李蒙 劉用 張健真 郝學(xué)增 張立晶

摘要? 目的：觀察麝香通心滴丸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注（I/R）損傷后心肌細(xì)胞和血管的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。方法：將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、I/R組、麝香通心滴丸組（SXTX組）和陽(yáng)性組，每組15只。SXTX組以18.90 mg/（kg·d）的濃度灌胃；陽(yáng)性組以尼可地爾1.35 mg/（kg·d）的濃度灌胃；Sham組和I/R組給予等體積去離子水灌胃。各組均灌胃1周后，行冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎-松解手術(shù)，除Sham組外其余各組大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min后，再灌注120 min，構(gòu)建心肌I/R模型。通過(guò)心肌蘇木精-伊紅（HE）染色、心肌Masson染色觀察大鼠心肌組織及血管改變；電鏡觀察心肌細(xì)胞和血管的超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組織化學(xué)法觀察血管相關(guān)蛋白低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)情況。結(jié)果：與Sham組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞壞死和血管損傷明顯，心肌組織中HIF-1α表達(dá)增加；與I/R 組相比，SXTX組心肌細(xì)胞和血管病理結(jié)構(gòu)損傷減輕，缺血區(qū)心肌組織VEGF含量明顯增加。結(jié)論：麝香通心滴丸預(yù)處理可保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞和血管I/R損傷，可能與上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)、促進(jìn)缺血區(qū)微血管新生有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 缺血/再灌注損傷；麝香通心滴丸；保護(hù)作用；低氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.008

Protective Effect? of Shexiang Tongxin Dropping Pill Pretreatment on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LI Meng， LIU Yong， ZHANG Jianzhen， HAO Xuezeng， ZHANG Lijing

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

Corresponding Author? ZHANG Lijing， E-mail： dzmyyccu@163.com

Abstract? Objective：To observe the protective effect? of Shexiang Tongxin Dropping Pills on myocardial cells and blood vessels after myocardial ischemia-reperfusion（I/R） injury in rats.Methods：Sixty male SD rats were randomly divided into sham operation group（Sham group），I/R group，Shexiang Tongxin Dropping Pills group（SXTX group），and positive control group，with 15 rats in each group.The rats in SXTX group were given SXTX 18.90 mg/（kg·d） by gavage，and the rats in positive control group were given nicorandil 1.35 mg/（kg·d） by gavage.The rat in Sham group and I/R group were given the same volume of deionized water by gavage.After one week of gavage，the rats left anterior descending coronary artery was ligated for 30 min and then reperfused for 120 min to build the myocardial I/R model except for the Sham group.The changes of myocardial tissue and blood vessels in rats were observed by myocardial hematoxylin-eosin（HE） staining and myocardial Masson staining.The ultrastructural changes of cardiomyocytes and blood vessels were observed by electron microscope.The expressions of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α） and vascular endothelial growth factor（VEGF） were observed by immunohistochemistry.Results： Compared with Sham group，the myocardial cell necrosis and vascular injury of the rats in I/R group were obvious，and the expression of HIF-1α in the myocardial tissue? increased.Compared with I/R group，the myocardial cell and vascular pathological structural damage in SXTX group? alleviated，and the protein expressions of VEGF in the ischemic area? significantly increased.Conclusion：Shexiang Tongxin Dropping Pills pretreatment can protect myocardial cells and vascular I/R injury in rats，which may be related to the up-regulation expression of VEGF protein and the promotion of microangiogenesis in ischemic areas.

