馬紅偉 , 潘華春 , 楊書敏 , 張 可 , 楊 紅 , 藺 肖 , 阮坤祥 , 李家奎

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 , 湖北 武漢430070 ; 2. 普萊柯生物工程股份有限公司 , 河南 洛陽 471000 ;3.襄陽傲農(nóng)雪生畜牧養(yǎng)殖有限公司 , 湖北 襄陽 441000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)和豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)感染廣泛存在于養(yǎng)豬業(yè)中,構(gòu)成當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病。豬瘟(Classical swine fever,CSF)亦為所有養(yǎng)殖場(chǎng)必須通過疫苗免疫進(jìn)行防控的重要病毒性疾病[1-3]。在臨床實(shí)踐中,PCV2和Mhp可共同引發(fā)豬呼吸疾病綜合征(Porcine respiratory disease syndrome,PRDC),Chen等[4]研究證實(shí),Mhp與PCV2之間存在協(xié)同感染關(guān)系,Mhp能夠加劇PCV2相關(guān)性肺臟病變的嚴(yán)重程度,增加PCV2在組織中的病毒載量。大量研究證實(shí),養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)PCV2和Mhp的感染嚴(yán)重?fù)p害了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益,阻礙了畜牧業(yè)的健康發(fā)展[5-6]。

目前,疫苗免疫是有效控制豬傳染病的手段之一。然而,復(fù)雜的免疫程序不僅對(duì)豬只造成較大的生理應(yīng)激,同時(shí)也增加了養(yǎng)殖工人的負(fù)擔(dān)。因此,在保持疫苗免疫類型不減少的前提下,如何降低免疫次數(shù)并仍可達(dá)到理想的免疫效果,成為需要深入研究的科學(xué)問題。隨著養(yǎng)豬場(chǎng)規(guī)?；潭鹊牟粩鄶U(kuò)大和非洲豬瘟感染的持續(xù)存在,聯(lián)合免疫成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的研究熱點(diǎn)。為了獲得最佳免疫方案,研究人員根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行不斷地探索。朱巧艷等[7]通過使用圓支二聯(lián)疫苗作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗免疫仔豬,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫與單獨(dú)使用圓支二聯(lián)疫苗免疫的效果相當(dāng)。陳昌海等[8]通過聯(lián)合使用豬瘟活疫苗和豬口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗免疫豬只,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫不僅不影響抗體產(chǎn)生,而且能夠維持抗體在豬群個(gè)體間的穩(wěn)定分布。翟路峰等[9]使用副豬嗜血桿菌滅活疫苗作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗免疫仔豬,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫組的中和抗體水平與單獨(dú)免疫組無顯著差異,為簡(jiǎn)化疫苗免疫程序提供了實(shí)質(zhì)性的臨床參考依據(jù)。車巧林等[10]研究發(fā)現(xiàn),在使用圓環(huán)-支原體二聯(lián)疫苗免疫豬只后,PCV2抗原對(duì)豬Mhp免疫產(chǎn)生了增強(qiáng)作用。陳昌海等[11]研究發(fā)現(xiàn),PCV2疫苗和CSF活疫苗的聯(lián)合免疫不會(huì)影響相應(yīng)抗體的產(chǎn)生,并促進(jìn)了這2種疫苗抗體在豬群中的穩(wěn)定分布。綜上所述,聯(lián)合免疫在豬場(chǎng)免疫中具有降低人工成本,提高經(jīng)濟(jì)效益的重要意義,且簡(jiǎn)化了免疫程序。

值得關(guān)注的是,目前尚未見到關(guān)于將豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體和豬瘟疫苗采用聯(lián)合免疫的方式,在懷孕后期母豬中免疫,并在其所產(chǎn)的仔豬中進(jìn)行免疫的大規(guī)模田間研究報(bào)道。本試驗(yàn)將豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗與豬肺炎支原體滅活疫苗混合作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗,對(duì)產(chǎn)前1個(gè)月左右的母豬進(jìn)行免疫,并對(duì)其所產(chǎn)仔豬于21日齡時(shí)同時(shí)免疫這3種疫苗,以母豬單獨(dú)接受圓-支二聯(lián)苗和豬瘟活疫苗免疫為對(duì)照組,通過監(jiān)測(cè)免疫后臨床指標(biāo)、生產(chǎn)性能和持續(xù)性抗體水平,評(píng)估聯(lián)合免疫與傳統(tǒng)免疫的實(shí)際免疫效果,旨在為優(yōu)化疫苗免疫程序提供可靠的臨床參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗 試驗(yàn)疫苗由普萊柯生物工程股份有限公司提供,對(duì)照品圓-支二聯(lián)疫苗購(gòu)自洛陽惠中生物技術(shù)有限公司。疫苗信息見表1。

