養(yǎng)基棄掉,加入opti-MEM培養(yǎng)液1 500 μL,將含有Lipofectamine 2000的siRNA溶液500 μL,補(bǔ)齊至每孔2 mL體系,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中6 h后將上清替換為DMEM完全培養(yǎng)基。siRNA序列如下:

siNC(negative control,NC):5′-UUCUCCGA-ACGUGUCACGUTT-3′;

siGSS:5′-AGGAAATTGCTGTGGTTTA-3′。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析作圖采用GraphPad Prism 8。數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P<0.05表明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡前期通過研究發(fā)現(xiàn)華蟾素能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長[3]。為了研究華蟾素抑制肝癌細(xì)胞生長的形式,采用細(xì)胞鐵螯合劑DFO干預(yù)不同濃度華蟾素處理的細(xì)胞。結(jié)果顯示,DFO能夠部分逆轉(zhuǎn)華蟾素對人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制能力,HepG2細(xì)胞用不同濃度華蟾素藥液(0、2、4、6、8 μg·mL-1)或與DFO(50 μmol·L-1)聯(lián)合處理48 h,采用CCK-8檢測細(xì)胞活力,結(jié)果見圖1。由此可見,華蟾素能夠通過誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的形式抑制增殖。

圖1 華蟾素對肝癌細(xì)胞鐵死亡的影響

2.2 華蟾素能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞ROS和脂質(zhì)過氧化水平鐵死亡的直接表現(xiàn)是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS累積和脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[14]。因此,首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測人肝癌HepG2細(xì)胞經(jīng)過華蟾素處理后的ROS水平。用濃度為0、8 μg·mL-1的華蟾素藥液處理HepG2細(xì)胞48 h后,用DCFH-DA染色并通過流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞經(jīng)華蟾素處理后熒光強(qiáng)度增強(qiáng),說明華蟾素能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS(見圖2A)。為了進(jìn)一步研究華蟾素是否通過鐵死亡介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生損傷,通過檢測細(xì)胞內(nèi)MDA水平發(fā)現(xiàn),用華蟾素藥液(0、8 μg·mL-1)處理HepG2細(xì)胞24 h,檢測MDA水平與對照組相比,HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高(見圖2B),暗示細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞損傷的加重。

圖2 華蟾素對肝癌細(xì)胞活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的影響

2.3 華蟾素通過降低肝癌細(xì)胞GSH水平抑制細(xì)胞增殖前期文獻(xiàn)報道,GSH能夠避免細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷,更重要的是鐵死亡途中伴隨著GSH的損失,除了MDA檢測,鐵死亡的脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)還有GSH合成的變化[10,15]。細(xì)胞中存在多個對抗鐵死亡的防御途徑,其中最主要的一個是由GPX4所介導(dǎo)的,通過GSH特異性催化過氧化脂質(zhì)來抑制鐵死亡的發(fā)生[16]。用華蟾素藥液(0、8 μg·mL-1)處理HepG2細(xì)胞24 h,檢測GSH水平,相比空白對照組,華蟾素干預(yù)組GSH水平顯著降低(見圖3A)。為了進(jìn)一步探究華蟾素是否通過下調(diào)GSH水平抑制腫瘤細(xì)胞生長, HepG2細(xì)胞用不同濃度華蟾素藥液(0、2、4、6、8 μg·mL-1)或與GSH(5 mmol·L-1)聯(lián)合處理48 h,采用CCK-8檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示,GSH能夠部分逆轉(zhuǎn)華蟾素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用(見圖3B)。綜上,華蟾素可能通過降低肝癌細(xì)胞內(nèi)的GSH水平誘導(dǎo)鐵死亡從而表現(xiàn)出抑制肝癌生長的作用。

圖3 華蟾素對肝癌細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)含量的影響

2.4 華蟾素能夠抑制肝癌細(xì)胞GSS水平GSS能夠催化λ-谷氨酰半胱氨酸與甘氨酸反應(yīng)形成GSH[11]。我們首先檢測華蟾素對人肝癌HepG2細(xì)胞中的GSS水平的影響。用華蟾素藥液(0、8 μg·mL-1)處理HepG2細(xì)胞24 h,采用QRT-PCR檢測GSS的mRNA水平。如圖4A所示,與對照組相比,華蟾素干預(yù)后肝癌細(xì)胞GSS的mRNA水平降低,表明華蟾素干預(yù)導(dǎo)致GSS的轉(zhuǎn)錄抑制。此外, HepG2細(xì)胞采用0、2、4、8 μg·mL-1的華蟾素藥液處理24 h,通過Western blotting檢測GSS蛋白水平。華蟾素給藥干預(yù)后肝癌細(xì)胞中GSS蛋白表達(dá)減弱(見圖4B)。

