王勝男 張茂森 周磊 井曉宇 張洪志 李玉艷 吳惠惠 張禮生

摘要：保幼激素（juvenile hormone，JH）缺乏是引發(fā)昆蟲生殖滯育的主要原因，保幼激素環(huán)氧水解酶（JHEH）作為JH的主要降解酶，通過調(diào)控JH滴度水平在昆蟲滯育中發(fā)揮重要作用。為研究JHEH在蠋蝽生殖滯育中的調(diào)控功能，克隆獲得了蠋蝽JHEH基因（AcJHEH），該基因編碼452個(gè)氨基酸，具有典型環(huán)氧水解酶結(jié)構(gòu)特征，無跨膜結(jié)構(gòu)域，存在1個(gè)信號(hào)肽位點(diǎn)。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，AcJHEH在不同物種間具有較高保守性，與茶翅蝽（Halyomorpha halys）的JHEH相似性較高，達(dá)65.46%。利用RT-qPCR 技術(shù)測(cè)定了AcJHEH在蠋蝽不同組織及滯育不同時(shí)期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)AcJHEH表達(dá)量在滯育誘導(dǎo)期先下降后升高，滯育誘導(dǎo)20 d時(shí)表達(dá)量最低；滯育初期（誘導(dǎo) 40 d）表達(dá)量最高，滯育維持期（誘導(dǎo)50～60 d）的表達(dá)量穩(wěn)定在較高水平，與成蟲初羽化時(shí)水平接近。AcJHEH在滯育蠋蝽的頭部表達(dá)量最高，其次是中后腸和脂肪體，在卵巢中表達(dá)量最低。利用RNAi敲降蠋蝽初羽化成蟲的JHEH基因表達(dá)后，雌蟲體內(nèi)的卵黃蛋白原（vitelliogenin，Vg）基因表達(dá)量上升，卵黃沉積明顯，推測(cè)滯育誘導(dǎo)期高表達(dá)的JHEH基因可能通過抑制Vg基因的表達(dá)，抑制卵黃蛋白沉積和卵巢發(fā)育，從而促進(jìn)蠋蝽的生殖滯育。本研究結(jié)果為解析JHEH在生殖滯育中的調(diào)控作用提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蠋蝽；生殖滯育；保幼激素環(huán)氧水解酶；基因表達(dá)模式；基因功能

中圖分類號(hào)：S476.2；S433? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）06-0043-09

收稿日期：2023-05-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家煙草總局重大專項(xiàng)[編號(hào)：110202001032（LS-01）]；貴州省煙草公司項(xiàng)目（編號(hào)：201937、201941）。

作者簡(jiǎn)介：王勝男（1997—），女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail：3221905868@qq.com。

通信作者：吳惠惠，博士，助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治，E-mail：wuhuihui@tjau.edu.cn；張禮生，博士，研究員，研究方向?yàn)楹οx生物防治，E-mail：zhangleesheng@163.com。

蠋蝽（Arma chinensis Fallou）因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、捕食范圍廣等優(yōu)點(diǎn)^[1-2]，在對(duì)包括草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）在內(nèi)的入侵害蟲也有較高的捕食能力，因此在生物防治中具有較高應(yīng)用價(jià)值^[1-9]。在蠋蝽的生產(chǎn)應(yīng)用中，產(chǎn)品足量穩(wěn)定供應(yīng)和批量釋放是影響其控害效果的關(guān)鍵因素，研究蠋蝽的大量擴(kuò)繁、儲(chǔ)存及釋放應(yīng)用對(duì)促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義^{[2，10-16]}。自然條件下，部分昆蟲為躲避不利環(huán)境影響會(huì)選擇進(jìn)入一種發(fā)育停滯狀態(tài)，即滯育（diapause）。滯育過程受環(huán)境因子、遺傳和激素的共同調(diào)控，滯育期間常伴隨能源物質(zhì)積累、代謝抑制、抗逆性提高、生殖抑制等生理變化^[17-20]。研究明確昆蟲的滯育特征及其調(diào)控機(jī)制，不僅有助于掌握昆蟲的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制、預(yù)測(cè)種群發(fā)生動(dòng)態(tài)，還可通過人為操控有益昆蟲的滯育進(jìn)程延長(zhǎng)其貯存和使用壽命，提高天敵的貨架期和應(yīng)用潛力，或可干預(yù)害蟲的滯育發(fā)生控制其危害^[18]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究中證實(shí)蠋蝽能以成蟲形態(tài)進(jìn)行滯育，雌成蟲在短光照低溫條件下誘導(dǎo)40 d后進(jìn)入滯育態(tài)，滯育率可達(dá)90%以上，滯育期平均可維持160 d，部分能達(dá)300 d以上^[21]。在此基礎(chǔ)上深入解析蠋蝽生殖滯育的調(diào)控機(jī)制，對(duì)促進(jìn)蠋蝽的擴(kuò)繁應(yīng)用具有重要應(yīng)用價(jià)值。

