楊曉玲,曾憲威,陳 塵,陳嘉俊,許業(yè)棟,唐麗艷

(深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 深圳 518105)

乳腺癌屬于婦科較為常見的惡性腫瘤之一,其作為一種血管依賴性疾病,血管生成在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。盡管目前臨床上已有不少抗細(xì)胞增殖藥物可以促使腫瘤細(xì)胞凋亡,然而因受周圍血管支持,殘留的腫瘤細(xì)胞仍可獲得充足的血供,進(jìn)一步持續(xù)生長(zhǎng)、繁殖[2]。此外,異常腫瘤血管會(huì)導(dǎo)致藥物朝腫瘤組織內(nèi)部的遞送明顯減少,進(jìn)而導(dǎo)致抗細(xì)胞增殖的效果大打折扣。因此,尋求一種全新的腫瘤藥物治療方案顯得尤為重要,且目標(biāo)不應(yīng)單獨(dú)針對(duì)腫瘤細(xì)胞,而是要重視腫瘤微環(huán)境,特別是要注意腫瘤血管生成的作用[3]。隨著近年來(lái)有關(guān)研究的日益深入,不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNAs)可通過調(diào)控相關(guān)靶基因表達(dá),從而在多種細(xì)胞行為中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。miR-26a屬于miRNAs家族重要成員之一,其在多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá),介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[5]。然而,miR-26a抑制乳腺癌血管生成的具體分子機(jī)制不清楚。本研究率先提出“miR-26a通過負(fù)調(diào)HGF/c-Met信號(hào)通路,抑制VEGF,從而抑制乳腺癌血管生成”的假說和原創(chuàng)性理論,相關(guān)研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過研究miR-26a通過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(c-Met)通路調(diào)控乳腺癌血管生成及分子機(jī)制,以期為臨床乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)與方向。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2021年1月～2022年3月深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院收治的40例乳腺癌患者。年齡33～79歲,平均(57.72±4.67)歲;體重指數(shù)(BMI)18～32 kg/m2,平均(23.55±1.78)kg/m2;臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期18例,Ⅲ～Ⅳ期22例;分化程度:低分化15例,中分化17例,高分化8例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。入組標(biāo)準(zhǔn):①所有入選對(duì)象均經(jīng)手術(shù)病理檢查確診為乳腺癌;②入組前尚未接受任何抗腫瘤治療;③均為成年女性;④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤;②神志異常;③正處于其他研究過程中。入組人員均已簽署知情同意書,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法:①人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將細(xì)胞株接種到含有10%胎牛血清以及100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗 RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)。隨后將其放置在37℃、5%二氧化碳濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代處理,2～3 d傳代1次。②采集所有受試者的乳腺癌組織以及癌旁正常組織,將前者作為觀察組,后者作為對(duì)照組。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染:通過LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法將miR-26a模擬物以及抑制物分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中,記作miR-26a轉(zhuǎn)染組、miR-26a抑制組,并將未進(jìn)行任何處理的乳腺癌細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。④實(shí)時(shí)熒光定量PCR:以Trizol法提取細(xì)胞總RNA,以凝膠電泳法檢測(cè)RNA相對(duì)分子質(zhì)量,借助分光光度計(jì)完成RNA濃度的檢測(cè)。借助mirpremier miRNA分離試劑盒完成miRNA的分離,并遵循Super Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。之后按照PCR試劑盒說明書完成熒光定量PCR檢測(cè)。之后按照美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)資料完成PCR引物的設(shè)計(jì)。嚴(yán)格遵循熒光定量PCR儀說明書進(jìn)行基線的調(diào)整,設(shè)定閾值處于熒光值對(duì)數(shù)圖線性部分,并從軟件中進(jìn)行Ct值讀取。以β-actin為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt法完成目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。檢測(cè)涵蓋下述幾項(xiàng):①miR-26a;②血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA);③HGF;④p-c-Met/c-MET;⑤下游靶基因磷脂酰肌醇激酶3(PI3K);⑥蛋白酶B(AKT);⑦雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。

1.3觀察指標(biāo):比較不同乳腺組織miR-26a、VEGFA以及微血管密度(MVD)表達(dá),各組乳腺癌細(xì)胞中HGF/c-Met通路相關(guān)蛋白表達(dá)以及PI3K/AKT/mTOR表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:以SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1不同乳腺組織miR-26a、VEGFA以及MVD表達(dá)比較:乳腺癌組織中miR-26a相對(duì)表達(dá)量為0.47±0.08,相較于癌旁正常組織的1.02±0.17更低,而VEGFA相對(duì)表達(dá)量與MVD分別為1.04±0.25、14.68±2.91,相較于癌旁正常組織的0.68±0.11、7.85±1.05更高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.514、8.336、14.009,P<0.05)。

