梁燦 李瑩 賀曉日

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院新生兒科；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院新生兒疾病研究室，湖南長沙 410011）

宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth restriction,IUGR）在中國大陸的發(fā)病率達8.77%［1］。其在發(fā)展中國家及亞洲發(fā)達國家常見的致病因素為孕期營養(yǎng)不良。在IUGR個體中，腎單位數(shù)量減少是高血壓和腎臟疾病發(fā)生的重要促成因素［2］。腎單位的減少可使剩余腎小球代償性肥大及高灌注［3］。同時，腎單位高灌注、高濾過的血流動力學(xué)改變還可以引起足細胞損傷、腎小球系膜細胞增生［4］以及腎小管損傷等［5］。流行病學(xué)相關(guān)研究顯示，IUGR 個體成年后出現(xiàn)高血壓、微量蛋白尿、慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）甚至終末期腎臟疾病的概率較正常出生體重人群高［6-7］。IUGR腎小球數(shù)量減少多在出生時就已出現(xiàn)，但其后續(xù)腎臟改變多發(fā)生在成年后，腎功能損害一旦出現(xiàn)，很難防止病情的進展與惡化，從而導(dǎo)致不良臨床結(jié)局［8］，故對于IUGR個體的腎臟結(jié)構(gòu)與功能需動態(tài)監(jiān)測以期盡早干預(yù)，改善預(yù)后［4］。

目前常用于評估腎功能的方法如血肌酐、尿素氮、超聲、腎穿刺活檢等仍存在一定局限性。功能磁共振（functional magnetic resonance imaging,fMRI）具有敏感、定量、無創(chuàng)的特點，目前有多種技術(shù)已應(yīng)用于腎臟損傷早期和持續(xù)損傷的評估。采用單指數(shù)模型方法的傳統(tǒng)擴散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging, DWI）得到的表觀彌散系數(shù)（apparent diffusion coefficient, ADC）反映了組織微觀結(jié)構(gòu)及組織微循環(huán)灌注信息［9］。雙指數(shù)模型可將組織微觀結(jié)構(gòu)和微循環(huán)信息分開，精細量化水分子的真性擴散和毛細血管及腎小管內(nèi)液體流動引起的假性擴散，得到真實擴散系數(shù)（Dt）、偽擴散系數(shù)（D*）以及灌注分數(shù)（f），即為體素內(nèi)不相干運動（intravoxel incoherent motion, IVIM）技術(shù)［10-11］。Dt與細胞間水分子的擴散速率相關(guān)，反映組織的微細結(jié)構(gòu)；D*主要反映微循環(huán)灌注情況；f值表示目標(biāo)區(qū)域內(nèi)包含腎小管液流動的微循環(huán)灌注在整體擴散信號中所占比例。IVIM 在移植腎模型、糖尿病腎病及兒童慢性腎疾病中可用于評估纖維化評分、腎功能受損、估算腎小球濾過率與纖維化面積等，但各參數(shù)敏感度仍未達成共識［12-15］。

縱向馳豫時間（T1）和橫向弛豫時間（T2）是形態(tài)磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）中組織對比的主要來源［16］，對組織的含水量較為敏感，且T1 的變化早于T2［17-18］。T1 mapping 及T2 mapping 技術(shù)通過定量化生成T1-map圖及T2-map 圖，得到對應(yīng)部位的T1 值及T2值［17，19］。T1 mapping及T2 mapping已廣泛應(yīng)用于大腦、心臟等部位。目前研究認為T1 值與腎纖維化存在一定的相關(guān)性［17］，T2 值對腎纖維化改變相對不敏感［7］，對足細胞水腫、炎癥等改變較敏感。T1及T2值在急性炎癥時期均出現(xiàn)升高，腎纖維化時僅T1值出現(xiàn)升高［20］，兩者聯(lián)合或能更好地識別腎臟纖維化改變。

本研究采用孕期低蛋白飲食建立IUGR仔鼠模型，利用IVIM、T1 mapping、T2 mapping MRI 掃描評估仔鼠腎臟微觀結(jié)構(gòu)及灌注改變的動態(tài)變化，觀察各參數(shù)值的差異。同時將存在差異的MRI 參數(shù)與Scr、BUN 及腎臟病理檢測結(jié)果對比，探討通過fMRI評估IUGR仔鼠腎臟微觀結(jié)構(gòu)及灌注改變的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和模型建立