Keywords? ???ischemia/reperfusion injury; Shexiang Tongxin Dropping Pills; protective effect; hypoxia-inducible factor-1α; vascular endothelial growth factor; experimental study

基金項(xiàng)目? 2021年度北京中醫(yī)藥大學(xué)新教師啟動(dòng)基金項(xiàng)目（No.2021-JYB-XJSJJ057）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（No.2020-YJB-ZDGG-116）

作者單位? 1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院（北京 100700）；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)

通訊作者? 張立晶，E-mail：dzmyyccu@163.com

引用信息? 李蒙，劉用，張健真，等.麝香通心滴丸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（2）：250-253.? 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是心血管疾病的最危重類型之一，其發(fā)病急、預(yù)后差、病死率高，是急性心源性致死性疾病的主因。無(wú)論是藥物溶栓、冠狀動(dòng)脈支架植入，還是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)，再灌注治療都是其必然過(guò)程［1］。然而，心肌再灌注過(guò)程本身可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷、壞死進(jìn)一步加重，這一過(guò)程即為缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷［2］。因此，預(yù)防和治療再灌注損傷尤為關(guān)鍵。麝香通心滴丸由《太平惠民和劑局方》中至寶丹衍生而來(lái)，具有芳香益氣通脈、活血化瘀止痛的功效。前期研究發(fā)現(xiàn)麝香通心滴丸對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）術(shù)后慢血流病人的有效性及安全性較好［3］。關(guān)于麝香通心滴丸對(duì)I/R后心肌細(xì)胞和血管的保護(hù)作用及作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)構(gòu)建I/R損傷大鼠模型，觀察麝香通心滴丸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌I/R損傷后心肌細(xì)胞和血管的保護(hù)作用，以及對(duì)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響，進(jìn)而探討其保護(hù)I/R的潛在作用機(jī)制，為麝香通心滴丸防治I/R的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠60只，9～10周齡，體質(zhì)量（250±10）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物倫理的要求，倫理號(hào)（No）：21-49。

1.1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物

麝香通心滴丸，規(guī)格：35 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080018，由內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司提供，以去離子水配成［18.90 mg/（kg·d）］溶液，超聲溶解，高壓滅菌后于－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?尼可地爾片，規(guī)格：每片5 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20160540，由Nipro Pharma Corporation Kagamiishi Plant生產(chǎn)，使用去離子水配制成1.35 mg/（kg·d）的混懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3? 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：蘇木素染液（武漢市皮諾飛生物科技有限公司生產(chǎn)），HIF-1α抗體（28b）（Santa，sc-13515-200 μg/mL），VEGF Rabbit Polyclonal Antibody（proteintech，19003-1-AP-150 μL），過(guò)氧化氫溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，10011218），牛血清白蛋白（BSA）（Solarbio，A8020），包埋液（環(huán)氧樹(shù)脂Epon812），二抗［辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔/鼠通用二抗］（DAKO，K5007），組化試劑盒二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（DAKO，K5007）。

實(shí)驗(yàn)儀器：超薄切片機(jī)（徠卡ULTRACUT R），光學(xué)顯微鏡（CIC，XSP-C204），透射電鏡（日本日立H-7650），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康），成像系統(tǒng)（日本尼康）。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 動(dòng)物造模

對(duì)SD大鼠進(jìn)行冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎松解手術(shù)構(gòu)建心肌I/R模型。將SD大鼠以4%戊巴比妥鈉（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉注射，之后氣管插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)和心電圖機(jī)，于左側(cè)第三肋與第四肋間切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌層，打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，用帶線縫合針在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，于左心耳根部下方約2 mm處進(jìn)針，將左前降支連同少量的心肌組織一起結(jié)扎，先缺血30 min、再灌注120 min制備大鼠心肌I/R模型。抬高的ST段下降1/2以上為大鼠心肌I/R模型造模成功。

1.2.2? 分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、I/R組、麝香通心滴丸組（SXTX組）和陽(yáng)性組，每組15只。所有用藥劑量按照人與大鼠體表面積換算，SXTX組按成人用量的2倍，給予麝香通心滴丸18.90 mg/（kg·d）灌胃，陽(yáng)性組以尼可地爾1.35 mg/（kg·d）灌胃，Sham組和I/R組給予等體積去離子水灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃1周，末次灌胃1 h后構(gòu)建大鼠I/R模型。

