張晶晶，陳家新，馮軍偉，胡景婷，馬欣榮，張 楠，解心月，劉 娜，王 心,4,5,6，惠 明,5,6,*

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450000；2.河南工業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國家工程研究中心，河南鄭州 450001；3.河南飛天農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司，河南鶴壁 456750；4.許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院，河南許昌 461000；5.工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實驗室，河南鄭州 450001；6.小麥生物加工與營養(yǎng)功能河南省重點實驗室，河南鄭州 450001）

小麥淀粉是對小麥面粉進一步深度加工的產(chǎn)物，工業(yè)化生產(chǎn)的小麥淀粉一般分有A、B 兩種類型，A 淀粉粒徑為10～35 μm，顆粒較大呈透鏡型，B 淀粉粒徑為2～5 μm，顆粒較小呈圓形[1-2]。A 淀粉是精制淀粉，基本不含雜質(zhì)或含量極少，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等方面。B 淀粉作為生產(chǎn)A 淀粉的副產(chǎn)物，其含量占原料小麥面粉總量的10%～20%[3]。小麥B 淀粉除含有大量淀粉外，還有蛋白質(zhì)、戊聚糖[4-6]等雜質(zhì)，由于特殊的理化性質(zhì)無法像A 淀粉那樣用于商品淀粉制作。國內(nèi)外研究者均對提高小麥B 淀粉利用價值進行了一些探索，研究表明，利用小麥B 淀粉生產(chǎn)高麥芽糖漿[7-8]，B 淀粉中由于含有戊聚糖和粗脂肪等成分，使得高麥芽糖漿過濾脫色困難[2]，從而影響了產(chǎn)品質(zhì)量；蓮花味精集團將小麥B 淀粉與A 淀粉混合制糖，用作發(fā)酵生產(chǎn)味精的原料，B 淀粉因存在一定量的非淀粉多糖，使得制糖過程中糖液黏度過高，從而影響發(fā)酵工藝[9]。也有將小麥B 淀粉漿用作飼料添加組分，但B 淀粉漿容易滋生大量微生物，其中霉菌會導(dǎo)致動物中毒，降低飼料營養(yǎng)價值[10]；此外，B 淀粉含有木聚糖等糖類，動物難以利用，影響其對食物吸收率，繼而阻礙動物健康生長[9]。因此，優(yōu)化B 淀粉的利用方式，解決其中的問題，對于提升小麥B 淀粉的利用價值具有重要意義。

酒精（乙醇）常用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，目前發(fā)酵酒精所用的原料主要糖蜜、淀粉、玉米和木質(zhì)纖維素等。我國酒精發(fā)酵生產(chǎn)主要原料為玉米，玉米作為飼料最主要的原料，同時在保證肉類、奶制品等食品供應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，因此用玉米原料生產(chǎn)酒精存在“與人爭糧”問題，原料多元化發(fā)展勢在必行[11-12]。小麥B 淀粉價格低廉，以B 淀粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精，可以降低糧耗、節(jié)約資源，減少環(huán)境污染，提高經(jīng)濟效益。張軍合等[13]與杜麗娜[14]采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精，即先利用α-淀粉酶將小麥B 淀粉進行高溫蒸煮液化，然后利用糖化酶進一步水解成可發(fā)酵的糖，該法淀粉轉(zhuǎn)化效率低耗時長，所需設(shè)備多[15]。研究表明，α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同作用于淀粉可以提高水解效率，縮短酶解反應(yīng)時間[16-18]。雙酶法水解糖液純度高，酶解反應(yīng)條件溫和、可控性好，因此利用雙酶法酶解小麥B 淀粉制備可發(fā)酵糖可以有效的解決產(chǎn)量低、品質(zhì)差的問題。