本動物實驗方案獲中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（編號2021030）。實驗動物購買于湖南省長沙市斯萊克景達實驗動物有限公司。將12只Sprague-Dawley（SD）孕鼠，隨機分為低蛋白組（雌鼠妊娠予蛋白質(zhì)含量為10%的低蛋白飼料喂養(yǎng)）和對照組（正常喂養(yǎng)），仔鼠出生后均正常喂養(yǎng)。仔鼠出生后測量體重，當(dāng)仔鼠的出生體重低于對照組仔鼠的平均體重2個標(biāo)準差者認為其發(fā)生IUGR［21］。通過給予孕鼠孕期全程低蛋白飲食建立IUGR 模型［22］。低蛋白組仔鼠隨機分為IUGR 8周組、IUGR 12周組，對照組仔鼠隨機分為正常8周組、正常12周組，每組各8只。均母乳喂養(yǎng)至21 d 后斷乳分籠予以正常飲食，喂養(yǎng)至第8周、第12周時行MRI檢查后處死并留取標(biāo)本。

1.2 MRI檢查

仔鼠檢查前6～8 h 禁食禁飲，掃描前15 min 予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）皮下注射麻醉，取俯臥位、頭先進體位。采用上海聯(lián)影uMR790 3.0T磁共振成像系統(tǒng)，專配12 通道實驗動物專用磁共振線圈。

1.3 MRI掃描序列

使用的MRI 掃描序列為：橫軸位和冠狀位快速自旋回波（T2WI） 序列，快速自旋回波（T1WI）序列，IVIM 序列，橫軸位T1 mapping 序列，快速自旋回波（T1WI） 序列，橫軸位T2 mapping序列，快速自旋回波（T2WI）序列。

1.4 MRI數(shù)據(jù)測量及分析

將IVIM 及T2 mapping 的MRI 掃描圖片上傳至聯(lián)影處理工作站，使用相應(yīng)軟件包對圖像進行處理后可生成IVIM 圖像及T2 mapping 圖像，T1 mapping 圖像在MRI 掃描完成后自動生成。選取腎臟橫斷面面積最大的層面及其前后各2個層面，在腎臟對應(yīng)解剖層（即腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)）內(nèi)選擇至少5 個像素大小的感興趣區(qū)域（region of interest,ROI），避開腎竇及偽影區(qū)域。見圖1。各個層面獲得其對應(yīng)MRI參數(shù)后將5個層面數(shù)據(jù)匯總，取其算術(shù)平均數(shù)為最終參數(shù)。

圖1 實時測量時ROI選區(qū) A：IVIM MRI選區(qū)圖，可得到真實擴散系數(shù)（Dt）、偽擴散系數(shù)（D*）、表觀彌散系數(shù)（ADC）、灌注分數(shù)（f）值；B：T1 mapping MRI選區(qū)圖，可得到T1值；C：T2 mapping MRI選區(qū)圖，可得到T2值。

1.5 實驗室檢查

于各時間點MRI 掃描結(jié)束后，頸靜脈采血，迅速離心血液樣本取上層血清。使用全自動生化分析儀檢測血肌酐及血尿素氮水平。

1.6 病理檢測

每組隨機取2 只仔鼠，予2% 戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射后處死，沿腹中線剪開皮膚后使用實驗鑷鈍性分離腹膜，于腹膜后位分離腎臟取出，沿腎臟最大冠狀面切開，放入4%多聚甲醛中固定24 h，不同濃度乙醇脫水后置于石蠟中包埋切片。

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色：60℃烤石蠟切片12 h；逐層至水，予蘇木精進行染色，蒸餾水沖洗后PBS返藍；予伊紅進行染色，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，置于二甲苯中脫蠟，中性樹膠封片。

