傅燕紅,廖小文,潘丁龍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤放射治療科,福建 泉州 362000)

放射治療是惡性腫瘤重要的治療手段之一,特別在胸部腫瘤的全程治療中發(fā)揮著不可或缺的作用。然而,胸部放療引起的放射性肺炎是放療劑量限制的主要因素。據(jù)報(bào)道[1],肺癌行胸部放療后,放射性肺炎的發(fā)生率高達(dá)15%～40%,嚴(yán)重影響了治療效果及患者的生活質(zhì)量。目前,放射性肺炎主要采用激素進(jìn)行抗炎治療,但是激素的使用不僅具有免疫抑制作用,還有發(fā)生二重感染的風(fēng)險(xiǎn),甚至因治療中斷導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展。因此,在臨床上尋找高效、低毒的有效藥物顯得尤為重要。中醫(yī)藥是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),在某些疾病特別是慢性病的治療中發(fā)揮著重要的作用,與西藥相比,更具高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn),但因中醫(yī)藥理論自成一體,且中藥成分復(fù)雜,其對(duì)于疾病的治療的分子機(jī)制不清,因此,運(yùn)用細(xì)胞及分子層面水平對(duì)中藥的作用機(jī)制進(jìn)行闡述具有重要的意義。銀花甘草湯收載于《醫(yī)學(xué)心悟》,主要由金銀花和甘草兩味中藥組成,其具有清熱解毒的功效,兼具低毒、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。中醫(yī)理論認(rèn)為,放射線屬“火熱毒邪”,基于中醫(yī)理論及少量的文獻(xiàn)報(bào)道[2],認(rèn)為銀花甘草湯在治療放射性肺炎方面具有一定療效。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,獲取金銀花、甘草對(duì)治療放射性肺炎的主要成分及相應(yīng)的作用靶點(diǎn),構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,并挖掘可能參與的生物學(xué)功能及作用的相關(guān)通路,從分子層面對(duì)其治療放射性肺炎的機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 材料與方法

1.1中藥化學(xué)成分的收集篩選:利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索金銀花、甘草的主要化學(xué)成分,以口服利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件,篩選出具有較高生物利用度及類藥性的化合物分子,并收集其相應(yīng)的作用蛋白靶點(diǎn),結(jié)合Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白靶點(diǎn)Gene Symbol的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2中藥成分作用靶點(diǎn)的收集篩選:將篩選出的化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行作用靶點(diǎn)的收集,并將收集到的靶點(diǎn)蛋白在Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,得到靶點(diǎn)蛋白相對(duì)應(yīng)的Gene Symbol名稱。

1.3放射性肺炎靶點(diǎn)的檢索:以“Radiation Pneumonitis”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行放射性肺炎疾病靶點(diǎn)的檢索,并收集Gene Symbol數(shù)據(jù)。進(jìn)而將疾病靶點(diǎn)與中藥活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射,得到銀花甘草湯治療放射性肺炎的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4活性成分-藥物靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:將篩選得到的中藥活性成分和映射得到的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建,利用cytoHubba插件對(duì)構(gòu)建好的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重要節(jié)點(diǎn)成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選,并繪制核心活性成分-藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5靶基因基因本體論(Go)富集和京都基因與基因百科全書(shū)(KEGG)通路分析:將篩選得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)在Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Go生物學(xué)過(guò)程分析和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1銀花甘草湯化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果:以“金銀花”“甘草”分別為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其化學(xué)成分,共檢索到516個(gè)化合物,其中金銀花236個(gè)、甘草280個(gè)。根據(jù)設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn),共得到115個(gè)具有良好ADME(吸收、分布、代謝、排泄)性質(zhì)的活性化合物,其中金銀花23個(gè)、甘草92個(gè)。將篩選得到的23個(gè)金銀花、92個(gè)甘草活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白靶點(diǎn)收集,共收集到483個(gè)金銀花作用蛋白靶點(diǎn)、1 773個(gè)甘草作用蛋白靶點(diǎn),篩選去重后得到221個(gè)金銀花蛋白靶點(diǎn)、239個(gè)甘草蛋白靶點(diǎn)。將去重后得到的蛋白靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Gene Symbol標(biāo)準(zhǔn)處理,共得到362個(gè),其中175個(gè)金銀花、187個(gè)甘草的基因名稱。見(jiàn)表1(OB值前10位的金銀花、甘草成分)。