2.2各組乳腺癌細(xì)胞中HGF/c-Met通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較:miR-26a抑制組HGF、p-c-Met/c-MET表達(dá)水平分別0.92±0.12、0.67±0.06,相較于陰性對(duì)照組的0.62±0.08、0.37±0.04以及miR-26a轉(zhuǎn)染組的0.30±0.04、0.18±0.02均更高,而miR-26a轉(zhuǎn)染組HGF、p-c-Met/c-MET表達(dá)水平相較于陰性對(duì)照組更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.478、15.691,P<0.05)。

2.3各組乳腺癌細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)比較:miR-26a抑制組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于陰性對(duì)照組及miR-26a轉(zhuǎn)染組更高,而miR-26a轉(zhuǎn)染組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于陰性對(duì)照組更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組乳腺癌細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)比較

3 討論

迄今為止,關(guān)于乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制尚存在一定的爭(zhēng)議,目前普遍認(rèn)為可能與遺傳、生活方式等密切相關(guān)[6]。由于該病發(fā)病早期具有極強(qiáng)的隱匿性,從而導(dǎo)致絕大部分患者首次確診便喪失了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī),從而導(dǎo)致預(yù)后不良[7-8]。因此,尋找一種可早期診斷以及靶向基因治療新靶點(diǎn)具有極其重要的意義。研究者通過前期研究發(fā)現(xiàn):miR-26a在乳腺癌組織中表達(dá)降低,且VEGF與腫瘤血管生成關(guān)系密切,而miR-26a可能參與乳腺癌血管生長(zhǎng)的調(diào)控。此外,miR-26a可能通過負(fù)調(diào)HGF/c-Met信號(hào)通路,抑制VEGF,從而抑制乳腺癌血管生成[9-10]。

本研究提示了miR-26a在乳腺癌中存在異常高表達(dá),而VEGFA異常低表達(dá),且MVD較低。分析原因,miR-26a可能通過靶向多種癌基因介導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡以及侵襲等多種細(xì)胞功能,進(jìn)一步抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。VEGFA參與了血管生成以及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)等過程,促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)腫瘤血管形成,為乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展提供了重要基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)依靠從周圍細(xì)胞間質(zhì)中汲取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在病灶直徑超過一定界限后,其中心部分細(xì)胞生長(zhǎng)以及增殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)則由血管提供,否則會(huì)出現(xiàn)缺氧以及壞死,因此,腫瘤組織中往往存在較高的MVD[11-12]。本研究反映了miR-26a對(duì)乳腺癌細(xì)胞中HGF/c-Met通路具有一定的負(fù)向調(diào)控作用。其中HGF主要是由間質(zhì)細(xì)胞分泌而來(lái)的一種多功能生長(zhǎng)因子,其主要成分包括兩個(gè)亞基,其本質(zhì)為含有728個(gè)氨基酸的肝素結(jié)合糖蛋白。c-Met主要是由原癌基因Mte所編碼的一種蛋白,而HGF為其唯一天然配體,屬于受體酪氨酸激酶家族重要成員之一[13-14]。兩者特異性結(jié)合會(huì)促進(jìn)酪氨酸激酶活性的增強(qiáng),進(jìn)而發(fā)揮誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及血管生成的作用,在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲等過程中扮演著至關(guān)重要的作用。由此推測(cè),miR-26a作為乳腺癌的抑癌基因,其發(fā)揮抑癌的作用機(jī)制可能與調(diào)控HGF/c-Met通路有關(guān)。另外,miR-26a抑制組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于陰性對(duì)照組以及miR-26a轉(zhuǎn)染組更高,而miR-26a轉(zhuǎn)染組PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于陰性對(duì)照組更低。證實(shí)了miR-26a可能對(duì)乳腺癌細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路亦有負(fù)向調(diào)控作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在抑制細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,當(dāng)該信號(hào)通路異常激活,會(huì)引起相關(guān)下游信號(hào)分子出現(xiàn)異常活化,進(jìn)而刺激腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲以及轉(zhuǎn)移。目前,國(guó)內(nèi)外已有不少研究報(bào)道證實(shí),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色[15-16]。由此可見,miR-26a的抑癌機(jī)制可能通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明,有待進(jìn)一步研究證實(shí),為今后的研究提供了方向。

綜上,miR-26a可能通過調(diào)控HGF/c-Met通路以及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,進(jìn)一步發(fā)揮抑癌基因的作用。