Masson 染色：60℃烤石蠟切片4 h；切片脫蠟至水（同HE染色）后甩去切片上水，予適量核染液滴上覆蓋切片組織，染色3～5 min；予自來水沖洗、蒸餾水浸泡、PBS浸泡切片5～10 min返藍；甩去切片上水，適量復(fù)染液滴上覆蓋切片組織，染色2 min，沖洗液沖洗；滴上分色液30 s，棄分色液；適量復(fù)染液滴上覆蓋切片組織，染色6～8 min，倒去，無水乙醇沖洗；吹干封片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料采用均值±標(biāo)準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；各組內(nèi)腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間計量資料的比較采用兩樣本t檢驗。非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Dunn's 檢驗；各組內(nèi)腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間計量資料的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUGR動物模型

正常對照組平均出生體重為（6.8±0.6）g，低蛋白組平均出生體重為（5.0±0.6）g，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-15.914，P＜0.001）。IUGR 組仔鼠IUGR 發(fā)生率顯著高于正常組（0% vs 84%；P＜0.05）。以仔鼠死產(chǎn)或生后24 h內(nèi)死亡定義為圍產(chǎn)期死亡，兩組仔鼠圍產(chǎn)期病死率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（5% vs 8%；χ2=0.630，P=0.427）。

2.2 各組仔鼠腎臟組織病理檢查結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，正常8 周組、正常12 周組仔鼠腎臟皮質(zhì)腎小球及周圍間質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，細胞形態(tài)良好，腎小球周圍毛細血管呈小葉狀分布，未見炎性細胞浸潤；髓質(zhì)可見腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細胞刷狀緣形態(tài)正常。IUGR 8 周組仔鼠腎臟皮質(zhì)出現(xiàn)部分腎小球輕度擴張，間質(zhì)可見炎性細胞浸潤；髓質(zhì)偶可見腎小管上皮細胞損傷；IUGR 12周仔鼠腎臟皮質(zhì)可見部分腎小球萎縮乃至壞死，囊腔消失，炎性細胞浸潤；髓質(zhì)可見部分腎小管上皮細胞損傷，刷狀緣脫落，部分腎小管管腔擴張，管腔內(nèi)可見管型及壞死脫落細胞，間質(zhì)可見纖維化。見圖2。

圖2 各組仔鼠腎小球、腎小管HE、Masson染色圖（光鏡，×400） HE染色結(jié)果顯示，正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小球形狀完整，腎小囊清晰，IUGR 12周組可見腎小球萎縮，腎小囊消失，箭頭指示腎小球結(jié)構(gòu)；正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小管結(jié)構(gòu)正常，刷狀緣清晰，IUGR 12周組可見腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，刷狀緣脫落，部分可見腎小管上皮細胞脫落，箭頭指示腎小管刷狀緣。Masson染色結(jié)果顯示，正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小球形狀完整，腎小囊清晰；IUGR 12周組可見腎小球萎縮，腎小囊消失，藍染較其余3組明顯，提示纖維化改變，箭頭指示腎小球結(jié)構(gòu)。正常8周組、正常12周組及IUGR 8周組可見腎小管結(jié)構(gòu)正常，刷狀緣清晰，未見顯著纖維化改變；IUGR 12周組可見腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，刷狀緣脫落，部分可見管型，藍染較其余3組明顯，提示纖維化改變，箭頭指示腎小管刷狀緣。

Masson 染色結(jié)果顯示，正常8 周組、正常12周組及IUGR 8 周組仔鼠腎臟未見纖維化改變。IUGR 12周組仔鼠可見腎小球壞死、間質(zhì)纖維化改變。見圖2。

2.3 各組腎臟fMRI結(jié)果

各組內(nèi)腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間ADC值及f值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各組間腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間ADC值及f值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IUGR 12 周組腎臟髓質(zhì)Dt值高于IUGR 8周組（P＜0.05），各組間腎臟皮質(zhì)Dt值比較及各組內(nèi)腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間Dt值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IUGR 12 周組腎臟髓質(zhì)D*值低于正常12周組與IUGR 8周組（P＜0.05），各組間腎臟皮質(zhì)D*值比較及各組內(nèi)腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間D*值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組腎臟fMRI結(jié)果比較 （n=8）

