何鋼華 , 潘 婷 , 馮志華 , 崔智琳 , 楊鎂楹 , 李 楊 , 左紅艷 , 鄧 樺

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 , 廣東 佛山 528231 ; 2. 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 , 北京 海淀 100850)

伴隨各種電子設(shè)備的發(fā)展和應(yīng)用,微波輻射對(duì)人體健康的影響備受關(guān)注。微波輻射(Microwave radiation,MR)是指頻率在300 MHz～300 GHz,波長為1 mm～1 m的電磁波輻射[1],其作為一種嚴(yán)重的環(huán)境污染源,可對(duì)人或動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成影響。研究表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對(duì)微波輻射敏感的重要靶器官,且海馬是微波輻射敏感的重要靶部位,微波輻射可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[2],但其作用機(jī)制尚未闡明。眾所周知,膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)由能夠合成乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)的膽堿能神經(jīng)元組成,ACh和乙酰膽堿受體(Acetylcholine receptors,AChRs)在學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。然而,關(guān)于微波輻射對(duì)腦內(nèi)AChRs的影響及其在認(rèn)知功能障礙中的作用尚不明確。

本試驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上,建立微波輻射動(dòng)物模型[4],基于微波輻射對(duì)海馬各亞區(qū)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,以及海馬AChRs亞型基因表達(dá)變化,選取M1型AChR(M1-AChR)特異性激動(dòng)劑,進(jìn)一步探討M1-AChR在微波輻射致小鼠認(rèn)知行為改變中的作用,以期為微波輻射腦損傷效應(yīng)機(jī)制及其防治研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,H.E.)染液,購自北京雷根(Leagene)生物技術(shù)有限公司;RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent、HiScript Ⅲ RT SuperMix RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒,均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;VU0357017 hydrochloride M1-AChR激動(dòng)劑,購自TargetMol中國(陶術(shù)生物)公司。

1.2 主要儀器 RM2255石蠟切片機(jī),德國徠卡(Leica)儀器有限公司產(chǎn)品;Pannoramic MIDI Ⅱ數(shù)字切片掃描系統(tǒng),匈牙利 3DHISTECH公司產(chǎn)品;N60-Touch超微量紫外分光光度儀,因普恩(北京)國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品;CFX Opus 96熒光定量PCR儀,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品;Any-maze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng),美國Stoelting公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡SPF級(jí)C57BL/6N健康小鼠共49只,體重(26 ± 2)g,雌雄各半,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019—0010],飼養(yǎng)于中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院(以下稱軍科院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物試驗(yàn)符合軍科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào):IACUC-DWZX-2021-685)。

1.4 微波輻射動(dòng)物模型建立 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Con組)和微波輻射組(MR組),MR組利用軍科院自建微波輻射模擬源對(duì)小鼠進(jìn)行單次全身照射。將小鼠放置于透明帶孔的圓形有機(jī)玻璃盒中,自由體位,采用中心頻率為2.856 GHz,平均功率密度為8 mW/cm2,SAR值為6.12 W/kg的微波對(duì)小鼠全身均勻輻射15 min(單次);Con組小鼠放置于相同的有機(jī)玻璃盒內(nèi),在同樣的照射環(huán)境中進(jìn)行單次偽輻射15 min。

1.5 海馬組織病理學(xué)觀察 Con組和MR組小鼠各6只。微波輻射后7 d,小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉[50 mg/(kg·bw)]麻醉后取腦組織,經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定2周,依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋和石蠟切片,切片厚度3 μm;經(jīng)H.E.染色后,采用Pannoramic MIDI Ⅱ 數(shù)字切片掃描系統(tǒng)觀察海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)海馬AChRs基因表達(dá) Con組和MR組小鼠各5只。微波輻射后7 d,小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉[50 mg/(kg·bw)]麻醉后取腦組織,冰上剝離雙側(cè)海馬。采用TRIzol試劑提取海馬組織總RNA,利用超微量紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度以及A260/A280和A260/A230比值。取1.81.8的RNA樣本1 μg,利用Hiscript Ⅲ RT SuperMix試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。RT-qPCR反應(yīng)程序:95 ℃,30 s;95 ℃,10 s;60 ℃,30 s,循環(huán)40次,4 ℃終止。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL):上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板1.0 μL,ddH2O 8.0 μL,2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參,以2-ΔΔCt法計(jì)算AChRs的相對(duì)表達(dá)水平。引物經(jīng)Primer Bank數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)并在NCBI Blast中比對(duì),由TaKaRa公司合成,引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.7 VU0357017 hydrochloride給藥方法 將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Con-NS組)、輻射對(duì)照組(MR-NS組)和輻射給藥組(MR-VU組),每組各9只。微波輻射后7 d,MR-VU組小鼠腹腔注射M1-AChR特異性激動(dòng)劑VU0357017 hydrochloride,注射劑量為10 mg/(kg·bw);Con-NS組和MR-NS組注射同等體積生理鹽水,各組于給藥后30 min進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)。