保幼激素（juvenile hormone，JH）能使幼蟲蛻皮后仍保持幼蟲狀態(tài)，抑制成蟲特征的出現(xiàn)，并在成蟲期促進(jìn)卵子成熟，調(diào)控昆蟲生殖發(fā)育的一種倍半萜烯類激素。大量研究表明，JH是控制昆蟲滯育的主要調(diào)節(jié)激素^[22-24]。通常生殖滯育的雌蟲JH滴度低于正常發(fā)育的雌蟲，JH缺乏是成蟲滯育的主要原因^[23，25-26]。保幼激素滴度受合成和代謝共同調(diào)控，其中，JH的代謝主要受保幼激素酯酶（juvenile hormone esterase，JHE）、保幼激素環(huán)氧化物水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase，JHEH）和保幼激素二醇激酶（juvenile hormone diol kinase，JHDK）的調(diào)控^[27-31]。JHEH是調(diào)控昆蟲體內(nèi)保幼激素滴度的關(guān)鍵酶^[30]，在昆蟲中，JHEH可把JH降解成保幼激素二醇（juvenile hormone diol，JHD），并把保幼激素酸（juvenile hormone acid，JHA）降解為保幼激素酸二醇（juvenile hormone acid diol，JHAD）^[22-25]。在異色瓢蟲（Harmonia axyridis）及大猿葉甲（Colaphellus bowringi）等昆蟲的生殖滯育研究中發(fā)現(xiàn)，JHEH基因在滯育期間顯著上調(diào)，干擾該基因表達(dá)，可明顯抑制滯育反應(yīng)，促進(jìn)卵巢發(fā)育及脂肪積累等，證明JHEH基因的高表達(dá)對(duì)促進(jìn)滯育，維持滯育表型具有重要作用^{[28，32-34]}。并通過分別干擾JHE、JHEH或JHDK在成蟲滯育期間的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)JHEH和JHDK比JHE在調(diào)控JH滴度水平中可能發(fā)揮更重要的作用^[35-39]。

本研究為解析保幼激素環(huán)氧水解酶基因JHEH在蠋蝽生殖滯育中的作用及調(diào)控機(jī)制，首先對(duì)克隆的JHEH基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了JHEH基因在蠋蝽不同組織及滯育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，明確了JHEH基因在蠋蝽生殖滯育過程中的表達(dá)規(guī)律。利用RNA干擾技術(shù)，對(duì)蠋蝽初羽化成蟲的JHEH基因進(jìn)行干擾，并分析了干擾后對(duì)蠋蝽Vg基因表達(dá)及卵巢發(fā)育的影響，為進(jìn)一步揭示JHEH通過調(diào)控JH滴度影響滯育進(jìn)程的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 供試?yán)ハx

供試蠋蝽種群來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所河北省廊坊基地實(shí)驗(yàn)室，于2021年7月在北京實(shí)驗(yàn)室繼代飼養(yǎng)建立穩(wěn)定種群。正常發(fā)育的蠋蝽飼養(yǎng)條件為：溫度（27±2） ℃，相對(duì)濕度75%，光—暗周期16 h—8 h；滯育誘導(dǎo)下的蠋蝽飼養(yǎng)條件為溫度周期15 ℃（光）—5 ℃（暗），相對(duì)濕度75%，光—暗周期8 h—16 h。

1.2? 試驗(yàn)處理

蠋蝽雌蟲作為供試蟲源，取非滯育雌蟲（NE）、滯育誘導(dǎo)期（誘導(dǎo)10、20、30 d）、滯育初期（誘導(dǎo) 40 d）、滯育維持期（誘導(dǎo)50、60 d）的蠋蝽雌蟲整個(gè)蟲體樣品用于RNA的提取。解剖誘導(dǎo)40 d的蠋蝽雌蟲的不同組織（頭、脂肪體、卵巢、中腸和后腸）樣品用于RNA的提取。

1.3? AcJHEH基因克隆及序列分析

1.3.1? 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室已測(cè)蠋蝽的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定得到AcJHEH基因序列，并設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.3.2? RNA提取、-cDNA、5′/3′-RACE-ready-cDNA的合成

