蔡樹蕓,駱春萍,許敏,何裊裊,黃雅瑜,林米妮,張怡評,,4

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建 福州 350108;2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發(fā)利用工程技術創(chuàng)新中心,福建 廈門 361005;3.廈門海洋職業(yè)技術學院海洋生物學院,福建 廈門 361100;4.福建省海島資源生態(tài)監(jiān)測與保護利用重點實驗室,福建 福州 350400)

銅藻(Sargassumhorneri),又名柱囊馬尾藻、草茜、海柳麥等,隸屬于褐藻門墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬,是馬尾藻屬中個體較大的可食用大型褐藻[1],通常長度可達2～7 m?！缎氯A本草綱要》中記載了福建民間以銅藻作中藥“海藻”藥用,其味咸、性寒,歸肺肝經(jīng)。它具有消痰軟堅、清熱利水的功效,可用于治療癭瘤、瘰疬、水腫、甲狀腺腫以及淋巴結腫等疾病[2]。銅藻主要分布于我國遼寧半島、山東半島、浙江、福建和廣東沿岸等[3]。近年來水溫升高且海洋富營養(yǎng)化,導致銅藻的產(chǎn)量增加[4]。銅藻富含多糖、多酚、巖藻黃質(zhì)、植物甾醇及蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)[5-7],具有良好的經(jīng)濟利用價值。銅藻巖藻多糖(fucoidan)是銅藻中主要的活性成分,其具有抗氧化、抗病毒、降血糖、抗凝血和降尿酸等多種藥理作用[8-14],在醫(yī)藥、保健食品、食品及飼料等領域應用廣泛[15-17]。目前,關于多糖的提取研究主要集中于傳統(tǒng)的熱水浸提,但提取效率較低,因此尋找合適的提取工藝具有重要意義。

勻漿提取法是加入溶劑利用勻漿機將組織進行粉碎或磨漿,使目標成分加快溶出的一種方法,該方法提取速度快、效率高且能耗低[18-20]。本實驗以銅藻為原材料,采用勻漿法提取銅藻巖藻多糖,在單因素試驗基礎上結合響應面優(yōu)化試驗(RSM)優(yōu)化巖藻多糖提取工藝,并對其抗氧化活性進行研究,為銅藻巖藻多糖的工業(yè)化生產(chǎn)以及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器DGG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);UH5300紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司);BCE124-1CCN電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司];DFT-200A粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司);電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司);Alpha-Pure15純水系統(tǒng)(精藝興業(yè)科技有限公司);H1650離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司);QC-901渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Multiskan SkyHigh全波長酶標儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 材料銅藻由福建遠揚藻業(yè)有限公司提供。將銅藻洗凈,除去泥沙和雜質(zhì),瀝干水分,烘干,粉碎過50目篩,備用。

L-巖藻糖(Fuc,批號:20180809,自然資源部第三海洋研究所);苯酚[生工生物工程(上海)股份有限公司];四硼酸鈉(索萊寶科技有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀[上海麥克林生化科技有限公司];濃硫酸、濃鹽酸、咔唑、抗壞血酸(VC)、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 銅藻巖藻多糖勻漿提取工藝優(yōu)化

2.1.1 銅藻巖藻多糖的提取取1.0 g銅藻粉末,加入適量的水,固定勻漿轉(zhuǎn)速,水浴提取一段時間后,冷卻,10 000 r·min-1離心5 min,棄沉淀,上清液過濾,將過濾液定容至相同體積。采用苯酚-硫酸法[21]測定巖藻多糖含量。

2.1.2 標準曲線繪制及多糖含量測定標準曲線繪制:精密稱取L-巖藻糖標準品5.0 mg于25 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,配成200 μg·mL-1L-巖藻糖標準品溶液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL L-巖藻糖標準品溶液于15 mL離心管中,加水補足至1.0 mL,依次加入5%苯酚1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,渦旋混勻后,30 ℃水浴靜置20 min。于490 nm處測定吸光度,以L-巖藻糖的濃度C(μg·mL-1)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線,得線性方程。

樣品溶液的制備:將定容后的上清液取100 μL,置于離心管中,加水補足至1.0 mL,加入5%苯酚1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,渦旋混勻后,30 ℃水浴靜置20 min。于490 nm處測定吸光度,根據(jù)公式(1)計算巖藻多糖提取率。

(1)