本研究以小麥B 淀粉為原料，在對其基本成分進行分析基礎(chǔ)上，使用α-淀粉酶和糖化酶組成復(fù)合酶對B 淀粉進行一步酶解，為進一步提高酶解效率，詳細考察復(fù)合酶用量、料液比、酶解溫度、酶解時間及pH 對還原糖得率影響，并在此基礎(chǔ)上利用正交優(yōu)化確定最佳工藝參數(shù)。然后利用釀酒酵母菌株發(fā)酵上述酶解液生產(chǎn)酒精，為拓寬酒精生產(chǎn)原料，提高小麥B 淀粉利用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥B 淀粉漿 河南飛天農(nóng)業(yè)有限公司；釀酒酵母菌株 實驗室保存；氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；DNS 顯色液 福州飛凈生物科技有限公司；地衣酚 上海麥克林生化科技有限公司；α-淀粉酶（3700 U/g）、糖化酶（100000 U/g）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-木糖、D-無水葡萄糖 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、胰蛋白胨 英國Oxoid 公司；YPD 培養(yǎng)基：10 g/L 酵母提取物、20 g/L 胰蛋白胨、20 g/L 葡萄糖，固體培養(yǎng)基加20 g/L 瓊脂粉。

BSA124S 分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DHG-9140A 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；FE28 pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T2600 紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；MS-H-S 磁力攪拌器 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；ZWF-110X30 恒溫水浴振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；JP-800C-6 多功能高速粉碎機 永康市久品工貿(mào)有限公司；LC-2030 液相色譜儀 日本島津公司；BTP-3ES00X 臺式凍干機 美國Virtis 公司；Qunata 250FEG 掃描電子顯微鏡 浙江納德科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.2 小麥B 淀粉基本成分分析 還原糖含量和淀粉含量測定參照3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[20]，用DNS 法測得葡萄糖標準曲線方程y=1.6786x-0.0754，R2=0.9997；蛋白質(zhì)含量采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法[21]；灰分含量采用GB 5009.4-2016 中灰分含量的測定方法[22]；戊聚糖含量測定采用NY/T 2335-2013 谷物中戊聚糖含量測定方法中的分光光度法[23]（即地衣酚-鹽酸法）進行戊聚糖含量的測定。

式中，m′為帶入葡萄糖標準曲線得的含量，mg；V 為樣品提取液總體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；Vs 為測定時所取樣品提取液體積，mL；m 為稱取小麥B 淀粉的質(zhì)量，g。

式中，G 為水解樣中葡萄糖含量，mg；0.9 為淀粉與葡萄糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)；n 代表稀釋倍數(shù)；m 為稱取小麥B 淀粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 小麥B 淀粉酶解工藝流程 首先稱取一定量的α-淀粉酶和糖化酶溶解在水中，配制成α-淀粉酶含量為24 U/mL，糖化酶含量為150 U/mL 的復(fù)合酶溶液[24-25]備用。稱取2.0000 g 小麥B 淀粉末，并加入50 mL 蒸餾水配制成淀粉漿。用0.5 mol/L 稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至5.0 左右，在沸水浴中加熱15 min，使淀粉充分糊化。冷卻到60 ℃左右，加入配制好的復(fù)合酶溶液，使其在恒溫水浴振蕩器中進行酶解反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束取1 mL 酶解液，沸水浴滅酶5 min，12000 r/min 離心2 min 后取上清液，測定葡萄糖當量（DE 值），計算公式如下：

式中：干物質(zhì)含量為B 淀粉添加量。

1.2.4 單因素及優(yōu)化工藝試驗設(shè)計

1.2.4.1 單因素實驗 以DE 值為評價指標，在某一因素的研究中，其他因素設(shè)置為相應(yīng)的固定值，即復(fù)合酶添加量為2 mL，料液比為1:20 g/mL，酶解溫度為60 ℃，酶解時間為6 h，初始pH 為5，研究復(fù)合酶添加量（1、2、3、4、5 mL）、料液比（1:5、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）、酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解時間（2、4、6、10、14、18、22、24 h）及pH（3、4、5、6、7）五個因素對DE 值的影響。