蠋蝽的總RNA提取步驟按照試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）說明書進(jìn)行。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，利用北京金沙生物科技有限公司的UnionScript First-strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述不同樣品的 RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。按照試劑盒（SMARTer RACE 5′/3′Kit，Clontech）說明書，合成5′/3′-RACE-ready-cDNA，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3? 中間片段擴(kuò)增

以滯育蠋蝽cDNA為模板，利用AcJHEH-F/AcJHEH-R進(jìn)行中間序列擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50 μL）：上下游引物各2 μL，模板1 μL，PCR Master Mix 25 μL，ddH₂O 20 μL輕微振蕩混勻。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 ｓ，56 ℃退火10 ｓ，72 ℃延伸15 ｓ，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完成后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4? 5′/3′-RACE PCR

分別以5′-RACE-ready-cDNA和3′-RACE-ready-cDNA為模板，按照試劑盒說明書擴(kuò)增RACE全長(zhǎng)。反應(yīng)體系（50.0 μL）：PCR-Grade H₂O 15.5 μL，Buffer 25.0 μL，SeqAmp? DNA Polymerase 1.0 μL，混勻后加入2.5 μL模板，10×UPM 5.0 μL，AcJHEH-5′GSP或AcJHEH-3′GSP 1.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 ｓ，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 ｓ，70 ℃ 30 ｓ，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 ｓ，69 ℃ 30 ｓ，72 ℃ 3 min，20個(gè)循環(huán)。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序。

1.3.5? 序列拼接與生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN和EditSeq，對(duì)PCR試驗(yàn)中得到的中間序列和5′／3′RACE得到的序列進(jìn)行拼接，得到AcJHEH基因cDNA全長(zhǎng)序列。利用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)氨基酸序列，用NCBI BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)及同源序列搜索；利用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，用PredictProtein（https：//predictprotein.org/）在線分析和ExPASy Protteo tmics Server在線分析進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白分子式預(yù)測(cè)，用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，用SignalP 5.0 Server在線分析（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.4? 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）

運(yùn)用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，選取蠋蝽AcActin基因作為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)合成引物，見表1；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)使用 LightCycler 96 Instrument（Roche，瑞士）進(jìn)行，試劑使用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司的GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系（20.0 μL）為：2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix（1×）10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各 0.8 μL，超純水 7.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃變性 60 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5? AcJHEH基因的RNA干擾和干擾后表型觀察

根據(jù)AcJHEH的cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成帶有T7（TAATACGACTCACTATAGGG）啟動(dòng)子序列的特異性引物[表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]和dsGFP（基于綠色熒光蛋白基因設(shè)計(jì)的dsRNA，用于對(duì)照試驗(yàn)），以蠋蝽雌成蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度后利用膠回收試劑盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit）進(jìn)行純化。以1 μg膠回收產(chǎn)物為模板，利用dsRNA合成試劑盒（MEGA scriptRNAi Kit，Thermo Fisher）合成dsAcJHEH和dsGFP，試驗(yàn)步驟和試劑參照Li等的方法^[33]，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶后定量至2 μg/μL。選取初羽化的蠋蝽雌成蟲，使用Nano Ject Ⅲ，Drummond Scientific Company注射儀（Drummond，美國(guó)）對(duì)其注射dsAcJHEH（注射數(shù)量為47頭），注射部位統(tǒng)一為蠋蝽第二、第三腹節(jié)之間的節(jié)間膜，注射劑量為3 μg/頭，同時(shí)注射等量的dsGFP（共47頭）作為對(duì)照，將注射后的試蟲飼養(yǎng)在正常條件下。將注射后的蠋蝽雌蟲用于基因沉默效率檢測(cè)和Vg含量檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)取3組重復(fù)，每組雌蟲為5～6頭，設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。取注射后24、48、60、72、96 h的試蟲進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，檢測(cè)其干擾效率，并檢測(cè)注射后48、60、72 h的Vg含量。分別對(duì)未滯育，注射dsGFP、注射dsAcJHEH后4 d的蠋蝽進(jìn)行解剖，對(duì)其卵巢進(jìn)行拍照。

1.6? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

時(shí)空表達(dá)試驗(yàn)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，RNA干擾試驗(yàn)后檢測(cè)AcJHEH基因沉默效率以及對(duì)沉默AcJHEH基因后Vg基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，并采用Tukeys多重比較法進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2? 結(jié)果與分析

