唐亞新，胡巧云，唐小明，王衛(wèi)國(guó)，彭 志，謝怡靈，張 坤，王昌建，魯杏華，范仲鑫，黎滿(mǎn)香

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410014）

豬瘟（classical swine fever，CSF）、豬偽狂犬病（pseudorabies，PR）、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）均為高度接觸性傳染病，感染后嚴(yán)重影響豬群健康，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。PR 是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的，豬只感染后通常表現(xiàn)呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等臨床癥狀。PR 流行具有一定規(guī)律性，目前大規(guī)模流行已得到有效控制，主要為零星散發(fā)[2-3]。CSF 是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率均較高。CSF 流行沒(méi)有季節(jié)性特點(diǎn)，過(guò)去以暴發(fā)性流行為主，近年來(lái)轉(zhuǎn)變?yōu)榈貐^(qū)性散發(fā)流行，且具有一定周期性（一般為3～4 年）[3]。PRRS 的致病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），1996 年中國(guó)大陸首次分離到PRRSV，2006 年暴發(fā)了以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS），給養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大損失[4-5]。2012年，與美國(guó)NADC30 毒株基因組結(jié)構(gòu)類(lèi)似的PRRSV開(kāi)始在我國(guó)出現(xiàn)，臨床被命名為類(lèi)NADC30 毒株[6]，其極易與其他毒株重組，且重組機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)己成為威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要毒株類(lèi)型之一。2017 年我國(guó)首次報(bào)道并分離到類(lèi)NADC34 毒株，該毒株有發(fā)展為優(yōu)勢(shì)毒株的趨勢(shì)[7]，目前市場(chǎng)上所用的商品化疫苗對(duì)該毒株不能形成較好的交叉保護(hù)力，這給PRRS 綜合防控帶來(lái)了一定困難[8]。

為了解湖南省2021—2023 年無(wú)害化處理場(chǎng)病死豬CSFV、PRV、PRRSV 污染情況，對(duì)1 825 份組織樣品進(jìn)行了CSFV、PRV、PRRSV 檢測(cè)，并對(duì)2022 年衡南縣陽(yáng)性樣品進(jìn)行了分型及Nsp2基因測(cè)序，以期為養(yǎng)殖場(chǎng)疫病防控與診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集湖南省14 個(gè)市州無(wú)害化處理場(chǎng)病死豬淋巴結(jié)、脾臟與耳尖等組織共1 825 份（每頭豬采集其中1 種樣品）。其中，2021 年從10 個(gè)市州共采集樣品386 份，衡陽(yáng)市選取2 個(gè)場(chǎng)采集樣品80份，其余市州各選取1個(gè)場(chǎng)采集樣品20～40份，全年采樣1 次；2022 年從8 個(gè)市州共采集樣品352份，從衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)每月采集樣本約20 份，共采集257 份，其余市州各選取1 個(gè)場(chǎng)采集樣品10～15 份，全年采樣1 次；2023 年從14 個(gè)市州共采集樣品1 087 份，每個(gè)市州選取1～2 個(gè)場(chǎng)，每個(gè)場(chǎng)每月采集樣品10 份。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 14 個(gè)市州無(wú)害化處理場(chǎng)采集樣品種類(lèi)及數(shù)量 單位：份

1.1.2 主要試劑 病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購(gòu)自西安天隆科技有限公司；非洲豬瘟病毒（ASFV）、PRV、CSFV、PRRSV 四通道RT-qPCR 檢測(cè)試劑盒（TG119），NA-PRRSV、HP-PRRSV、類(lèi)NADC30 毒株三通道RT-qPCR 檢測(cè)試劑盒（TG120），購(gòu)自湖南國(guó)測(cè)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；2×TransStart Fast Pfu PCR SuperMix，購(gòu)自北京全式金生物有限公司；6×Loading Buffer、DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取組織樣品0.2 g 置于2 mL 離心管中，加入1.0 mL 生理鹽水，置于組織研磨儀中震蕩30 s，8 000g離心3 min 后取上清，按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA/DNA。

1.2.2 病原檢測(cè) 將提取的RNA/DNA 模板用ASFV、PRV、CSFV、PRRSV 四通道RT-qPCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行CSFV、PRV、PRRSV 檢測(cè)，操作步驟與反應(yīng)條件參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每次檢測(cè)均設(shè)置陰性與陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：Ct ≤37 為陽(yáng)性，Ct ≥40 為陰性，37 ＜Ct ＜40 為可疑，需重提核酸復(fù)核，若與之前結(jié)果一致則判為陽(yáng)性。