1.3? 觀察指標(biāo)

1.3.1? 心肌蘇木精-伊紅（HE）染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出心臟，立即將10%多聚甲醛溶液50 mL注入離體心臟主動(dòng)脈內(nèi)，5 min后將左心室前壁心肌組織中間層切成條狀，放在上述固定液中固定48 h后，蒸餾水清洗、梯度乙醇脫水，后制作病理切片，切片厚度為4 μm，脫蠟、復(fù)水后行HE染色，封固，光鏡下觀察大鼠心肌組織及血管改變。

1.3.2? 心肌Masson染色

取出甲醛中固定24 h后的心肌組織，按乙醇濃度由低至高脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟后蒸餾水水洗。Weiger氏鐵蘇木素染色5～10 min后流水充分水洗，再用1%的鹽酸乙醇分化，再用麗春紅酸性品紅染液染色5～10 min后用蒸餾水水洗，加1%磷鉬酸水溶液5 min，后苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，隨后1%冰醋酸即刻洗滌后用95%乙醇多次脫水，后置于二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察心臟組織纖維化情況。

1.3.3? 電鏡觀察心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

留取再灌注末左心室梗死周邊缺血區(qū)心肌體積約1 mm3的標(biāo)本，放置于4%戊二醛內(nèi)固定，0.1 mol/L二甲膦酸鈉緩沖液漂洗，1%四氧化鋨固定，然后梯度丙酮脫水，使用環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行包埋、聚合，制作超薄切片，最后用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，在透射電鏡下觀察并拍照。

1.3.4? 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血管相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF的表達(dá)情況

取10%甲醛固定梗死周邊缺血區(qū)心肌組織，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋及心肌切片（5 μm），石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加一抗（HIF-1α 1∶50稀釋，VEGF 1∶200稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗孵育30 min，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，光鏡下分別觀察HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)情況。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，方差不齊用 Tamhane′s T2 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? HE染色結(jié)果

Sham組心肌組織結(jié)構(gòu)正常、完整，心肌細(xì)胞分布均勻、有序，輪廓清晰可見(jiàn)，胞核與胞質(zhì)邊緣分明，血管管腔完整。I/R組心肌組織染色著色較淺，有細(xì)胞輪廓不清及破碎現(xiàn)象，組織排列異常紊亂、呈無(wú)序狀，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死區(qū)充血出血。陽(yáng)性組心肌細(xì)胞部分相互連接，排列整齊，心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維中少量心肌纖維變性壞死及脂肪變性，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與I/R組比較，SXTX組心肌組織排列較為整齊，著色相對(duì)更均勻，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管管腔完整度較好。詳見(jiàn)圖1。

2.2? Masson染色結(jié)果

Sham組Masson染色心肌纖維無(wú)纖維化，僅在血管壁周邊有著色。I/R組顯示紫紅色的心肌組織明顯減少，存在大量呈藍(lán)色的膠原纖維，血管破碎，部分血管呈管腔狹窄和閉合。與I/R組相比，陽(yáng)性組、SXTX組Masson染色顯示以紫紅色心肌組織為主，藍(lán)色膠原纖維增生沉積現(xiàn)象顯著減輕。詳見(jiàn)圖2。

2.3? 透射電鏡觀察心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

Sham組微血管基底膜未見(jiàn)增厚，內(nèi)彈性膜未見(jiàn)變窄，管腔規(guī)整，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和核仁結(jié)構(gòu)清楚，周圍心肌細(xì)胞形態(tài)完整，未見(jiàn)脂質(zhì)沉積；I/R組內(nèi)膜下結(jié)締組織腫脹，內(nèi)彈性膜局部變窄，管腔嚴(yán)重變形，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)腫脹，可見(jiàn)胞質(zhì)碎片，核膜部分缺失，周圍心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞破碎嚴(yán)重，大量的脂質(zhì)沉積；與I/R組相比，SXTX組微血管基底膜輕度增厚，內(nèi)彈性膜局部變窄，管腔稍有變形，內(nèi)皮細(xì)胞排列較整齊，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)和核仁結(jié)構(gòu)，周圍心肌細(xì)胞形態(tài)基本完整，少量脂質(zhì)沉積。詳見(jiàn)圖3。2.4? 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌中HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)

