邵曉婷,戴玉璇,應(yīng)玲靜,陳美仙

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院/金華市中心醫(yī)院兒科,浙江金華 321000)

蛋白糖基化是將聚糖基團(tuán)添加到蛋白分子中[1],通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白分子的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及功能等,使其在生物體內(nèi)多種生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]。糖基化與機(jī)體內(nèi)許多生物學(xué)作用及多種疾病息息相關(guān)[4-5],糖基化修飾可以影響細(xì)胞的許多生理特性,例如分子間相互作用、識(shí)別及后續(xù)的生物調(diào)節(jié)功能等。外源性寡糖化合物(Cyclo-ManN propanyl perac,Cyclo-ManN pro)可以使糖復(fù)合物發(fā)生糖基化修飾。糖基化修飾在大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(PC12細(xì)胞)分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[6],而糖基化作用促進(jìn)PC12細(xì)胞分化的具體機(jī)制尚不明確,作者前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)波形蛋白(vimentin)是糖代謝分子作用PC12細(xì)胞的重要中間蛋白。波形蛋白是一種潛在的糖蛋白,有3個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(7:絲氨酸;33:蘇氨酸;34:絲氨酸),為了進(jìn)一步研究糖基化在PC12細(xì)胞中的作用,本研究構(gòu)建波形蛋白糖基化位點(diǎn)突變質(zhì)粒,并研究其對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海分院;Cyclo-ManN pro受贈(zèng)于WERMER RUETTER教授;引物合成由上海生工生物工程公司完成;pcDNA3.1b購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;PCR試劑PrimeSTAR、dNTP購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ/XbaⅠ)、四碘甲狀腺原氨酸(T4)連接酶購(gòu)于日本TaKaRa公司;大腸桿菌菌株Top10來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生化系存種;凝膠電泳試劑購(gòu)于法國(guó)Biowest公司;DNA標(biāo)記物購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;RNA抽提試劑盒購(gòu)于上海星漢生物科技有限公司,膠回收試劑盒購(gòu)于安徽省優(yōu)晶生物工程有限公司,質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)于上海凈化設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡購(gòu)于安徽安慶市醫(yī)療器械有限公司;熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司;核酸電泳槽購(gòu)于北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建波形蛋白相關(guān)質(zhì)粒

目的基因片段獲取:PC12細(xì)胞RNA抽提,獲取波形蛋白的mRNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),獲取波形蛋白的cDNA,設(shè)計(jì)引物,PCR分別獲取波形蛋白正常基因片段和糖基化突變基因片段。重組質(zhì)粒建成與分析:分別將pcDNA3.1b與波形蛋白雙酶切(EcoRⅠ/XbaⅠ)后連接,轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞,篩選氨芐青霉素陽(yáng)性克隆菌,培養(yǎng),抽提質(zhì)粒并電泳鑒定,送于上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。RT-PCR反應(yīng)體系:RNA 2 μg、5×RNA PCR Buffer 4 μL、MgCl24 μL、10 mmol/L dNTP Mix 8 μL、Oligo dT 1 μL、MML enzyme 1 μL、DEPC超純水加至20 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性65 ℃ 5 min,逆轉(zhuǎn)錄酶37 ℃ 1 h,99 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min,-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系:Template 0.5 μL、Primer(sense) 0.5 μL、Primer(Antisense) 0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、PrimeSTAR 0.5 μL、超純水 19.5 μL。PCR反應(yīng)條件:波形蛋白(98 ℃ 5 min,98 ℃ 30 s,67 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán));波形蛋白糖基化位點(diǎn)突變(98 ℃ 5 min,98 ℃ 30 s,66 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán))。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分化分析

(1)采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)PC12細(xì)胞,細(xì)胞密度約為1×104個(gè)/cm2時(shí)進(jìn)行形態(tài)觀察。(2)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)分別轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒:對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1b,Vim組轉(zhuǎn)染波形蛋白正常基因片段重組質(zhì)粒,Vim mut組轉(zhuǎn)染波形蛋白糖基化位點(diǎn)突變基因片段重組質(zhì)粒。繼續(xù)保持37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng),分別在0、3 d時(shí)記錄細(xì)胞分化情況。(3)細(xì)胞分化情況分析:隨機(jī)選取3個(gè)不同的視野,不少于150個(gè)細(xì)胞數(shù)量,統(tǒng)計(jì)分化神經(jīng)突平均長(zhǎng)度與分化細(xì)胞占比(分化細(xì)胞為擁有至少1個(gè)神經(jīng)突>10 μm的細(xì)胞)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 波形蛋白糖基化位點(diǎn)突變目的基因情況