Countermeasures of constructing trade and logistics center of Xuzhou

1.2.4.2 正交試驗優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取α-淀粉酶和糖化酶復(fù)合酶溶液添加量、料液比、酶解溫度、酶解時間及pH 進行正交試驗，每個因素安排3 個平行水平，以DE 值為評價指標，設(shè)計正交試驗表（表1），研究利用酶法水解小麥B 淀粉的最佳工藝條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.5 B 淀粉酶解前后掃描電鏡 參照黃冬等[26]的方法并稍做修改。利用掃描電子顯微鏡（SEM）對B 淀粉及其糖化殘渣的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。將酶解后的殘渣均勻的平鋪在玻璃平板上，冷凍干燥24 h備用。剪取一段導(dǎo)電膠粘在鋁制樣品臺上，用棉棒蘸取適量的樣品，均勻涂抹在導(dǎo)電膠上，洗耳球吹去未粘緊的樣品，噴金后置于電鏡下依次用不同倍數(shù)放大掃描。

1.2.6 釀酒酵母發(fā)酵小麥B 淀粉生產(chǎn)酒精

1.2.6.1 小麥B 淀粉發(fā)酵液制備 稱取2.0000 g 小麥B 淀粉于250 mL 搖瓶中，并加入50 mL 蒸餾水將其溶解。用0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液和稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至5.0。然后在沸水浴中加熱15 min，使淀粉充分糊化，冷卻到60 ℃以下，加入4 mL 配制好的復(fù)合酶液并置于60 ℃恒溫水浴振蕩器中酶解10 h。10 h 后取出煮沸滅酶，待冷卻至室溫后，用高速冷凍離心機8000 r/min 離心5 min，取上清液。

1.2.6.2 酒精發(fā)酵實驗 從冷凍甘油菌液中沾取劃線YPD 平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，獲得釀酒酵母菌株單菌落。挑取單菌落接種于3 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，240 r/min 培養(yǎng)24 h。菌液12000 r/min，離心5 min，去上清，用無菌水沖洗兩次，按10%接種量接種到上述優(yōu)化后酶解液中，30 ℃，240 r/min 搖瓶培養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每隔4 h 取樣一次直至發(fā)酵60 h[27]。發(fā)酵結(jié)束后，8000 r/min 離心5 min 取上清液冷凍保存。

1.2.6.3 發(fā)酵液中酒精和葡萄糖含量測定 用高效液相色譜法[28]測定發(fā)酵液中葡萄糖含量和酒精，并計算酒精原料得率和葡萄糖制乙醇轉(zhuǎn)化率。色譜條件：檢測器為示差檢測器；色譜柱為Biorad HPX-87H；流動相為5 mmol/L 稀硫酸-水溶液；流速為0.6 mL/min；柱溫為65 ℃；進樣量為20 μL，每個樣品收集時間為25 min。葡萄糖轉(zhuǎn)化率、酒精原料得率和葡萄糖制乙醇轉(zhuǎn)化率[29]計算公式如下：

式中：Cg 為所得葡萄糖濃度，g/L；V 為酶水解的體積，L；M 為干B 淀粉量，g；W 為干燥B 淀粉釋放葡萄糖的最大量，%；Ce 為乙醇濃度，g/L；0.51 為葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的理論值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)三次以上，實驗數(shù)值以平均值±標準差表示，利用Excel、IBM SPSS Statistics 26 對數(shù)據(jù)進行處理并利用GraphPad Prism 9 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥B 淀粉的各組分含量

對小麥B 淀粉的各組分含量進行分析，結(jié)果見表2。由表2 可知，B 淀粉中含一定非淀粉物質(zhì)，蛋白質(zhì)和灰分均在2%左右，戊聚糖含量接近5%，這些是影響淀粉品質(zhì)的主要因素，尤其是蛋白質(zhì)和戊聚糖含量[30]。據(jù)研究，戊聚糖具有較強的膠凝性和黏性[31-32]，是造成B 淀粉漿粘性大，在制糖漿時過濾困難的主要原因之一，也是限制B 淀粉加工利用的一個因素。淀粉作為小麥B 淀粉中的最重要成分，含量達85.61%，是利用小麥B 淀粉進行酶解產(chǎn)糖的主要來源，同時也說明了其作為酒精發(fā)酵底物的潛力。

表2 小麥B 淀粉各組分含量（%）Table 2 Content of each component of wheat B starch (%)