表1 疫苗信息

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)分組 從襄陽傲農(nóng)雪生畜牧養(yǎng)殖有限公司選取364 頭處于產(chǎn)前1個(gè)月的四胎次健康三元母豬,做好耳標(biāo),隨機(jī)分為A組(240 頭,聯(lián)合免疫組:圓柯欣、柯喘寧和穩(wěn)柯健3種疫苗聯(lián)合免疫)和B組(124 頭,對(duì)照組:圓-支二聯(lián)疫苗和穩(wěn)柯健疫苗分別免疫)。試驗(yàn)期間豬只的飼養(yǎng)、管理和保健按公司日常管理程序進(jìn)行。

1.2.2 疫苗免疫方案 試驗(yàn)從母豬產(chǎn)前1個(gè)月免疫疫苗開始,到仔豬50日齡時(shí)結(jié)束,持續(xù)77 d。A組(聯(lián)合免疫組)所有母豬在產(chǎn)前27 d 聯(lián)合免疫穩(wěn)柯健、圓柯欣和柯喘寧,母豬生產(chǎn)后,其所產(chǎn)仔豬在21日齡時(shí)聯(lián)合免疫穩(wěn)柯健、圓柯欣和柯喘寧;B組所有母豬在產(chǎn)前34 d免疫穩(wěn)柯健,產(chǎn)前27 d免疫圓-支二聯(lián)疫苗,其所產(chǎn)仔豬在14日齡免疫圓-支二聯(lián)疫苗,28日齡免疫穩(wěn)柯健。所有仔豬在1日齡進(jìn)行偽狂犬病活疫苗(普寧)滴鼻免疫并注射保健針,7日齡免疫高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株),35日齡時(shí)注射偽狂犬病活疫苗(普寧)(表2)。

表2 疫苗免疫方案

1.2.3 樣品采集和指標(biāo)分析

1.2.3.1 臨床指標(biāo) 觀察、記錄并統(tǒng)計(jì)疫苗免疫后2個(gè)組母豬體溫、應(yīng)激(嘔吐、發(fā)燒、精神沉郁)、采食和哺乳情況,仔豬體溫、應(yīng)激(嘔吐、發(fā)燒、精神沉郁)、采食和呼吸道疾病發(fā)生情況。

1.2.3.2 生產(chǎn)性能 統(tǒng)計(jì)分析2個(gè)組母豬的窩產(chǎn)健仔數(shù)和出生健仔均重,仔豬的日增重和死淘率。

1.2.3.3 持續(xù)性抗體水平 采集 A組和B組的母豬和仔豬的血液(表3),靜置2～3 h,3 000 r/min離心15 min分離血清,委托第三方專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)洛陽中科基因檢測(cè)診斷中心有限公司,對(duì)免疫后豬只抗體進(jìn)行檢測(cè),并出具檢測(cè)報(bào)告。用阻斷率(Percentage inhibition,PI)值表示CSFV抗體陽性率,樣品光密度(Optical density,OD)值與陽性對(duì)照品OD值的比值(Sample/Positive,S/P)表示PCV2抗體水平。

表3 血液樣本采集時(shí)間和數(shù)量

1.3 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 26.0軟件中的單因素ANOVA檢驗(yàn)對(duì)各組的ELISA檢測(cè)結(jié)果平均值進(jìn)行差異顯著性比較。用Excel進(jìn)行作圖,數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”方式表示。

2 結(jié)果

2.1 臨床指標(biāo)分析 免疫后2個(gè)組母豬采食和哺乳情況均正常,未出現(xiàn)免疫應(yīng)激和其他嚴(yán)重副反應(yīng),所有豬只體溫均正常。免疫疫苗后,除A組有1頭仔豬出現(xiàn)昏厥,B組有5 頭仔豬出現(xiàn)輕微嘔吐情況外,其他仔豬均未出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫應(yīng)激情況,且出現(xiàn)免疫應(yīng)激的仔豬在緊急采取冷水沖頭后,癥狀很快得到緩解;在試驗(yàn)期間內(nèi),2個(gè)組仔豬免疫后整體精神狀態(tài)良好,采食情況正常,體溫正常,均未出現(xiàn)咳嗽和喘氣等呼吸道疾病。