表1 銀花甘草湯活性成分

2.2疾病靶點(diǎn)檢索結(jié)果:在GeenCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Radiation Pneumonitis”為關(guān)鍵詞共檢索到559個(gè)放射性肺炎的相關(guān)靶點(diǎn)見(jiàn)表2(相關(guān)度得分排名前10位靶點(diǎn)蛋白)。

表2 放射性肺炎相關(guān)靶點(diǎn)

2.3有效成分-疾病靶點(diǎn)映射結(jié)果:將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的金銀花、甘草作用靶點(diǎn)與放射性肺炎相關(guān)靶點(diǎn)采用韋恩圖進(jìn)行映射,共得到PPARD、MMP2、HSPB1、HMOX1、NOS2等59個(gè)交集靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)映射圖

2.4成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:根據(jù)篩選得到的362個(gè)活性成分和韋恩圖篩選得到的59個(gè)作用靶點(diǎn),利用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)圖包括155個(gè)節(jié)點(diǎn),495條邊。利用cytoHubba插件進(jìn)行重要節(jié)點(diǎn)篩選,繪制核心成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,共得到PTGS2、NOS2、AKT1、PRARG、MAPK14等5個(gè)核心作用靶點(diǎn),得到MOL000422(山萘酚)、MOL000006(木樨草素)、MOL002773(β-胡蘿卜素)、MOL000098(槲皮素)、MOL004805{(2S)-2-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-8,8-dimethyl-2,3-dihydropyrano[2,3-f]chromen-4-one}、MOL000417(鈣黏蛋白)、MOL000392(刺芒柄花素)、MOL003896(7-甲氧基-2-甲基異黃酮)、MOL003656(黃羽扇豆魏特酮)、MOL000354(異鼠李素)、MOL000497(甘草查爾酮A)、MOL004328(柚皮苷)、MOL002311(甘醇)等13個(gè)重要中藥活性成分。見(jiàn)圖2。

圖2 核心成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5GO和KEGG富集結(jié)果:將篩選得到的5個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入Enrichr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG通路富集分析。GO分析共富集到MAP激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、絲裂原活化蛋白激酶結(jié)合、氧化還原酶活性、磷酸二苯酯-3,4-雙磷酸二苯酯等13條P<0.05的生物學(xué)過(guò)程。見(jiàn)表3。KEGG分析共富集到VEGF信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、C型凝集素受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、脂肪溶解的調(diào)控、松弛素信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等61條P<0.01的相關(guān)通路。見(jiàn)表4(僅列出前20)。

表3 GO富集結(jié)果

表4 KEGG富集結(jié)果

3 討論

胸部放療不可避免的會(huì)對(duì)正常肺組織產(chǎn)生影響,放射性肺炎是其常見(jiàn)的早期并發(fā)癥,治療主要以激素為主,常缺乏特異性治療手段,若不能及時(shí)有效控制甚至有可能出現(xiàn)呼吸衰竭危及生命,部分長(zhǎng)期存活的腫瘤患者晚期出現(xiàn)肺纖維化嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,利用中藥數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出銀花甘草湯的有效成分,結(jié)合疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行作用靶點(diǎn)篩選,并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,繼而對(duì)其生物學(xué)功能及參與的信號(hào)通路進(jìn)行挖掘,對(duì)銀花甘草湯治療放射性肺炎提供分子層面的理論支撐。