2.1? AcJHEH基因序列分析

由圖1可知，AcJHEH基因 cDNA 全長(zhǎng) 2 109 bp，開放閱讀框（ORF）為1 359 bp，編碼452個(gè)氨基酸，5′非編碼區(qū)135 bp，3′非編碼區(qū)616 bp，預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的分子式為C_{2 402}H_{3 641}N₅₉₇O₆₅₂S₁₂，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為51.69 866 ku，理論等電點(diǎn)為8.21，帶正電荷的氨基酸45個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸43個(gè)，極性氨基酸216個(gè)，非極性氨基酸203個(gè)。親水性系數(shù)為-0.143（<0），不穩(wěn)定系數(shù)為32.80（<40），是疏水的穩(wěn)定蛋白。JHEH全長(zhǎng)序列包含完整開放閱讀框，N端包含1個(gè)由18～22 個(gè)氨基酸組成的疏水性信號(hào)肽序列，第49～161個(gè)氨基酸之間存在EHN環(huán)氧水解酶超家族結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白包含0個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)（圖2、圖3）。蛋白的螺旋（helix）、折疊（strand）、其他（other）占比分別為37.25%、8.65%和54.10%。以保幼激素環(huán)氧水解酶（SMTL ID：4qla.1.A）為模型預(yù)測(cè)蠋蝽JHEH蛋白的3D結(jié)構(gòu)（圖4）為同源JHEH序列，序列相似度約為46.14%。

2.2? 構(gòu)建AcJHEH系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖5可知，在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取8種不同昆蟲的JHEH氨基酸序列，與蠋蝽的JHEH序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示相似性達(dá)65.46%，JHEH

包含1個(gè)HGWP氨基酸序列，該序列在七星瓢蟲和其他昆蟲的JHEH中高度保守，因此，基序HGWP或許參加了JHEH的催化作用^[33-34]。由圖6可知，將從數(shù)據(jù)庫中選取的31種同源性較高的物種與蠋蝽JHEH氨基酸序列一起構(gòu)建進(jìn)化樹，從進(jìn)化樹中可以看出，JHEH氨基酸序列與鞘翅目、雙翅目等昆蟲的親緣性較高，其中與茶翅蝽（Halyomorpha halys）（登錄號(hào)XM_014437801）的親緣關(guān)系最近。

2.3? AcJHEH基因的時(shí)序表達(dá)分析

由AcJHEH基因在蠋蝽滯育不同時(shí)期的表達(dá)結(jié)果（圖7）可知，AcJHEH基因在蠋蝽滯育誘導(dǎo)及滯育

期間均有表達(dá)，不同時(shí)期間存在極顯著差異（F=8.009，df=26，P<0.01）。成蟲初羽化時(shí)期AcJHEH表達(dá)量較高；滯育誘導(dǎo)10 d時(shí)表達(dá)量極顯著降低，滯育誘導(dǎo)20 d時(shí)表達(dá)量達(dá)最低，隨后逐漸升高；在滯育初期（誘導(dǎo)40 d）達(dá)到峰值，進(jìn)入滯育維持期（50、60 d）后穩(wěn)定在較高水平。

蠋蝽滯育初期（誘導(dǎo)40 d）檢測(cè)AcJHEH基因在雌蟲不同組織中的表達(dá)量，由圖8可知，AcJHEH在雌蟲頭部的表達(dá)量極顯著最高（F=311，df=19，P<0.01），是脂肪體中基因表達(dá)量的2.3倍；AcJHEH基因在中腸和后腸中的表達(dá)量均極顯著高于脂肪體和卵巢中的表達(dá)量，但兩者間無顯著差異；AcJHEH在卵巢中的表達(dá)量最低，僅為頭部表達(dá)量的5%。

2.4? AcJHEH基因的功能分析

由圖9可知，未注射dsAcJHEH的對(duì)照組中，JHEH的表達(dá)量持續(xù)下降；注射dsAcJHEH后，JHEH的表達(dá)量先下降再上升，注射后60 h的表達(dá)量最低，說明注射dsAcJHEH會(huì)影響JHEH的表達(dá)；在注射dsAcJHEH試驗(yàn)后的24 h，對(duì)照組和處理組的JHEH相對(duì)表達(dá)量差異不大；注射后48～72 h，對(duì)照組和處理組的相對(duì)表達(dá)量差異極顯著。注射后 60 h，處理組的AcJHEH相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照