圖4 華蟾素對肝癌細(xì)胞中谷胱甘肽合成酶(GSS)水平的影響

2.5 抑制肝癌細(xì)胞GSS水平能夠降低GSH產(chǎn)生接下來,我們研究在肝癌細(xì)胞中GSS是否影響GSH產(chǎn)生。用靶向GSS(siGSS)或陰性對照(siNC)的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞。通過Western blotting檢測敲低GSS后HepG2細(xì)胞GSS蛋白水平的變化。如圖5A所示,敲低GSS能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞GSS的蛋白表達(dá)。同時我們對HepG2細(xì)胞敲低GSS后其GSH含量進(jìn)行檢測,結(jié)果表明敲低GSS組與siNC組相比,細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低(見圖5B)。以上結(jié)果表明華蟾素可能通過抑制肝癌細(xì)胞GSS水平進(jìn)而抑制GSH的產(chǎn)生。

圖5 敲低GSS對肝癌細(xì)胞GSH含量的影響

2.6 華蟾素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡部分通過干預(yù)GSS實(shí)現(xiàn)我們進(jìn)一步研究華蟾素是否部分通過抑制GSS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡,HepG2細(xì)胞(轉(zhuǎn)染siNC或siGSS)用不同濃度華蟾素藥液(0、0.5、1、2 μg·mL-1)或與DFO(50 μmol·L-1)聯(lián)合處理48 h,采用CCK-8檢測細(xì)胞活力。如圖6A所示,敲低GSS會削弱DFO對華蟾素增殖抑制的逆轉(zhuǎn)作用。HepG2細(xì)胞(轉(zhuǎn)染siNC或siGSS)用不同濃度華蟾素藥液(0、0.5、1、2 μg·mL-1)處理48 h,采用CCK-8檢測細(xì)胞活力。如圖6B所示,敲低GSS在一定程度上能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長,并能夠增強(qiáng)華蟾素對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。上述結(jié)果表明華蟾素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡可能通過干預(yù)GSS水平來實(shí)現(xiàn)。

圖6 華蟾素部分通過抑制GSS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡

3 討論

目前,大多數(shù)肝癌患者確診時已為晚期,只有15%患者能夠手術(shù)治療。索拉非尼是FDA批準(zhǔn)唯一用于肝癌晚期治療的藥物[17],然而其具有較強(qiáng)的毒副作用,因此迫切需要開發(fā)新的抗肝癌藥物。在臨床中,中藥應(yīng)用于癌癥治療歷史悠久[18]。華蟾素作為中成藥已廣泛應(yīng)用于臨床治療肝癌、胃癌和胰腺癌等[19-20]。

鐵死亡是一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡方式。研究表明通過藥物誘導(dǎo)鐵死亡能夠抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[21],其發(fā)生的主要機(jī)制為多不飽和脂肪酸途徑誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致ROS累積最終造成細(xì)胞損傷[22]。MDA是脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物[23],是鐵死亡的標(biāo)志物。通過研究發(fā)現(xiàn)鐵螯合劑DFO能夠部分逆轉(zhuǎn)華蟾素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用,我們又進(jìn)一步檢測了鐵死亡標(biāo)志物ROS與MDA,結(jié)果顯示華蟾素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的累積,可見華蟾素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。GSH缺失可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[24]。研究表明抑制GSH能夠增加脂質(zhì)ROS含量,增強(qiáng)HCC對鐵死亡的敏感性,GSH合成的變化能夠反映鐵死亡的脂質(zhì)過氧化程度[25]。細(xì)胞中存在多個對抗鐵死亡的防御途徑,其中最主要的一個是由GPX4所介導(dǎo)的,通過GSH特異性催化過氧化脂質(zhì)來抑制鐵死亡的發(fā)生[9]。此外,研究證實(shí)Erastin能夠通過直接降低GSH水平,誘導(dǎo)缺乏GPX4的敏感細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[26]。因此,抑制GSH合成是誘導(dǎo)鐵死亡的主要方法。我們檢測華蟾素干預(yù)后肝癌細(xì)胞內(nèi)GSH含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)華蟾素干預(yù)后GSH水平降低,且GSH能夠減弱華蟾素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。因此,華蟾素可能通過抑制GSH誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生鐵死亡進(jìn)而表現(xiàn)出抑制肝癌細(xì)胞生長的作用。GSS是GSH生物合成的關(guān)鍵酶,研究表明GSS在腫瘤組織中呈現(xiàn)升高趨勢[13]。此外,有研究證實(shí)抑制GSS能夠降低肝癌細(xì)胞活性,且GSH能夠減弱由GSS抑制所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制作用[27]。通過研究發(fā)現(xiàn)華蟾素能夠抑制GSS水平,且敲低GSS能夠抑制GSH水平。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示敲低GSS能夠削弱DFO對華蟾素增殖抑制的逆轉(zhuǎn)作用,且敲低GSS能夠在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞生長,并增強(qiáng)華蟾素對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。綜上,我們認(rèn)為華蟾素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞鐵死亡可能是通過干預(yù)GSS來實(shí)現(xiàn)的。本研究有助于闡明華蟾素復(fù)雜的抗肝癌作用,為華蟾素應(yīng)用于肝癌臨床治療提供新的理論支持。