C:L-巖藻糖含量測定標準曲線對應的回歸方程計算所得的濃度值,μg·mL-1;V:上清液定容的體積,mL;N:稀釋倍數(shù);m:銅藻粉末質(zhì)量,g。

2.1.3 單因素試驗每次只變動一個條件,其他條件不變,考察因素提取時間(1、3、5、7、9 min)、液料比(20、30、40、50、60 mL·g-1)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取次數(shù)(1、2、3、4、5)對巖藻多糖提取率的影響。

2.1.4 響應面優(yōu)化設計在單因素試驗結果的基礎上,根據(jù)響應面Box-Behnken試驗設計原理,設定提取時間(A)、提取溫度(B)和液料比(C)這3個因素,以巖藻多糖的提取率為考察指標,對勻漿提取銅藻巖藻多糖的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

2.2 銅藻巖藻多糖樣品的制備采用優(yōu)化的最佳工藝提取銅藻巖藻多糖,加入無水乙醇使提取液乙醇濃度達到30%,靜置1 h,10 000 r·min-1離心5 min,棄沉淀除去褐藻膠,再繼續(xù)加入無水乙醇使?jié)舛冗_到80%,靜置24 h,10 000 r·min-1離心5 min,收集沉淀,用無水乙醇洗滌沉淀2次,真空干燥得巖藻多糖(WSHFuc)。

2.3 銅藻巖藻多糖主要成分分析

2.3.1 多糖含量檢測精密稱取5.0 mg巖藻多糖,配制成0.1 mg·mL-1的多糖溶液,取1.0 mL置于離心管中,加入5%苯酚1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,渦旋混勻后,30 ℃水浴反應20 min。于490 nm處測定吸光度,根據(jù)“2.1.2”項下方法得到的線性方程計算巖藻多糖的含量。

2.3.2 糖醛酸含量檢測采用咔唑-硫酸法[22]對多糖中糖醛酸含量進行測定。以半乳糖醛酸為標準品,分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的半乳糖醛酸標準溶液,用水補足至1.0 mL,冰水浴5 min;分別加入5.0 mL四硼酸鈉-濃硫酸溶液,渦旋混勻,沸水浴15 min,取出后置于冰水浴中冷卻;再分別加入0.2 mL 咔唑-無水乙醇溶液,渦旋混勻,沸水浴10 min,冰浴冷卻,于530 nm處測定吸光度值;以半乳糖醛酸標準溶液濃度為橫坐標,530 nm吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線。取樣品溶液1.0 mL代替標準液測吸光度值,根據(jù)標準曲線可計算樣品中糖醛酸含量。

2.3.3 巖藻糖含量檢測準確稱取巖藻多糖樣品10 mg于10 mL 試管中,加入2.0 mL水,再加入0.6 mL濃鹽酸,置于沸水浴中水解3 h,冷卻至室溫后用水定容至10 mL,采用離子色譜檢測[23]。

2.4 銅藻巖藻多糖體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除活性參考李德龍等[24]方法取不同質(zhì)量濃度的銅藻巖藻多糖溶液200 μL,加200 μL 0.05 mg·mL-1DPPH乙醇溶液,樣品對照用無水乙醇代替DPPH乙醇溶液,空白對照用同體積超純水代替多糖樣品,以VC作陽性對照,混勻后避光反應30 min,于517 nm處測吸光度,清除率按照公式(2)計算。

(2)

A0:空白對照吸光度;A1:反應后溶液的吸光度;A2:樣品對照的吸光度。

2.4.2 ABTS+自由基清除活性取相同體積的ABTS溶劑(7.0 mmol·L-1)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol·L-1)混勻,置于暗處避光12 h,備用。于734 nm處將工作液的吸光值用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋調(diào)整為0.7±0.02。分別吸取100 μL不同濃度多糖溶液與1 mL ABTS+工作液混勻,室溫避光靜置10 min,測定734 nm處的吸光值[25],清除率按照公式(3)計算。

(3)

A0:用超純水代替多糖溶液的吸光度;A1:反應后溶液的吸光度;A2:樣品對照的吸光度。

2.4.3 羥自由基清除活性參考于靚等[26]的方法分別取200 μL不同濃度的多糖溶液,加入6.0 mmol·L-1硫酸亞鐵、6.0 mmol·L-1水楊酸乙醇溶液和6.0 mmol·L-1過氧化氫溶液各200 μL,加水定容至2 mL混合均勻,37 ℃水浴30 min,冷卻至室溫后在510 nm測定吸光度,樣品對照組用蒸餾水代替過氧化氫溶液,空白組用蒸餾水代替樣品,以VC作陽性對照,清除率按照公式(4)計算。