在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中分析發(fā)現(xiàn)波形蛋白含有3個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(7:絲氨酸;33:蘇氨酸;34:絲氨酸),通過(guò)前后兩個(gè)片段將這3個(gè)位點(diǎn)全部突變,設(shè)計(jì)引物將位點(diǎn)19(T-G)、97(A-G)、100(T-G)突變,從而實(shí)現(xiàn)氨基酸序列突變[7:絲氨酸(S)變?yōu)楸彼?A);33:蘇氨酸(T)變?yōu)楸彼?A);34:絲氨酸(S)變?yōu)楸彼?A)]。前108 bp片段(正向引物:5′-AAA GAA TTC ATG TCC ACC AGG TCC GTG GCC TC-3′,反向引物: 5′-AAA GCG GGT GGC TGC GGT CAC ATA G-3′),后1 346 bp片段(正向引物:5′-AAA TAT GTG ACC GCA GCC ACC CGC-3′,反向引物:5′-AAA TCT AGA TAC TGC GCC GTT GCA CTG AGC CT-3′),突變?nèi)L(zhǎng)基因片段(正向引物:5′-AAA GAA TTC ATG TCC ACC AGG TCC GTG GCC TC-3′,反向引物:5′-AAA TCT AGA TAC TGC GCC GTT GCA CTG AGC CT-3′),含EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)及Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)。目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳分析,波形蛋白基因約1 404 bp,凝膠電泳結(jié)果分析,分別于近100 bp(圖1A)、1 000～2 000 bp(圖1B)、1 000～2 000 bp(圖1C)處顯示目的片段,見圖1。

A:前108 bp片段電泳圖;B:后1 346 bp片段電泳圖;C:全長(zhǎng)基因片段電泳圖;箭頭示目的片段。

2.2 波形蛋白糖基化突變重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒為包含波形蛋白突變基因片段(約1 404 bp)的重組體,在同一電泳條件下,Vim mut組電泳速率慢于對(duì)照組,見圖2。

A箭頭示目的片段。

2.3 Cyclo-ManN pro處理前細(xì)胞分化分析

分別將空載質(zhì)粒pcDNA3.1b、波形蛋白質(zhì)粒、波形蛋白糖基化位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)PC12細(xì)胞,培養(yǎng)3 d觀察細(xì)胞分化情況(圖3A)。Vim組細(xì)胞平均神經(jīng)突長(zhǎng)度為(61.98±19.03)μm,高于對(duì)照組的(51.09±14.45)μm、Vim mut組的(51.49±14.78)μm,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Vim組分化神經(jīng)突細(xì)胞百分比為(6.60±0.25)%,高于對(duì)照組的(4.27±0.18)%、Vim mut組的(4.76±0.33)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示波形蛋白糖基化位點(diǎn)在PC12細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用,見圖3。

A:細(xì)胞形態(tài)分化圖(100×);B:細(xì)胞平均神經(jīng)突長(zhǎng)度定量結(jié)果圖;C:分化細(xì)胞百分比定量結(jié)果圖;a:P<0.05。

2.4 Cyclo-ManN pro處理后細(xì)胞分化分析

進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染上述3組質(zhì)粒在Cyclo-ManN pro作用下對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示,Cyclo-ManN pro處理后,Vim組細(xì)胞平均神經(jīng)突長(zhǎng)度為(78.01±18.31)μm,高于對(duì)照組的(69.98±12.85)μm、Vim mut組的(68.45±13.84)μm,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Vim組分化神經(jīng)突細(xì)胞百分比為(10.62±0.25)%,高于對(duì)照組的(8.11±1.22)%、Vim mut組的(5.89±0.60)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示Cyclo-ManN pro可能是通過(guò)波形蛋白糖基化位點(diǎn)作用而促進(jìn)細(xì)胞分化的,將糖基化位點(diǎn)突變后,Cyclo-ManN pro促進(jìn)神經(jīng)分化的作用則會(huì)明顯降低,見圖4。