與Sham組比較，I/R組心肌組織中HIF-1α表達(dá)增加，提示在缺血、缺氧狀態(tài)下HIF-1α蛋白反應(yīng)性增加。與I/R組比較，SXTX組心肌組織HIF-1α表達(dá)下降，VEGF蛋白表達(dá)增加，提示麝香通心滴丸可促進(jìn)VEGF蛋白的生成，進(jìn)而促進(jìn)缺血區(qū)血管形成，改善心肌組織乏氧環(huán)境。詳見(jiàn)圖4、圖5。

3? 討? 論

“時(shí)間就是心肌”，由于心肌組織細(xì)胞對(duì)缺氧、缺血的敏感性高，尤其是其具有不可再生的特性，因此，在AMI的救治過(guò)程中，及時(shí)再灌注治療是挽救瀕死心肌細(xì)胞的關(guān)鍵。然而缺血再灌注治療必然會(huì)造成再灌注損傷，是AMI不可避免的風(fēng)險(xiǎn)事件。保護(hù)心肌I/R損傷可防止心肌梗死后不良重塑和更差的臨床結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)的心肌I/R可誘導(dǎo)各種形式的心肌細(xì)胞死亡和冠狀動(dòng)脈微血管損傷［4］。

麝香通心滴丸由人工麝香、蟾酥、人工牛黃、冰片、人參莖葉、丹參、熊膽粉組成，具有芳香益氣通脈、活血化瘀止痛之功效。多項(xiàng)研究表明麝香通心滴丸可減輕心肌缺血損傷，可能通過(guò)升高內(nèi)源性一氧化氮水平，抑制炎癥反應(yīng)，改善冠狀動(dòng)脈微循環(huán)等［5-7］。本研究亦發(fā)現(xiàn)麝香通心滴丸可保護(hù)心肌I/R引起的心肌細(xì)胞和血管損傷。王偉等［8］對(duì)麝香通心滴丸組方入血成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)VEGF/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路可能為麝香通心滴丸治療冠心病的信號(hào)通路。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)麝香通心滴丸可促進(jìn)缺血區(qū)心肌組織VEGF蛋白的生成，并提示可能與HIF-1α介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。HIF-1α是一種關(guān)鍵的氧敏感轉(zhuǎn)錄因子，心肌組織細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加，進(jìn)而調(diào)控多種基因表達(dá)，發(fā)揮機(jī)體對(duì)低氧或缺血的保護(hù)性適應(yīng)［9］。VEGF與血管生成密切相關(guān)。在心肌I/R損傷中，增加血管生成可有效改善病灶缺氧狀態(tài)，從而保護(hù)心臟［10］。本研究發(fā)現(xiàn)心肌I/R損傷時(shí)HIF-1α的表達(dá)增加以適應(yīng)乏氧環(huán)境，麝香通心滴丸可能通過(guò)促進(jìn)VEGF蛋白的生成，促進(jìn)缺血心肌血管新生，改善乏氧環(huán)境，參與大鼠心肌I/R心肌保護(hù)的過(guò)程。

綜上所述，麝香通心滴丸可有效保護(hù)大鼠心肌I/R的細(xì)胞和血管損傷，減輕心肌組織病理?yè)p傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)心肌組織VEGF蛋白的表達(dá)及促進(jìn)缺血區(qū)微血管新生有關(guān)，從而達(dá)到保護(hù)心臟、抗心肌

I/R損傷的作用。

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（收稿日期：2022-03-31）

（本文編輯王麗）