1.2.3 PRRSV 分型檢測(cè) 對(duì)衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)PRRSV 陽(yáng)性樣品用NA-PRRSV、HP-PRRSV、類(lèi)NADC30 毒株三通道RT-qPCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分型檢測(cè)。

1.2.4 PRRSVNsp2基因PCR 擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[9]合成PRRSVNsp2基因引物，對(duì)20 份衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)PRRSV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行Nsp2基因擴(kuò)增。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)體系：2×TransStart Fast Pfu PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 模板3.0 μL，DEPC 水7.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增的目的片段分別為經(jīng)典株1 067 bp、HP-PRRSV 967 bp、類(lèi)NADC30 毒株670 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物（長(zhǎng)沙）有限公司測(cè)序。

1.2.5 PRRSVNsp2基因遺傳進(jìn)化分析 用MEGA 5 軟件對(duì)2022 年衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)PRRSV 陽(yáng)性樣品Nsp2基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 CSFV、PRV、PRRSV 污染情況

2.1.1 單重污染 結(jié)果（表2）顯示：1 825 份無(wú)害化處理場(chǎng)病死豬樣品的CSFV、PRV、PRRSV陽(yáng)性檢出率分別為3.01%、1.81%、30.14%。CSFV 檢出率較低，其中2023 年檢出率略高，為3.58%；PRRSV 檢出率遠(yuǎn)高于CSFV 和PRV，檢出率逐年升高，2023 年檢出率達(dá)到38.45%。

表2 CSFV、PRV、PRRSV 陽(yáng)性檢出率 單位：%

2.1.2 雙重及三重污染 結(jié)果（表3）顯示：2021—2022 年未檢出三重混合污染，2023 年檢出1 例三重混合污染，三重污染率為0.05%；2021—2023 年分別檢出2 例、5 例、39 例雙重污染，呈逐年上升趨勢(shì)，平均雙重污染率為2.52%（46/1 825），且大多是PRRSV 與其他2 種病原的混合污染。

表3 雙重及三重污染率 單位：%

2.2 衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)檢測(cè)

2.2.1 PRRSV 檢測(cè) 對(duì)2022 年衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)采集的257 份組織樣本進(jìn)行PRRSV 檢測(cè)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性檢出率為24.12%（62/257），以春、冬季陽(yáng)性率較高，分別為38.71%（24/62）、24.19%（15/62），夏季為20.97%（13/62），秋季為16.12%（10/62）。

2.2.2 PRRSV 分型 對(duì)衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)62 份陽(yáng)性樣品進(jìn)行NA-PRRSV、HP-PRRSV、類(lèi)NADC30 毒株分型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NA-PRRSV、類(lèi)NADC30 毒株、HP-PRRSV 陽(yáng)性檢出率分別為98.39%（61/62）、43.55%（27/62）、20.97%（13/62）。

2.2.3 PRRSVNsp2基因擴(kuò)增 以20 份衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)PRRSV 陽(yáng)性樣品為模板，進(jìn)行Nsp2基因擴(kuò)增。結(jié)果（圖1）顯示，分別在967、670 bp 處得到與預(yù)期大小一致的目的片段。經(jīng)MegAlign 軟件比對(duì)分析，1 條序列存在“1+29”個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失，與HP-PRRSV 特征一致；17 條序列存在“111+1+19”個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失，與類(lèi)NADC30 毒株特征一致。

M. DL 2 000 Marker；1. 陰性對(duì)照；6、18、23、24、29、30、31. 陽(yáng)性樣本。圖1 PRRSV-Nsp2 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.4 PRRSVNsp2基因遺傳進(jìn)化分析 結(jié)果（圖2）顯示：6 號(hào)樣本與HP-PRRSV 代表株HUN4、JXA1 聚為1 個(gè)分支；17 條序列與類(lèi)NADC30 毒株聚為1 個(gè)大分支，在該大分支內(nèi)又分別聚為4 個(gè)小分支，且46 號(hào)樣本單獨(dú)聚為1 個(gè)分支，2 號(hào)樣本與WUH5 親緣關(guān)系較近。

●為樣本序列。圖2 PRRSV-Nsp2 遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 分析與討論

