葛玉杰 , 王黎霞 , 王詩琪 , 石夢云 , 陳玲玲 , 王夢琦 , 于 慧 , 張建軍 , 安 健

(1. 北京農(nóng)學院動物科學技術學院 , 北京 昌平 102206 ; 2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院動物科技學院 , 北京 房山 102442)

雞球蟲病是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲病,主要損害雞的腸道部位,在家禽養(yǎng)殖業(yè)中時常出現(xiàn),尤其是在集約化養(yǎng)殖場中最易暴發(fā),發(fā)病率可達50%～70%[1],嚴重影響了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟收益。細胞凋亡是一種高度調(diào)控的細胞死亡方式,在面對病原體感染時,宿主細胞為了抑制病原體在體內(nèi)的增殖會啟動細胞凋亡,以此保護正常的細胞[2-3]。胞內(nèi)寄生蟲會通過一些途徑和機制來抑制宿主細胞的凋亡,逃避宿主細胞防御系統(tǒng)的殺傷作用,為自身在宿主細胞的生存和增殖提供有利的條件[4-5]。目前的研究表明,弓形蟲可通過干擾半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)級聯(lián)反應、促進核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcription factor κB,NF-κB)活化、抑制線粒體細胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)釋放等途徑抑制宿主細胞的凋亡[4]。柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)裂殖子在入侵馬-達氏牛腎(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)細胞早期可通過線粒體通路和NF-κB信號通路抑制宿主細胞凋亡[6],堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)裂殖子在入侵MDBK細胞早期也有類似于柔嫩艾美耳球蟲裂殖子抑制MDBK細胞凋亡的機制[7]。然而,關于堆型艾美耳球蟲裂殖子與細胞在不直接接觸的情況下,對細胞凋亡影響的研究罕有報道。因此,本試驗使用Transwell小室將堆型艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細胞相互隔開,共培養(yǎng)不同的時間點,檢測細胞凋亡的情況,并對共培養(yǎng)6 h的細胞上清液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析鑒定,初步確定堆型艾美耳球蟲裂殖子是否會釋放外分泌蛋白抑制細胞凋亡,為進一步探究球蟲外分泌蛋白調(diào)節(jié)宿主細胞凋亡的作用和機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基,購自北京愛普銳晟科技有限公司;胎牛血清(Fetal bovin serum,FBS),購自賽默飛世爾科學(美國)科技有限公司;胰蛋白酶粉、雙抗和PBS,均購自索萊寶生物科技有限公司;層析柱,購自思拓凡公司;DEAE-52纖維素、0.1 moL/L氯化氫(HCl)和0.1 mol /L氫氧化鈉(NaOH),均購自北京博奧拓達科技有限公司。

1.2 主要儀器 100和200目標準分樣篩,均購自紹興市上虞區(qū)豪泉篩具廠;勻漿機,購自九陽股份有限公司;血球計數(shù)板,購自上海求精生化試劑儀器有限公司;Transwell小室(孔徑0.4 μm),購自美國Corning公司;倒置顯微鏡,購自美國Scilogex公司;細胞培養(yǎng)箱,購自三洋公司。

1.3 實驗動物、細胞株和蟲株 1日齡白羽肉雞,購自北京市華都峪口禽業(yè)有限公司,在經(jīng)高溫滅菌后的房間內(nèi)飼養(yǎng)至14日齡。MDBK細胞,由北京農(nóng)學院獸醫(yī)病理學實驗室保存。堆型艾美耳球蟲蟲株,由中國農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)寄生蟲實驗室惠贈。