3 討 論

糖基化作用是一種重要的翻譯后修飾作用,可以參與多種生物代謝過(guò)程,其異常代謝會(huì)引起機(jī)體各種相關(guān)疾病[7-8]。翻譯后修飾可以擴(kuò)大蛋白多樣性從而改變其生物功能,在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,例如細(xì)胞復(fù)制、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)等[9-11]。在真核生物中有兩種主要蛋白糖基化類型:N連接型糖基化、O連接型糖基化。O連接型糖基化通常將聚糖分子連接到絲氨酸/蘇氨酸基團(tuán)的羥基上[12]。波形蛋白含有3個(gè)糖基化位點(diǎn)(7:絲氨酸;33:蘇氨酸;34:絲氨酸),可能是一種潛在的O連接型糖基化蛋白。有研究顯示,O連接型糖基化在許多蛋白功能中發(fā)揮作用,包括蛋白細(xì)胞定位、蛋白穩(wěn)定性、蛋白間相互作用等[13]。O連接型糖基化還與磷酸化修飾間有交互作用,可能是因?yàn)樗鼈兌伎勺饔糜诘鞍追肿拥慕z氨酸/蘇氨酸基團(tuán)[14]。神經(jīng)節(jié)苷脂的糖基化修飾可以通過(guò)影響細(xì)胞的存活與凋亡來(lái)參與早期腦發(fā)育[15]。唾液酸代謝前體物質(zhì)可以使細(xì)胞中的糖復(fù)合物發(fā)生糖基化修飾作用[16-17]。

波形蛋白是一種Ⅲ型中間纖維蛋白,是最為熟知并被廣泛研究的中間纖維蛋白家族成員,有著重要的生物學(xué)功能,但其具體功能并未被充分了解。有研究顯示,波形蛋白在神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[18]。波形蛋白發(fā)生翻譯后修飾可以影響其生物學(xué)功能[19],在神經(jīng)軸突生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[20],其中糖基化修飾作用是波形蛋白一種重要的翻譯后修飾[21],然而波形蛋白糖基化修飾的相關(guān)機(jī)制及后續(xù)對(duì)PC12細(xì)胞的生物學(xué)功能影響尚未明確。本研究中,使用Cyclo-ManN pro研究波形蛋白糖基化修飾對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)分化的影響。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)波形蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白有3個(gè)潛在糖基化位點(diǎn),將這3個(gè)糖基化位點(diǎn)均進(jìn)行突變,并構(gòu)建相應(yīng)糖基化位點(diǎn)突變質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞來(lái)進(jìn)一步研究其對(duì)神經(jīng)分化的影響。結(jié)果顯示,波形蛋白糖基化修飾可以延長(zhǎng)細(xì)胞平均神經(jīng)突的長(zhǎng)度,提高分化細(xì)胞的比例,促進(jìn)PC12細(xì)胞的神經(jīng)突分化與生長(zhǎng)。在后續(xù)研究中,將設(shè)計(jì)引物,對(duì)波形蛋白的3個(gè)糖基化位點(diǎn)分別單獨(dú)進(jìn)行突變,構(gòu)建相應(yīng)的糖基化位點(diǎn)7、33、34突變質(zhì)粒,通過(guò)進(jìn)一步轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞來(lái)分析其對(duì)神經(jīng)分化的影響,從而分析具體位點(diǎn)突變對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)分化的作用。

波形蛋白是一種可能的O連接型糖基化蛋白,作用于絲氨酸/蘇氨酸基團(tuán),而絲氨酸/蘇氨酸基團(tuán)同時(shí)也是磷酸化位點(diǎn),可被蛋白激酶A/C磷酸化,這兩種修飾間存在交互作用。在神經(jīng)細(xì)胞中,波形蛋白可被周期蛋白依賴性激酶1磷酸化,并參與整合素β1的激活及后續(xù)信號(hào)通路,從而在神經(jīng)軸突生長(zhǎng)及再生等方面中發(fā)揮作用。因此,波形蛋白糖基化可能通過(guò)磷酸化交互作用影響后續(xù)細(xì)胞神經(jīng)分化,相關(guān)作用機(jī)制可能是今后的研究方向。