2.2 生產(chǎn)性能分析 結(jié)果如表4所示,A組和B組母豬的窩產(chǎn)健仔數(shù)、出生健仔均重分別是12.29頭/窩、1.37 kg/頭和12.32頭/窩、1.38 kg/頭,基本一致;A組和B組仔豬出生至23日齡死淘率、出生至50日齡死淘率分別為3.77%、5.11%和4.07%、5.43%。

表4 各組母豬和仔豬的生產(chǎn)性能

2.3 母豬CSFV抗體陽性率檢測(cè) 結(jié)果如表5和圖1所示,A組和B組母豬在產(chǎn)前免疫豬瘟活疫苗,2個(gè)組母豬的CSFV抗體陽性率在生產(chǎn)當(dāng)天(0 d)、生產(chǎn)第14 天(14 d)、生產(chǎn)第21 天(21 d)和生產(chǎn)第35 天(35 d)均無明顯差異(P>0.05),且均高于70%,遠(yuǎn)高于保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)>40%[12];2個(gè)組母豬的整體免疫保護(hù)率均在90%以上,且無明顯差異(P>0.05),說明該豬瘟活疫苗免疫原性很好,均能刺激豬只產(chǎn)生合格的中和抗體;SD值表示標(biāo)準(zhǔn)差,體現(xiàn)的是群體內(nèi)個(gè)體間抗體效價(jià)的差異程度,2個(gè)組母豬在免疫后的幾次檢測(cè)中,A組母豬的CSFV抗體SD值均要小于B組。

圖1 各組母豬豬瘟病毒抗體陽性率變化趨勢(shì)

表5 各組母豬豬瘟病毒抗體陽性率和免疫保護(hù)率

2.4 母豬PCV2抗體檢測(cè) 結(jié)果如表6和圖2所示,在生產(chǎn)當(dāng)天(0 d)時(shí),A組母豬的PCV2抗體S/P值極顯著高于B組(P<0.01);在生產(chǎn)第14 天(14 d)時(shí),A組母豬的PCV2抗體S/P值顯著高于B組(P<0.05);在生產(chǎn)第21 天(21 d)和生產(chǎn)第35天(35 d)時(shí),2個(gè)組無顯著差異(P>0.05);除生產(chǎn)第35天(35 d)外,A組母豬各監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的PCV2抗體SD值均小于B組母豬。

圖2 各組母豬圓環(huán)病毒2型抗體變化趨勢(shì)

表6 各組母豬豬圓環(huán)病毒2型抗體水平和免疫保護(hù)率

2.5 仔豬CSFV抗體檢測(cè) 結(jié)果如表7和圖3所示,A組和B組仔豬的CSFV母源抗體陽性率在14日齡均遠(yuǎn)高于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[12],維持在非常高的水平,且A組仔豬的CSFV母源抗體陽性率顯著高于B組(P<0.05);A組和B組仔豬在21、35和50日齡的CSFV抗體陽性率無顯著差異(P>0.05),但均高于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[12];A組和B組在整個(gè)試驗(yàn)周期中的免疫保護(hù)率均達(dá)到100%。

圖3 各組仔豬豬瘟病毒抗體陽性率變化趨勢(shì)

表7 各組仔豬豬瘟病毒抗體陽性率和免疫保護(hù)率

2.6 仔豬PCV2抗體檢測(cè) 結(jié)果如表8和圖4所示,A組和B組仔豬各階段PCV2抗體S/P值均>0.50,表明仔豬均處于穩(wěn)定或良好的免疫狀態(tài);在整個(gè)監(jiān)測(cè)期間,A組仔豬PCV2抗體平均值在14和21日齡均顯著高于B組(P<0.05);21日齡時(shí),B組仔豬的PCV2抗體平均值出現(xiàn)明顯的下降,疫苗免疫保護(hù)率為91.67%(11/12),2個(gè)組其他日齡仔豬的抗體免疫保護(hù)率均達(dá)100%。A組仔豬PCV2抗體水平表現(xiàn)得更為穩(wěn)定。