本試驗(yàn)對(duì)2021—2023 年湖南省無(wú)害化處理場(chǎng)病死豬進(jìn)行采樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CSFV、PRV、PRRSV的陽(yáng)性檢出率分別為3.01%、1.81%、30.14%。CSFV 與PRV 均維持在較低污染水平，且CSFV的Ct 值均較高，不排除檢測(cè)到CSFV 弱毒疫苗的情況，說(shuō)明湖南省近3 年CSF 與PR 防控效果較好，免疫接種工作成效顯著，使豬群獲得了較好的免疫保護(hù)力。PRRSV 的污染率較高，說(shuō)明豬群的PRRSV感染較為嚴(yán)重，且PRRS為免疫抑制性疫病，易與其他病原發(fā)生混合感染，這增加了PRRS 的防控難度，需引起足夠重視。

近年來(lái)，CSFV、PRV、PRRSV的臨床感染情況越來(lái)越復(fù)雜[3]，豬只易發(fā)生繼發(fā)或混合感染。李志賢等[10]報(bào)道了賀州市2018—2019 年“PRRSV+CSFV”陽(yáng)性率為0.57%，“PRRSV+PRV”陽(yáng)性率為0.28%，“PRV+CSFV”陽(yáng)性率為0；宋玉慧[11]報(bào)道了河南省7.53%發(fā)病豬群檢出“CSFV+PRRSV”，3.42% 發(fā)病豬群檢出“CSFV+PRV”，6.16% 發(fā)病豬群檢出“PRRSV+PRV”；徐麗華等[12]發(fā)現(xiàn)“PRRSV+CSFV”的雙重污染率最高，其次是“PRRSV+PRV”；向乾裕等[1]報(bào)道了2019—2021 年湖南洞口地區(qū)混合污染情況，發(fā)現(xiàn)以雙重、三重污染為主。本研究中2021—2023 年湖南省無(wú)害化處理場(chǎng)以雙重污染為主，“PRRSV+CSFV”陽(yáng)性率為1.92%，“PRRSV+PRV”陽(yáng)性率為0.55%，“PRV+CSFV”陽(yáng)性率最低為0.05%，三重污染只在2023 年檢出1 例，與上述報(bào)道基本一致。

PRRSV 在3 種病原中檢出率最高，因此對(duì)衡南縣無(wú)害化處理場(chǎng)的PRRSV 進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，PRRSV 主要流行毒株為譜系1 類(lèi)NADC30 毒株。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，17 個(gè)PRRSV序列與類(lèi)NADC30 毒株聚為1 個(gè)大分支，在該大分支內(nèi)又分別聚為4 個(gè)小分支，表現(xiàn)出遺傳多樣性。姚春雷等[13]對(duì)2022 年浙江省37 份PRRSV 陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，譜系1 占比最高（23/37）；顧文源等[14]對(duì)2022 年—2023 年上半年15 株河北省代表性PRRSV 毒株進(jìn)行序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)10 株屬于譜系1；劉強(qiáng)德等[15]研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)NADC30 毒株已成為新疆北疆豬場(chǎng)主要流行毒株；Zhou 等[16]發(fā)現(xiàn)，我國(guó)東部地區(qū)類(lèi)NADC30 株占比較大，檢出率有所上升，且流行呈現(xiàn)多樣化；Zhao 等[17]發(fā)現(xiàn)，DJY-19 起源于北美NADC30 株，之后與我國(guó)的TJ、JXA1 株發(fā)生了重組。由于PRRSV 缺乏RNA 聚合酶校正功能，基因組在復(fù)制過(guò)程中易出現(xiàn)堿基突變、插入和缺失等情況，具有高度變異性[18]，因此需持續(xù)加強(qiáng)PRRSV 的遺傳變異監(jiān)測(cè)，以掌握其變異情況。

4 結(jié)論

2021—2023 年，湖南省無(wú)害化處理場(chǎng)CSFV、PRV 污染率維持在較低水平，說(shuō)明這兩種疫病的防控效果較好，建議繼續(xù)做好CSF 和PR 的免疫接種及效果評(píng)估工作，防止發(fā)生大流行；PRRSV 污染率較高，呈逐年上升趨勢(shì)，其中類(lèi)NADC30 毒株為優(yōu)勢(shì)流行毒株，需要持續(xù)加強(qiáng)PRRSV 的遺傳變異監(jiān)測(cè)及養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理和生物安全管理，以保障豬群生產(chǎn)安全。