1.4 試驗方法

1.4.1 堆型艾美耳球蟲裂殖子的分離純化 參照參考文獻[8]的方法,取14日齡的雛雞,每只雞感染2×105個堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊,感染74 h后脫頸致死雛雞,取十二指腸,在預冷的洗脫液中刮取腸道黏膜,勻漿3 min,依次使用100和200目標準分樣篩過濾。濾液于1 500 r/min離心10 min,棄去上清液;用預熱的洗脫液重懸沉淀,于600 r/min離心8 min,收集上清以去除紅細胞等雜質(zhì);最后于1 500 r/min離心10 min,收集沉淀,用預熱的洗脫液重懸。提前活化的DEAE-52纖維素加入適量預熱的洗脫液混勻倒入直徑1 cm、高約30 cm的層析柱中,纖維層析柱高約14 cm。將裂殖子重懸液緩慢均勻的沿著玻璃棒加入纖維層析柱中,用試管收集游過層析柱的裂殖子,用于后續(xù)試驗。

1.4.2 試驗分組和處理 取出液氮中凍存的MDBK細胞并進行復蘇傳代,傳至第3代后以每孔3.5×105個/mL的密度均勻鋪至6孔板,培養(yǎng)24 h后,6孔板中架設Transwell小室,6孔板每孔被分為上室和下室兩部分。試驗設置3個時間點,分別為共培養(yǎng)1.5、3和6 h,每個時間點分為2個組,共培養(yǎng)組(Co-culture group,上室加入0.5 mL約含有1.4×106個堆型艾美耳球蟲裂殖子的洗脫液)和對照組(Control group,上室加入0.5 mL洗脫液)。以上所有試驗均設3組重復。

1.4.3 細胞凋亡檢測 分別在共培養(yǎng)1.5、3和6 h三個時間點收集共培養(yǎng)組和對照組的細胞,于1 000 r/min離心5 min,將各組的細胞收集至1.5 mL離心管,重懸至Binding Buffer中,加入PI和Annexin-V-FITC溶液,避光室溫孵育15 min,用流式細胞儀進行熒光檢測。

1.4.4 LC-MS/MS分析 MDBK細胞培養(yǎng)24 h后,將舊的細胞培養(yǎng)基換成不含雙抗和血清的高糖DMEM,架設Transwell小室,上室加入同1.4.2等量的堆型艾美耳球蟲裂殖子。共培養(yǎng)6 h后,收集細胞培養(yǎng)上清液進行LC-MS/MS檢測,質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MaxQuant(V1.6.6)軟件進行檢索,采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法是Andromeda;通過與Uniprot數(shù)據(jù)庫中堆型艾美耳球蟲的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫進行比對,鑒定樣品液中的蛋白質(zhì)成分。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用Graphpad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計作圖,SPASS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示,采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 細胞凋亡檢測 結(jié)果顯示,1.5 h對照組總細胞凋亡率為(6.70±0.13)%,1.5 h共培養(yǎng)組總細胞凋亡率為(5.92±0.19)%;3 h對照組總細胞凋亡率為(10.10±0.32)%,3 h共培養(yǎng)組總細胞凋亡率為(8.13±0.32)%;6 h對照組總細胞凋亡率為(13.33±0.13)%,6 h共培養(yǎng)組總細胞凋亡率為(11.57±0.37)%(表1)。在共培養(yǎng)不同時間點,共培養(yǎng)組的總細胞凋亡率均極顯著低于對照組(P<0.01)(圖1)。

圖1 對照組與共培養(yǎng)組在不同時間點的總細胞凋亡率

表1 各組細胞凋亡情況

2.2 LC-MS/MS分析 細胞培養(yǎng)液上清通過LC-MS/MS檢測,與Uniprot數(shù)據(jù)庫中堆型艾美耳球蟲的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫進行比對,共鑒定到65個外分泌蛋白,其中23個蛋白具有定量信息(圖2)。定量蛋白包括3個熱休克蛋白、1個微線蛋白、3個生化代謝酶相關蛋白、2個能量合成蛋白、1個蛋白磷酸酶、1個14-3-3蛋白、1個組蛋白、1個肌動蛋白、1個延伸因子、1個真核翻譯起始因子和4個假定蛋白等(表2)。