(4)

A0:空白組用超純水代替多糖溶液的吸光度;A1:反應后溶液的吸光度;A2:樣品對照用超純水代替過氧化氫溶液的吸光度。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 提取時間對銅藻巖藻多糖的影響在水浴溫度為60 ℃,液料比30 mL·g-1,提取次數(shù)為1次條件下,研究提取時間1、3、5、7、9 min對巖藻多糖提取率的影響。結果顯示,隨著勻漿時間的延長,巖藻多糖提取率逐漸增加,在5 min時達最高,隨后開始下降,其原因可能是勻漿時間過長,其他成分也一并溶出,導致巖藻多糖提取率降低。因此,選擇5 min為最佳勻漿時間。

3.1.2 提取溫度對銅藻巖藻多糖的影響在提取時間為5 min,液料比30 mL·g-1,提取次數(shù)為1次條件下,研究提取溫度60、70、80、90、100 ℃對巖藻多糖提取率的影響。結果顯示,隨著提取溫度的升高,巖藻多糖提取率逐漸增加,在90 ℃時達最高,隨后開始下降,其原因可能是過高的熱效應會造成部分多糖分解,導致巖藻多糖提取率降低。因此,選擇90 ℃為最佳提取溫度。

3.1.3 液料比對銅藻巖藻多糖的影響在提取時間為5 min,提取溫度為90 ℃,提取次數(shù)為1次條件下,研究液料比20、30、40、50、60 mL·g-1對巖藻多糖提取率的影響。結果顯示,隨著液料比的增加,巖藻多糖提取率逐漸增加,在30 mL·g-1時達最高,當溶劑用量繼續(xù)增加時,提取率反而下降,其原因可能是其他物質(zhì)溶出,抑制了多糖的溶出,導致巖藻多糖提取率降低。因此,選擇30 mL·g-1為最佳液料比。

3.1.4 提取次數(shù)對銅藻巖藻多糖的影響在提取時間為5 min,提取溫度為90 ℃,液料比30 mL·g-1條件下,研究提取次數(shù)1、2、3、4、5次對巖藻多糖提取率的影響。結果顯示,隨著勻漿提取次數(shù)增多,多糖溶出量越多,但提取次數(shù)不斷增加,不利于后續(xù)的濃縮分離,增加生產(chǎn)成本。因此,確定勻漿提取次數(shù)為2次。

3.2 響應面優(yōu)化試驗

3.2.1 巖藻多糖提取因素水平根據(jù)上述單因素試驗結果,選取提取時間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)3個因素,以巖藻多糖提取率作為響應值指標,在Design Expert 12軟件中設計3因素3水平響應面優(yōu)化試驗,如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表

3.2.2 響應面試驗結果每個因素各3個水平,共17個試驗點,按照得到的試驗條件對銅藻進行提取,并利用軟件 Design Expert 12對數(shù)據(jù)進行回歸分析,結果如表2所示。

表2 響應面試驗方案及結果

采用多元線性回歸擬合銅藻巖藻多糖提取的響應值,得到了提取時間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)和多糖提取率的二次多項式回歸方程為:Y=13.82+0.673 7A+1.11B+0.462 0C-0.241 8AB+0.094 5AC+0.061 3BC-0.721 5A2-1.15B2-0.675 1C2。

顯著性系數(shù)和結果方差分析的結果如表3所示,可以看出模型P<0.01,說明該模型極顯著,具有可靠性。失擬項P>0.05,說明模型有較好的擬合度,實際值與預測值相差不大,具有較高的可信度。相關系數(shù)R2=0.990 6,進一步表明試驗值與模型預測值擬合度高。根據(jù)F值可得,這3個因素中,各因素對巖藻多糖提取率的影響為:提取溫度(B)=提取時間(A)>液料比(C),說明提取時間和提取溫度對多糖的提取影響極顯著,液料比對其提取率的影響相對較小。因素A和因素B的交互作用對結果影響最大。

表3 響應面結果方差分析表

采用軟件Design Expert 12繪制了響應面3D圖和等高線圖,更直觀的反映試驗結果并對其進行分析,研究各因素之間的交互作用對因變量(巖藻多糖提取率)的影響,如圖1～3所示。