2.4 各組腎臟T1 mapping、T2 mapping結(jié)果

IUGR 8 周組腎臟髓質(zhì)T1 值高于皮質(zhì)，IUGR 12 周組腎臟髓質(zhì)T1 值高于IUGR 8 周組與正常12周組，IUGR 12 周組腎臟皮質(zhì)T1 值高于正常12 周組（P＜0.05）。各組內(nèi)腎臟髓質(zhì)T2 值均高于皮質(zhì)（P＜0.05）；各組腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間T2 值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組腎臟T1、T2值比較 （± s，n=8）

表2 各組腎臟T1、T2值比較 （± s，n=8）

注：a示與IUGR 8周組比較，P＜0.05；b示與正常12周組比較，P＜0.05。

組別正常8周組IUGR 8周組正常12周組IUGR 12周組F值P值T1值T2值皮質(zhì)1 694±153 1 648±174 1 410±264 1 740±385b 2.988 0.047髓質(zhì)1 880±254 1 847±94 1 561±340 1 928±313a,b 3.055 0.045 t值-1.272-2.836-0.992-1.075 P值0.224 0.013 0.338 0.301皮質(zhì)67±4 68±5 66±5 67±2 0.399 0.755髓質(zhì)81±6 82±8 85±7 85±4 0.888 0.459 t值-5.291-4.233-6.033-11.158 P值＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

2.5 各組血肌酐及血尿素氮含量比較

正常8 周組、IUGR 8 周組、正常12 周組及IUGR 12周組血肌酐及血尿素氮含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組血肌酐及血尿素氮含量比較 （± s，n=8）

表3 各組血肌酐及血尿素氮含量比較 （± s，n=8）

組別正常8周組IUGR 8周組正常12周組IUGR 12周組F值P值血肌酐 (μmol/L)28±8 31±7 33±4 35±11 1.237 0.319血尿素氮 (mmol/L)8.4±1.8 10.0±1.3 8.0±0.9 9.4±3.1 1.584 0.220

3 討論

本研究采用雌鼠孕期全程低蛋白飲食成功建立IUGR仔鼠模型。在腎臟病理檢測中IUGR 8周組腎小球僅出現(xiàn)肥大，而IUGR 12周組腎小球出現(xiàn)萎縮、硬化，腎小管出現(xiàn)損傷，腎間質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞浸潤乃至腎纖維化，其中纖維化改變在Masson染色中較為突出。此前研究認為在IUGR 生后早期，腎單位的減少使得剩余腎小球出現(xiàn)代償性肥大及高灌注，而在腎臟中灌注與能量消耗相關(guān)的特性使其氧耗增加，最終晚期可見剩余的腎小球出現(xiàn)硬化、壞死、纖維化［3］、，甚至腎小管損傷等病理改變［23］。本研究病理結(jié)果與上述研究一致，故認為本模型可應(yīng)用于IUGR腎損傷的研究。而血肌酐與血尿素氮組間比較并無明顯差異，這可能是由于這兩個指標(biāo)易受飲食、年齡、身高、肌肉含量等多種因素影響，可靠性欠佳并相對滯后［24］。

多數(shù)研究者認為ADC 值、f 值、D*值及Dt值在灌注豐富、水分子擴散活躍的皮質(zhì)中更高，在部分病理情況下其皮、髓質(zhì)間差異可消失［25］。本研究中，IUGR 8 周組與正常8 周組在IVIM 圖像上獲得的ADC 值、f 值、D*值及Dt值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示IUGR仔鼠生后早期，腎臟病理改變可能僅為腎小球數(shù)目減少，而腎小球工作面積的增加便可維持正常腎功能［26］。IUGR 12 周組髓質(zhì)D*值較正常12 周組降低，其病理檢查結(jié)果提示腎臟出現(xiàn)失代償性修復(fù)，其中細胞水腫、炎癥細胞浸潤及腎纖維化等均可導(dǎo)致D*值降低［27］。也有研究認為IUGR 模型中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的改變導(dǎo)致D*值出現(xiàn)顯著降低［28］。腎臟髓質(zhì)對缺氧等損害較為敏感，故D*值的改變主要發(fā)生在髓質(zhì)。而ADC值與被認為較為敏感的Dt值未出現(xiàn)改變，可能是由于腎小球周圍小血管的收縮與腎小球的高灌注可導(dǎo)致其出現(xiàn)截然相反的變化，從而使得改變抵消。