圖2 LC-MS/MS分析鑒定結(jié)果

表2 定量蛋白的鑒定結(jié)果

3 討論

流式細胞術具有分析細胞量大、操作簡捷和敏感性好等優(yōu)點,成為了研究細胞凋亡的重要方法之一,可準確檢測出細胞凋亡過程中各階段的情況[9]。Transwell小室可用于建立細胞共培養(yǎng)體系,研究細胞培養(yǎng)液中的成分對細胞生長和運動等的影響[10]。雞球蟲體外入侵試驗研究發(fā)現(xiàn),柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲裂殖子均可以抑制凋亡誘導劑(6%乙醇)誘導的細胞凋亡[7,11]。鄭新楓等[12]將柔嫩艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細胞共培養(yǎng)12 h,發(fā)現(xiàn)宿主細胞的Caspase2、3、6、8和9酶活性與對照組相比均顯著降低,細胞凋亡受到抑制。本試驗結(jié)果顯示,堆型艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細胞間接共培養(yǎng)6 h內(nèi)均可極顯著抑制細胞凋亡。以上試驗結(jié)果說明堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲可通過相似的作用方式調(diào)控宿主細胞的凋亡,為自身在宿主體內(nèi)進行長期且持續(xù)的慢性感染提供保障。

王騰[13]使用Transwell小室將弓形蟲與神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs)共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)弓形蟲排泄分泌抗原(Excretory/secretory antigens,ESA)可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號途徑誘導NSCs發(fā)生凋亡。毒害艾美耳球蟲外泌體(Exosome,Exo)能抑制雞胚成纖維(Chicken UMNSAH/DF-1,DF-1)細胞發(fā)生凋亡,此外,Exo中的鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)能促進DF-1細胞的增殖,抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的細胞凋亡[14]。本試驗使用Transwell小室建立間接共培養(yǎng)體系,堆型艾美耳球蟲裂殖子未直接接觸MDBK細胞,鑒定的外分泌蛋白包括熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)、微線蛋白(Microneme protein,MIC)、14-3-3蛋白和假定蛋白(Hypothetical protein,HP)等,推測堆型艾美耳球蟲可能通過釋放外分泌蛋白抑制細胞凋亡。

外分泌蛋白在胞內(nèi)寄生蟲與宿主細胞相互作用中發(fā)揮著至關重要的作用[15]。弓形蟲外分泌蛋白棒狀體蛋白18(Rhoptry protein 18,ROP18)可通過線粒體通路抑制宿主細胞凋亡[16];柔嫩艾美耳球蟲外分泌蛋白HP可以誘導雞巨噬細胞發(fā)生凋亡,尤其是早期的細胞凋亡[17]。柔嫩艾美耳球蟲和犬新孢子蟲均能夠通過含EGF樣結(jié)構域的微線蛋白(Microneme protein containing EGF domain,EGF-MIC)與宿主表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor,EGFR)相互作用,激活宿主EGFR信號轉(zhuǎn)導,介導絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB) 等信號通路,進一步調(diào)控細胞增殖、凋亡和自噬等生理過程[18-19]。胞內(nèi)寄生蟲HSP90能夠與凋亡活化因子-1(Apoptosis active factor-1,Apaf-1)結(jié)合,在Cyt-C釋放、凋亡體復合物形成和Caspase啟動等多個方面發(fā)揮抗凋亡作用[20]。李文桂等[21]研究表明,多房棘球絳蟲重組BCG-Em14-3-3疫苗能夠抑制感染小鼠脾細胞的凋亡。綜上所述,本試驗堆型艾美耳球蟲裂殖子對MDBK細胞凋亡的抑制與鑒定的外分泌蛋白密切相關,后續(xù)將對篩選的蛋白在細胞凋亡調(diào)節(jié)相關通路中發(fā)揮的作用和機制進行探究。