本研究對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的銀花甘草湯有效成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),山萘酚、木樨草素、β-胡蘿卜素、槲皮素、鈣黏蛋白、刺芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等13個(gè)化合物是作用于放射性肺炎靶點(diǎn)重要的有效成分。山奈酚屬于黃酮類化合物,已有研究表明,山奈酚可以抑制NO和前列腺素E2的釋放,降低c-Jun和c-fos的轉(zhuǎn)錄活性,并抑制Src、syk、IRAK1和IRAK4等靶標(biāo)分子的激活,從而起到抗炎活性,同時(shí)具有抗氧化和抗癌的作用[3-5]。王靜[6]研究發(fā)現(xiàn),山奈酚可以清除放射線輻射產(chǎn)生的活性氧(ROS)和一氧化氮(NO),降低丙二醛(MDA)水平,增加超氧化物歧化酶(SOD)水平,對(duì)減少輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)揮防護(hù)作用。白細(xì)胞介素(IL)-31和IL-33是許多炎性反應(yīng)和病理疾病中表達(dá)的細(xì)胞因子,在炎性反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。研究表明,木犀草素可從mRNA和蛋白水平抑制IL-33刺激的HMC-1.2細(xì)胞中IL-31的表達(dá),木犀草素還抑制IL-33刺激的HMC-1.2細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-31的分泌。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,木犀草素能抑制IL-33刺激的HMC.1.2細(xì)胞中ERK、JNK、p38和NF-κBp65的活化[7]。此外,木犀草素還阻止了p65的核轉(zhuǎn)位和與其DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合?；谏鲜鼋Y(jié)果,木犀草素被認(rèn)為可能是一種潛在的用于預(yù)防或治療與IL-31和IL-33相關(guān)的疾病。β胡蘿卜素是最豐富的類胡蘿卜素,具有潛在的抗炎作用。最新研究表明,β-胡蘿卜素通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞中的NF-κB,JAK2/STAT3和JNK/p38 MAPK信號(hào)通路來(lái)減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[8]。槲皮素最主要的效應(yīng)是具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的作用[9]。體外研究表明,槲皮素主要通過(guò)降低IL-1、IL-6、IL-10的表達(dá)量從而起到到抗炎的作用[10]。另外,槲皮素在脂肪細(xì)胞中也具有抗炎的作用,其機(jī)制主要與其通過(guò)AMPK/Sirt1途徑對(duì)IL-12和一氧化氮酶(iNOS)的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)有關(guān)[11]。以上研究結(jié)果均表明,銀花甘草湯中的主要化學(xué)成分具有一定的抗炎作用。

本研究通過(guò)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析分析發(fā)現(xiàn)銀花甘草湯中的主要成分參與了MAP激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、絲裂原活化蛋白激酶結(jié)合、氧化還原酶活性、磷酸二苯酯-3,4-雙磷酸二苯酯等13個(gè)生物學(xué)過(guò)程,與放射性肺炎的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示相關(guān)靶點(diǎn)主要參與了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、C型凝集素受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、脂肪溶解的調(diào)控、松弛素信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等61條信號(hào)通路從而起到治療放射性肺炎的作用。VEGF是一種特異性的促VEGF,具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性等作用,阿昔替尼(AG-013736)是一類具有選擇性靶向VEGF信號(hào)通路的小分子受體酪氨酸激酶抑制劑,Hillman等[12]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肺癌模型中其與放療的結(jié)合具有減少肺炎、血管損傷及肺纖維化發(fā)生的作用。放射性肺腫瘤壞死因子α的產(chǎn)生與早期細(xì)胞凋亡和潛在肺功能損害有關(guān),抑制肺TNFR1對(duì)肺有選擇性地放射保護(hù)作用,而不影響腫瘤的反應(yīng),這些發(fā)現(xiàn)支持了利用抑制腫瘤壞死因子-α途徑開(kāi)發(fā)新的放射防護(hù)策略[13],提示腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)信號(hào)通路參與放射防護(hù)過(guò)程。IL17A是IL17家族中重要成員之一,郭雷鳴等[14]通過(guò)檢測(cè)肺癌患者放療前后血清IL-17A水平的變化情況發(fā)現(xiàn)放療后放射性肺炎組與非放射性肺炎組血清中IL-17A水平存在明顯差異,相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17A升高與放射性肺炎的發(fā)生呈正相關(guān),提示IL-17A可能是較好的預(yù)測(cè)放射性肺炎的細(xì)胞因子,因此猜測(cè)IL17信號(hào)通路可能參與放射性肺炎的發(fā)生。綜上所述,銀花甘草湯中主要有效成分通過(guò)其核心靶點(diǎn)依靠VEGF信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎、放射防護(hù)的作用。

本研究采用新興的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對(duì)銀花甘草湯治療放射性肺炎的有效成分、活性靶點(diǎn)和可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的預(yù)測(cè)與探討,為后續(xù)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供一定的理論支持。但是以上研究?jī)H依靠生物信息學(xué)、相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘及部分文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持,可能存在偏差,具有一定的局限性,對(duì)于銀花甘草湯治療放射性肺炎的作用機(jī)制及臨床推廣仍需進(jìn)一步研究探討。