圖4 各組仔豬圓環(huán)病毒2型抗體變化趨勢(shì)

表8 各組仔豬圓環(huán)病毒2型抗體水平和免疫保護(hù)率

3 討論

在本試驗(yàn)中,A組(聯(lián)合免疫組)與B組(對(duì)照組)豬只被分別飼養(yǎng)在兩棟獨(dú)立且相鄰的圈舍中,由專職員工進(jìn)行飼養(yǎng)。同時(shí),試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)不影響豬場(chǎng)正常的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和管理,養(yǎng)殖過程按照豬場(chǎng)正常的流程化制度進(jìn)行。在整個(gè)試驗(yàn)周期中,豬場(chǎng)未發(fā)生烈性傳染病和嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病,可最大程度排除其他因素對(duì)本次試驗(yàn)結(jié)果的干擾。在本試驗(yàn)中,A組(聯(lián)合免疫組)的仔豬在接受疫苗免疫時(shí)總應(yīng)激次數(shù)僅有1次,明顯低于B組(對(duì)照組)總應(yīng)激次數(shù)5次;2個(gè)組母豬的窩產(chǎn)健仔數(shù)和出生健仔均重?zé)o差異。但在仔豬23日齡斷奶時(shí),A組仔豬的死淘率較B組仔豬低0.3%,且A組仔豬斷奶均重比B組仔豬多160 g/頭,A組仔豬相對(duì)于B組仔豬在死淘率和生長(zhǎng)速度方面略顯優(yōu)勢(shì),這與陳昌海等[11]的試驗(yàn)結(jié)果相符。A組仔豬采取聯(lián)合免疫,1次完成3種疫苗的免疫,而B組仔豬則采取2次免疫,豬只的應(yīng)激次數(shù)較A組大,可能是B組仔豬死淘率增加和生長(zhǎng)速度略微降低的原因之一。以每頭母豬每年產(chǎn)仔2.5 胎次,每胎產(chǎn)仔豬12頭為例,1個(gè)萬頭母豬養(yǎng)殖場(chǎng),仔豬23日齡斷奶死淘率降低0.3%來計(jì)算,若采用聯(lián)合免疫策略,每年可增加存活仔豬約900 頭,因此,規(guī)模養(yǎng)殖集約化生產(chǎn)中,聯(lián)合免疫策略具有提高經(jīng)濟(jì)效益的潛力。

本試驗(yàn)期間,A組和B組母豬均在產(chǎn)前1個(gè)月接受豬瘟活疫苗免疫,2個(gè)組母豬的CSFV抗體陽性率無明顯差異。值得注意的是,仔豬在14日齡時(shí),A組仔豬的CSFV母源抗體陽性率顯著高于B組仔豬,高水平的母源抗體可能預(yù)示著更強(qiáng)的免疫保護(hù)效力,然而在仔豬21、35和50日齡3個(gè)階段,2個(gè)組仔豬的CSFV抗體陽性率并未顯示出明顯差異,而且豬瘟活疫苗對(duì)仔豬的免疫保護(hù)率均維持在極高的水平,這說明A組仔豬在21日齡采取聯(lián)合免疫豬瘟活疫苗,與B組仔豬在28日齡采取的單獨(dú)免疫豬瘟活疫苗,2種免疫方案對(duì)誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生自身CSFV抗體并無明顯差別。