比較IUGR 組第8 周與第12 周結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IUGR 8 周組腎臟髓質(zhì)D*值高于IUGR 12 周組，而Dt值低于IUGR 12周組。Dt值代表真實水分子擴散水平，在早期IUGR丟失的腎小球可通過剩余腎小球高灌注進行代償，而后期僅剩的腎小球進一步壞死丟失可導(dǎo)致剩余腎小球負荷繼續(xù)加重，血漿流量進一步增加，水分子擴散繼續(xù)增加，故Dt值隨時間發(fā)展升高而D*值下降［29］。

腎臟髓質(zhì)擁有較豐富的含水量，正常腎臟其皮質(zhì)T1 值應(yīng)低于髓質(zhì)［30］，本研究結(jié)果與之相符。各組內(nèi)皮質(zhì)、髓質(zhì)間T1值差異僅在IUGR 8周組有統(tǒng)計學(xué)意義，而在IUGR 12周時其組內(nèi)差異不再有統(tǒng)計學(xué)意義。腎小球長期高負荷導(dǎo)致細胞水腫、炎癥細胞浸潤、腎臟皮質(zhì)腎小球已逐漸出現(xiàn)纖維化、膠原蛋白具有豐富的含水量等，均可導(dǎo)致IUGR 12周組腎臟皮質(zhì)T1值升高［31］。IUGR 12周組髓質(zhì)T1 值高于正常12 周組與IUGR 8 周組，提示IUGR仔鼠12周時其腎臟已出現(xiàn)可逆轉(zhuǎn)的炎癥反應(yīng)或是不可逆的纖維化改變。既往研究認為處于低氧環(huán)境時髓質(zhì)對于血液灌流及氧消耗的變化較敏感，故IUGR腎損傷首先發(fā)生在髓質(zhì)［32］，這與本研究所觀察到T1 值改變發(fā)生在髓質(zhì)相符，同時，在IVIM中也觀察到代表灌注的D*值在髓質(zhì)出現(xiàn)改變，認為其可相互印證。以上提示T1 mapping MRI可用于評估IUGR仔鼠腎臟微觀結(jié)構(gòu)及灌注損傷。

本研究顯示，IUGR仔鼠生后12周時其腎臟與正常12 周仔鼠的D*值及T1 值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而此時血肌酐及尿素氮無法反映此時腎臟的損傷。對于腎臟損傷的類型IVIM 及T1 mapping MRI 單獨使用時均無法分辨。在多數(shù)腎臟病理改變中T1 值及T2 值均可出現(xiàn)相似改變，但在腎臟纖維化中其改變則存在顯著差異［33］。在可逆性急性炎癥反應(yīng)（即細胞及間質(zhì)水腫、炎癥細胞浸潤）的情況下，T1值與T2值均出現(xiàn)升高，在腎纖維化時T2值無顯著改變但T1出現(xiàn)升高［11，18，33］。和T1值一樣，一般而言，腎臟髓質(zhì)T2值高于皮質(zhì)［34］。本研究觀察到IUGR 12 周組腎臟出現(xiàn)纖維化改變，同時其T1 值較正常12周組高，各組仔鼠腎臟髓質(zhì)T2值均高于皮質(zhì)，各組間T2 值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與此前的研究相符。以上提示，T1 mapping 聯(lián)合T2 mapping MRI可辨別出IUGR仔鼠腎臟纖維化改變。

IVIM MRI是評估及動態(tài)觀察IUGR仔鼠腎臟微觀結(jié)構(gòu)及灌注損傷敏感的方法。T1 mapping MRI可用于評估IUGR 仔鼠腎臟損傷；T1 mapping 聯(lián)合T2 mapping MRI 可進一步分辨IUGR 仔鼠的腎臟纖維化。

作者貢獻聲明：梁燦、李瑩負責(zé)研究設(shè)計、分析數(shù)據(jù)、論文撰寫；賀曉日負責(zé)項目主持及指導(dǎo)、研究設(shè)計、論文修改、經(jīng)費支持。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。