組的相對(duì)表達(dá)量，表明基因干擾成功。

由圖10可知，檢測(cè)注射dsAcJHEH 48、60、72 h 后試蟲的Vg基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)注射dsGFP試蟲的Vg基因在注射后48、60 h的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；注射dsAcJHEH后，Vg基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于注射dsGFP對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量，Vg基因的表達(dá)在注射后60 h時(shí)達(dá)最高，至注射72 h后，Vg基因的相對(duì)表達(dá)量下降，但依然極顯著高于對(duì)照組。由圖11可知，比較分別注射dsAcJHEH和注射dsGFP后4 d的雌蟲卵巢圖片，發(fā)現(xiàn)與注射dsGFP的對(duì)照組相比，注射dsAcJHEH后，卵巢發(fā)育，卵黃原堆積現(xiàn)象更加顯著。

3? 結(jié)論與討論

滯育是昆蟲在應(yīng)對(duì)不良環(huán)境壓力，如夏季高溫、冬季嚴(yán)寒及食物缺乏等因素時(shí)的一種重要生存策略^[17-20]，對(duì)個(gè)體存活和種群維持具重要意義。蠋蝽成蟲的生殖滯育主要表現(xiàn)為生殖系統(tǒng)的發(fā)育停滯，如雌蟲卵泡不分化、無卵黃沉積、卵巢管呈透明色，雄蟲附腺發(fā)育抑制等^[21]。以往研究證實(shí)，成蟲進(jìn)入滯育，伴隨著保幼激素水平下降，其中，JH生物合成下降或關(guān)閉被認(rèn)為是誘發(fā)一些昆蟲啟動(dòng)滯育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)^[33-37]，有些研究也表明JH降解在調(diào)控滯育中發(fā)揮重要作用，如在滯育準(zhǔn)備期JH代謝增強(qiáng)可促進(jìn)脂肪積累、提高抗逆性，并抑制卵巢發(fā)育^[32-37]。JH的代謝分為2個(gè)途徑：（1）JH被JHE降解成為JHA，JHA再被JHEH降解為JHAD；（2）保幼激素被JHEH降解為JHD，JHD再被JHDK降解成為保幼激素二醇磷酸（juvenile hormone diol phosphate，JHDP），即JH最終被降解為JHAD和JHDP^[40-43]。已有研究表明，JH降解酶基因在不同種類昆蟲的生殖滯育中發(fā)揮不同程度的調(diào)控作用，且同種降解酶基因的不同亞型也具有不同功能，如在生殖的煙粉虱（Bemisia tabaci）和意大利蜜蜂（Apis mellifera）中，JHE與卵黃原蛋白基因表達(dá)水平一致，兩者均與JH滴度呈負(fù)相關(guān)^[42-44]；而黃斑星天牛（Psacothea hilaris）幼蟲進(jìn)入滯育后，JHE活性顯著降低且在滯育期間維持較低水平^[45]，在滯育準(zhǔn)備期的大猿葉甲雌蟲中，3個(gè)JHE基因也以低水平表達(dá)^[36]。

在本研究中，克隆獲得了AcJHEH基因全長(zhǎng)，分析AcJHEH基因序列特征發(fā)現(xiàn)，蠋蝽JHEH的N端包含1個(gè)由18～22個(gè)氨基酸組成的疏水性信號(hào)肽序列，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，第49～161個(gè)氨基酸之間存在EHN環(huán)氧水解酶超家族結(jié)構(gòu)域，具備環(huán)氧水解酶的典型結(jié)構(gòu)特征^{[27-29，33-35]}，推測(cè)為JHEH1^[35]。通過進(jìn)化樹分析蠋蝽JHEH氨基酸序列與近源物種的同源比較，蠋蝽保幼激素環(huán)氧水解酶基因在進(jìn)化上高度保守，與同屬半翅目蝽科的茶翅蝽JHEH聚類到同一分支，說明親緣關(guān)系較近。