1.8 行為學(xué)試驗(yàn)

1.8.1 新物體識(shí)別(Novel object recognition,NOR)試驗(yàn) 采用40 cm×40 cm×40 cm曠場箱,將大小相同但顏色不同的2個(gè)正方體(4 cm×4 cm×4 cm)沿對(duì)角線置于距箱體邊緣10 cm處。試驗(yàn)前將小鼠置于試驗(yàn)環(huán)境中,每天對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)性操作30 min,連續(xù)3 d。試驗(yàn)開始時(shí),采用Any-maze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡5 min,采集小鼠探索新和舊物體的時(shí)間。分別按公式(1)和(2)計(jì)算動(dòng)物的辨別指數(shù)(Discrimination index,DI)和認(rèn)知指數(shù)(Recognition index,RI),檢測(cè)小鼠新物體探索行為的改變。

DI=(探索新物體時(shí)間-探索舊物體時(shí)間)÷(探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間)

(1)

RI(%)=探索新物體時(shí)間÷(探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間)×100%

(2)

1.8.2 Y迷宮(Y maze)試驗(yàn) 采用臂長30 cm、寬8 cm、高15 cm的Y迷宮,試驗(yàn)前將小鼠置于試驗(yàn)環(huán)境中,每天對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)性操作30 min,連續(xù)3 d。試驗(yàn)開始時(shí),采用Any-maze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析軟件記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡8 min,采集小鼠進(jìn)入Y迷宮各臂的時(shí)間和次數(shù),按公式(3)計(jì)算自由交替率(Spontaneous alternation),檢測(cè)小鼠空間探索能力的改變。

自由交替率(%)=連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同臂的次數(shù) ÷ (進(jìn)臂總次數(shù)-2)×100%

(3)

2 結(jié)果

2.1 微波輻射對(duì)小鼠海馬各亞區(qū)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 微波輻射后7 d,H.E.染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組小鼠海馬阿蒙氏角1(Cornu ammonis 1,CA1)、阿蒙氏角2(Cornu ammonis 2,CA2)、阿蒙氏角3(Cornu ammonis 3,CA3)和齒狀回(Dentate gyrus,DG)區(qū)組織結(jié)構(gòu)均基本正常(圖1A～1E);微波輻射組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)部分錐體神經(jīng)元核固縮深染,血管周圍間隙略增寬,其中CA3區(qū)組織病理學(xué)改變更為明顯;CA2和DG區(qū)組織結(jié)構(gòu)變化不明顯(圖1F～1J)。

圖1 微波輻射后小鼠海馬的組織病理學(xué)變化(H.E.染色,A和F:8×; B～E和G～J:40×)

2.2 微波輻射對(duì)小鼠海馬組織AChR亞型基因表達(dá)的影響 RT-qPCR結(jié)果如圖2所示,微波輻射后7 d,與空白對(duì)照組相比較,微波輻射組小鼠海馬組織M1和M3型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(M1-AChR,P<0.01;M3-AChR,P<0.05),M2、M4、α4和α7型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05),M5和β2型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異變化(P>0.05)。

圖2 微波輻射后小鼠海馬乙酰膽堿受體基因mRNA表達(dá)的變化

2.3 M1型AChR激活對(duì)微波輻射致小鼠認(rèn)知行為改變的影響 新物體識(shí)別試驗(yàn)結(jié)果顯示,微波輻射后7 d,與空白對(duì)照組(Con-NS組)相比,輻射對(duì)照組(MR-NS組)小鼠對(duì)新物體的DI和RI均顯著下降(P<0.05);腹腔注射M1-AChR激動(dòng)劑VU0357017 hydrochloride(VU)后,與輻射對(duì)照組相比較,輻射給藥組(MR-VU組)小鼠對(duì)新物體的DI和RI均顯著升高(P<0.05),且與Con-NS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,圖3E～3F)。Y迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示,微波輻射后7 d,各試驗(yàn)組之間小鼠的自由交替率均未見顯著性變化(P>0.05,圖3G)。

圖3 M1型乙酰膽堿受體激活對(duì)微波輻射所致小鼠認(rèn)知行為改變的影響

3 討論

流行病學(xué)研究表明,長期微波輻射暴露可導(dǎo)致頭痛、腦電波異常、神經(jīng)衰弱、記憶力減退和睡眠障礙等[2,5]。嚙齒類動(dòng)物暴露于一定條件的電磁波輻射可造成其長時(shí)記憶、短時(shí)記憶和運(yùn)動(dòng)性記憶能力下降,并伴隨興奮和焦慮等神經(jīng)行為的異常[6]。