張敬峰等[13]等研究發(fā)現(xiàn),豬圓環(huán)病毒的感染會(huì)對(duì)豬的免疫系統(tǒng)造成損害,從而抑制豬瘟活疫苗的免疫應(yīng)答,而PCV2陽性場(chǎng),免疫PCV2疫苗能夠明顯增強(qiáng)CSF活疫苗的免疫效果。研究還發(fā)現(xiàn),豬只從免疫PCV2疫苗到形成自身強(qiáng)大免疫保護(hù)所需的時(shí)間為14 d[9,10,13],而在仔豬21日齡后,PCV2母源抗體陽性率下降加快,因此建議仔豬在21日齡之前免疫PCV2疫苗[14-16]。在本試驗(yàn)中,A組和B組母豬均在產(chǎn)前27 d免疫PCV2疫苗,均成功誘導(dǎo)了高水平的PCV2抗體。然而,在仔豬14和21日齡時(shí),A組母豬所產(chǎn)仔豬獲得的PCV2母源抗體要顯著高于B組仔豬,表明A組母豬免疫PCV2疫苗后產(chǎn)生的PCV2抗體顯著高于B組。高水平的母源抗體預(yù)示著更強(qiáng)的免疫保護(hù),推測(cè)是B組仔豬在14日齡免疫PCV2疫苗,高水平的PCV2母源抗體可能干擾了外源性PCV2疫苗在體內(nèi)的正常增殖所致。但是,在仔豬35和50日齡2個(gè)階段,A組和B組仔豬PCV2抗體均維持在良好的抗體保護(hù)水平,且兩組無顯著差異,表明針對(duì)該P(yáng)CV2疫苗,聯(lián)合免疫與單獨(dú)免疫對(duì)誘導(dǎo)豬只產(chǎn)生高水平的PCV2抗體保護(hù)效果是相似的。這一發(fā)現(xiàn)與車巧林等[10]和陳昌海等[11]研究結(jié)論一致。同時(shí)本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),母豬在產(chǎn)前27 d免疫PCV2疫苗,仔豬在21日齡免疫PCV2疫苗是合理且可行的,與相關(guān)研究結(jié)論一致[17-18]。

大量研究證實(shí),在仔豬7～21日齡期間進(jìn)行豬肺炎支原體疫苗免疫,能夠有效控制豬只在早期感染支原體肺炎,進(jìn)而提升生產(chǎn)性能[19]。Takeuti等[20]研究發(fā)現(xiàn),對(duì)母豬定期免疫支原體疫苗可降低豬群的感染壓力,減少向環(huán)境排放細(xì)菌的數(shù)量,從而降低對(duì)仔豬的感染風(fēng)險(xiǎn)。Wallgren等[21]和Arsenakis等[22]研究表明,在母豬妊娠后期(至少在產(chǎn)前4周)免疫支原體疫苗,有助于減少仔豬斷奶時(shí)豬肺炎支原體的定殖,顯著減少由支原體引起的仔豬呼吸道疾病。由于豬肺炎支原體的免疫逃逸和滯后的血清學(xué)反應(yīng)特性,通常在感染后3～8 周才能檢測(cè)到豬肺炎支原體的特異性抗體[23]。研究發(fā)現(xiàn),支原體肺炎感染主要局限于呼吸道,很少進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)系統(tǒng),即使機(jī)體產(chǎn)生了抗體,體液中的高水平抗體也無法直接與病原體發(fā)生中和作用[24]。因此,目前市場(chǎng)上售賣的多款針對(duì)豬肺炎支原體的抗體檢測(cè)試劑盒無法區(qū)分母源抗體和疫苗抗體[1],豬肺炎支原體抗體檢測(cè)試劑盒基本上不作為豬場(chǎng)支原體肺炎疫苗保護(hù)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。在本次試驗(yàn)中,盡管未進(jìn)行支原體抗體水平的相關(guān)監(jiān)測(cè),但通過對(duì)豬只咳嗽和氣喘等呼吸道癥狀的觀察,發(fā)現(xiàn)在整個(gè)試驗(yàn)期間,2個(gè)組仔豬在呼吸道疾病方面均未出現(xiàn)異常情況。

綜上所述,本試驗(yàn)對(duì)母豬及所產(chǎn)仔豬進(jìn)行CSFV和PCV2抗體檢測(cè),結(jié)合仔豬臨床呼吸道癥狀觀察,發(fā)現(xiàn)豬瘟活疫苗(穩(wěn)柯健)、豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗(圓柯欣)和豬肺炎支原體滅活疫苗(柯喘寧)這3種疫苗可以采取聯(lián)合免疫方案,彼此之間并不產(chǎn)生干擾。鑒于非洲豬瘟大環(huán)境和規(guī)模養(yǎng)殖集約化趨勢(shì)下,本試驗(yàn)在豬場(chǎng)原有免疫基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化豬群免疫程序,在不影響規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的正常生產(chǎn)運(yùn)營(yíng)前提下,進(jìn)行了大規(guī)模的田間研究,取得了良好的效果。本試驗(yàn)通過簡(jiǎn)化免疫程序,降低豬只與人和物的接觸,減低感染風(fēng)險(xiǎn),這對(duì)于提高豬場(chǎng)的生產(chǎn)效益具有切實(shí)的現(xiàn)實(shí)意義。