分析JHEH基因在蠋蝽滯育過程中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律特征，結(jié)果表明JHEH基因表達(dá)與滯育進(jìn)程聯(lián)系密切，可能在滯育過程中也發(fā)揮重要調(diào)控作用。保幼激素降解代謝增強(qiáng)是生殖滯育激素調(diào)控的一個(gè)普遍特征。本研究結(jié)果表明，JHEH基因表達(dá)在蠋蝽滯育前期和滯育期均顯著提高，這和JHEH基因在七星瓢蟲滯育期間的表達(dá)規(guī)律相似^[32]，說明JHEH基因的轉(zhuǎn)錄水平變化與滯育進(jìn)程密切相關(guān)。AcJHEH在滯育準(zhǔn)備期和維持期的高表達(dá)，可能促進(jìn)保幼激素的降解，降低JH滴度，從而促進(jìn)滯育發(fā)生和維持。本研究也發(fā)現(xiàn)，蠋蝽成蟲和七星瓢蟲成蟲在初羽化時(shí)，JHEH表達(dá)水平均較高，在對(duì)初羽化成蟲進(jìn)行滯育誘導(dǎo)處理后，JHEH表達(dá)量逐漸下降至最低水平后又隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高，推測(cè)初羽化成蟲體內(nèi)高表達(dá)的JHEH與成蟲羽化行為有關(guān)，高表達(dá)的JHEH有助于維持低水平的保幼激素，從而完成羽化過程^[46]。在滯育蠋蝽中，JHEH基因在頭部高表達(dá)，說明該基因主要在頭部發(fā)揮重要調(diào)控作用，與本研究不同，JHEH1基因在滯育大猿葉甲頭部表達(dá)量較低^[35]。JHEH基因在蠋蝽中腸和后腸中的表達(dá)量?jī)H次于在頭部的表達(dá)量。蠋蝽脂肪體中JHEH的表達(dá)量較低，和滯育大猿葉甲中JHEH1的研究結(jié)果^[35]相似，但JHEH基因在滯育九香蟲（Aspongopus chinensis Dallas）的脂肪體中高表達(dá)^[29]。滯育蠋蝽的卵巢中JHEH表達(dá)量極低，這與九香蟲的研究結(jié)果^[29]近似。上述研究結(jié)果表明，JHEH基因在蠋蝽滯育成蟲中的表達(dá)具有組織特異性，其在不同組織的差異表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)的生理調(diào)節(jié)功能，具體功能仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

接下來，本研究對(duì)初羽化的蠋蝽進(jìn)行JHEH基因的RNA干擾試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)干擾后，Vg的表達(dá)量上升，卵黃沉積明顯，推斷JHEH基因可通過促進(jìn)Vg基因的表達(dá)來促進(jìn)蠋蝽卵巢的發(fā)育。在七星瓢蟲JH降解基因的功能研究中，發(fā)現(xiàn)在滯育準(zhǔn)備期干擾JHE或JHEH基因表達(dá)均可促進(jìn)卵黃沉積和卵子發(fā)生^[35]，但對(duì)大猿葉甲JH降解基因的研究中發(fā)現(xiàn)，JHE在滯育準(zhǔn)備的雌蟲中低表達(dá)，干擾JHEHs和JHDK在滯育準(zhǔn)備期的表達(dá)后，雖然能降低脂肪積累和抗逆性，但不能促進(jìn)生殖，也沒有促進(jìn)卵巢發(fā)育^[37-39]。現(xiàn)有這些結(jié)果說明，JH降解酶基因在不同昆蟲生殖滯育中的調(diào)控作用程度不完全相同，因此，研究者認(rèn)為雖然保幼激素降解基因可通過調(diào)控JH水平對(duì)昆蟲生殖滯育產(chǎn)生影響，但這種影響在某些昆蟲中的作用是有限的，在這些昆蟲中，或許JH生物合成水平的下降可能才是誘導(dǎo)生殖滯育的主要因素^{[35，37-41]}，僅通過抑制JH降解酶基因表達(dá)是否能逆轉(zhuǎn)成蟲進(jìn)入滯育狀態(tài)還需要進(jìn)一步研究。JHEH基因在蠋蝽生殖滯育中的具體調(diào)控作用仍需深入探索。

此外，保幼激素的代謝不僅受降解酶基因的調(diào)控，還受如叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead-boxO，F(xiàn)oxO）等的調(diào)控，其表達(dá)上調(diào)時(shí)可促進(jìn)代謝酶類的轉(zhuǎn)錄翻譯，同時(shí)沉默Kr-h1（krüppel-homolog1）基因片段的表達(dá)，阻斷Kr-h1對(duì)JHD的應(yīng)答反應(yīng)，從而降低保幼激素滴度^{[38，46]}。在后續(xù)研究中，除繼續(xù)開展JHEH基因功能和上游信號(hào)通路研究，解析JHEH在滯育不同時(shí)期的特定作用機(jī)制，還要探索轉(zhuǎn)錄因子和保幼激素信號(hào)響應(yīng)元件對(duì)保幼激素滴度的調(diào)控作用，為全面解析保幼激素調(diào)控生殖滯育的機(jī)制提供理論參考。

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