海馬是參與學(xué)習(xí)和記憶功能的重要腦區(qū),也是電磁波輻射的敏感靶部位之一[7]。本課題組前期采用Morris水迷宮和穿梭箱行為學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2.856 GHz、8 mW/cm2、15 min的微波輻射可引起小鼠空間參考記憶能力和聯(lián)合型學(xué)習(xí)記憶能力下降,同時(shí)導(dǎo)致海馬CA3區(qū)組織病理學(xué)改變[8]。本試驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了微波輻射后海馬CA1、CA2、CA3和DG區(qū)的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)CA3區(qū)病變最為明顯,表明海馬CA3區(qū)對(duì)微波輻射較為敏感。Wang等[9]分別利用1.5 GHz、5 mW/cm2,1.5 GHz、30 mW/cm2和1.5 GHz、50 mW/cm2微波輻射大鼠6 min,以及Hasan等[10]通過2 400 MHz、738 μW/cm2射頻電磁輻射暴露小鼠40 min,均發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元固縮深染,血管周隙增寬,與本試驗(yàn)中海馬病理形態(tài)學(xué)改變特點(diǎn)基本一致。

ACh是中樞膽堿能系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì),ACh及其受體的表達(dá)調(diào)控與認(rèn)知功能密切相關(guān)[3]。AChRs可分為毒蕈堿型乙酰膽堿受體(Muscarinic acetylcholine receptors,mAChRs,主要包括M1～M5五個(gè)亞型)和煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs,主要包括α4、α7、β2和α4β2型)[11]。研究表明,mAChRs通過偶聯(lián)G蛋白進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),nAChRs通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸膜上Ca2+通道通透性而激活蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)信號(hào)通路,并調(diào)節(jié)Ca2+依賴的蛋白激酶Ⅱ而發(fā)揮作用[12-13]。關(guān)于微波輻射對(duì)海馬中AChRs的影響尚不明確。Kumar等[14]采用2.45 GHz、0.029 mW/cm2微波輻射小鼠1個(gè)月(2 h/d),發(fā)現(xiàn)輻射組小鼠海馬M1-AChR上調(diào)且AChE活性增加;Hassanshahi等[15]采用2.45 GHz、23.6 dBm微波輻射大鼠1個(gè)月(12 h/d),海馬mAChRs表達(dá)升高,AChE活性及其胞內(nèi)Ca2+濃度升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),大鼠經(jīng)2.856 GHz、8 mW/cm2、15 min微波輻射后6 h,其海馬中僅α4型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào),其余AChRs mRNA相對(duì)表達(dá)量均未見明顯變化;微波輻射后7 d,大鼠海馬M1、M3和β2型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào),α7型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)[16]。以上研究表明,一定條件的微波輻射可引起腦內(nèi)ACh合成和代謝紊亂,造成AChRs表達(dá)失調(diào)。

本試驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用微波輻射小鼠模型,確證了微波輻射后7 d,海馬M1和M3型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào),M2、M4、α4和α7型AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào),進(jìn)一步提示微波輻射可引起海馬AChRs亞基構(gòu)成比發(fā)生變化,且不同亞型AChRs對(duì)微波輻射的敏感程度存在差異,其中,微波輻射可引起海馬M1、M2、M3、M4、α4和α7型AChR基因表達(dá)異常,而對(duì)M5和β2型AChR基因表達(dá)影響不明顯。

研究表明,M1-AChR占mAChRs的50%～60%,其主要在海馬中表達(dá)[17]。M1-AChR可通過促進(jìn)谷氨酸和γ-氨基丁酸神經(jīng)傳遞而改善學(xué)習(xí)記憶[18-20]。此外,M1-AChR基因敲除小鼠在長時(shí)程增強(qiáng)中表現(xiàn)出認(rèn)知缺陷[21-22]。目前,M1-AChR已成為治療阿爾茲海默和老年癡呆癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在靶點(diǎn)[23-24]。以上研究提示,M1-AChR對(duì)學(xué)習(xí)和記憶功能具有正向調(diào)控作用。因此,可推測(cè)海馬M1-AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)可能在微波輻射致認(rèn)知行為改變中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)通過對(duì)微波輻射小鼠腹腔注射M1-AChR特異性激動(dòng)劑,并結(jié)合行為學(xué)評(píng)估其對(duì)認(rèn)知功能的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),微波輻射可導(dǎo)致小鼠新物體探究和識(shí)別記憶功能障礙,而M1-AChR激活可有效改善微波輻射所致小鼠新物體識(shí)別記憶受損,表明M1-AChR對(duì)于微波輻射所致認(rèn)知功能障礙具有重要調(diào)控作用。

綜上所述,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),微波輻射可引起海馬AChRs亞基構(gòu)成比變化和CA3區(qū)組織病理學(xué)改變,M1-AChR mRNA相對(duì)表達(dá)量于輻射后顯著下調(diào),并在微波輻射所致認(rèn)知行為功能下降中發(fā)揮重要調(diào)控作用,進(jìn)一步揭示了微波輻射致海馬結(jié)構(gòu)和功能損傷的分子機(jī)制,同時(shí)為其藥物研發(fā)和醫(yī)學(xué)防護(hù)提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)參考。