圖1 提取時間與提取溫度相互作用對巖藻多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

各因素兩兩交互作用的顯著性可以通過觀察響應面圖曲線的陡峭程度看出來,響應面的曲線越陡峭,說明顯著性約大。由圖可知,交互項對WSHFuc提取率的影響大小為:AB>AC>BC,其中AB交互項的影響顯著。由圖1可知提取溫度的陡峭程度比提取時間的陡峭程度大,說明提取溫度對巖藻多糖提取率的影響大于提取時間。圖2中提取時間和液料比陡峭程度相差不多,說明兩者對巖藻多糖提取率的影響區(qū)別不是很大。圖3中提取溫度比液料比的陡峭程度大,說明提取溫度對巖藻多糖提取率的影響大于液料比。

圖2 提取時間與液料比相互作用對巖藻多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

圖3 提取溫度與液料比相互作用對巖藻多糖提取率影響的響應面圖和等高線圖

3.2.3 最佳工藝的預測和驗證通過軟件Design Expert 12預測得到最佳工藝為:提取時間為5.833 min,提取溫度94.463 ℃,液料比為33.897 mL·g-1,該條件下模型預測的最高多糖提取率為14.303%。考慮到實驗條件,將提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取時間為6 min,提取溫度94 ℃,液料比為34 mL·g-1,提取次數(shù)2次,該條件下對銅藻進行提取,實際測得巖藻多糖的平均提取為14.76%,RSD<5%,與預測值相差不大。因此,本次試驗基于響應曲面法所得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠,具有實用價值。

3.3 銅藻巖藻多糖主要成分不同的提取方法會影響多糖的組成成分,勻漿法提取的銅藻巖藻多糖中多糖含量為77.45%,糖醛酸含量為19.18%,巖藻糖含量為7.57%。

3.4 體外抗氧化活性研究

3.4.1 DPPH自由基清除活性結果表明,在0.2～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),WSHFuc具有良好的DPPH清除活性,與多糖濃度呈正相關,其IC50值為0.22 mg·mL-1,雖然多糖的清除能力低于VC,但巖藻多糖有較好的DPPH自由基清除活性。

3.4.2 ABTS+自由基清除活性在0.2～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),WSHFuc對ABTS+的清除率隨著濃度的增加而升高,其IC50值為0.41 mg·mL-1,雖然巖藻多糖對ABTS+的清除能力低于VC,但巖藻多糖仍有較好的ABTS+自由基清除活性。

3.4.3 ·OH清除活性在0.5～2.5 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),WSHFuc對·OH的清除率隨著濃度的增加而升高,巖藻多糖對·OH有一定的清除活性,但清除能力低于VC。

4 討論與結論

巖藻多糖是一種天然多糖混合物,其化學結構復雜,主要成分包括L-巖藻糖和硫酸基團,還存在少量蛋白質(zhì)及糖醛酸等[27]。勻漿可以使物料的粒徑減小,使多糖加快溶出,與傳統(tǒng)的熱水浸提相比,大大縮短提取時間。本研究以銅藻為研究對象,在單因素基礎上,采用響應面設計優(yōu)化勻漿輔助銅藻巖藻多糖的提取工藝,探究提取時間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)對銅藻巖藻多糖提取率的影響。結果表明,影響巖藻多糖提取率的因素的順序為:提取溫度(B)=提取時間(A)>液料比(C),得到多糖的最佳提取條件為:為提取時間為6 min,提取溫度94 ℃,液料比為34 mL·g-1,提取次數(shù)2次,巖藻多糖的提取率為14.76%,該工藝可以提高銅藻多糖的提取率。

代謝過程中會產(chǎn)生各種氧自由基,H2O2和·OH基等活性氧會對細胞和組織造成損傷,導致衰老或者疾病的發(fā)生,清除自由基可以預防氧化的加劇。有研究表明巖藻多糖有著良好的抗氧化活性,為天然抗氧化劑[28-30]。Lou等[31]從馬尾藻中分離純化出一種新型的多糖STSP-I,具有較強清除自由基的作用。本文研究銅藻巖藻多糖對DPPH、ABTS+、·OH的清除率,實驗結果表明在多糖濃度達到1.0 mg·mL-1時,巖藻多糖對DPPH、ABTS+自由基的清除率與VC接近,說明其具有良好抗氧化活性,為銅藻巖藻多糖進一步研究和應用提供參考依據(jù)。