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶添加量對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響考察復(fù)合酶添加量對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響。結(jié)果如圖1 所示，酶添加量在3 mL 時，淀粉水解效率最為顯著（P＜0.05）。這是因為隨著酶添加量的增加，酶與底物的接觸機會增多，加速B 淀粉水解，DE 值隨之增加。酶添加量在此基礎(chǔ)上再增加時，DE 值保持不變，推測酶量已經(jīng)達到飽和，由此可知復(fù)合酶溶液為3 mL 時為最優(yōu)添加量，即α-淀粉酶添加量為36 U/g、糖化酶添加量為225 U/g，此時DE 值為85.91%。

圖1 酶添加量對DE 值的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on DE value

2.2.2 料液比對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響考察料液比對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響，由圖2 可以看出，料液比為1:20 g/mL 時，小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖的效果最好，DE 值達到87.34%。在一定范圍內(nèi)，隨著底物濃度增加，在這個范圍內(nèi)酶處于過量階段，酶與底物接觸范圍變大，使淀粉水解程度增大，DE 值隨之升高；但底物濃度過高時，會抑制酶的活性，導(dǎo)致DE 值降低[33]。因此選擇料液比為1:20 g/mL 進行后續(xù)正交試驗。

圖2 料液比對DE 值的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on DE value

2.2.3 酶解溫度對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響 考察酶解反應(yīng)溫度對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響，結(jié)果如圖3 所示，50～60 ℃時，酶的活性隨著溫度的升高逐漸增大，60 ℃時DE 值達到最高值82.77%；高于60 ℃時，超過酶的最適工作溫度，酶的活性降低，DE 值呈下降趨勢。與先前研究一致，兩種酶同時作用于淀粉水解，在60 ℃時葡萄糖釋放量最高[34]，因此選擇60 ℃的最佳溫度進行后續(xù)正交試驗。

圖3 溫度對DE 值的影響Fig.3 Effect of temperature on DE value

2.2.4 酶解時間對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響考察酶解時間對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響，由圖4 可見，隨著酶解時間的延長，DE 值顯著增加（P＜0.05）。當酶解時間小于6 h，酶解時間過短，小麥B 淀粉酶解不完全，無法充分利用酶的效果，DE 值較低。反應(yīng)時間10 h 時，DE 值達到88.59%，超過10 h 后，DE 值無顯著變化。為了考慮時間的成本，選擇10 h 進行后續(xù)試驗。

圖4 反應(yīng)時間對DE 值的影響Fig.4 Effect of time on DE value

2.2.5 pH 對小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效果的影響 由圖5 可以看出，pH 為5 時，此時水解效率最為顯著，DE 值達到76.91%，這是因為pH 過高或過低都會導(dǎo)致酶活力下降[35]。在pH 小于5 時，隨著pH 的升高，還原糖量逐漸增多；而當pH 高于5 時，隨著pH 的升高，小麥B 淀粉酶解產(chǎn)生的還原糖含量下降，DE 顯著降低（P＜0.05）。因此選擇pH 為5 時進行后續(xù)試驗。

圖5 pH 對DE 值的影響Fig.5 Effect of pH on DE value

2.3 正交試驗結(jié)果

為了優(yōu)化小麥B 淀粉酶解工藝，將復(fù)合酶用量、pH、溫度、料液比及時間這5 個因素進行正交試驗，以DE 值為評價指標，實驗結(jié)果如表3 及表4 所示。其中試驗14 中所利用條件，DE 值可以達到89.01%±1.4%。從各個因素的不同水平分析可以得到，各個因素影響DE 值順序分別為A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C2＞C1＞C3、D3＞D2＞D1、E2＞E3＞E1，因此可以確定小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖最佳工藝條件為A3B3C2D3E2，即最佳酶解產(chǎn)糖工藝的最佳條件是復(fù)合酶添加量4 mL（α-淀粉酶添加量48 U/g，糖化酶添加量300 U/g），料液比1:25 g/mL，酶解溫度60 ℃，酶解時間10 h，pH=5。在最佳工藝條件下進行三次平行測定實驗，DE 值達到94.60%±1.40%，大于正交試驗結(jié)果的最高值89.01%±1.40%，說明本參數(shù)條件可提高小麥B 淀粉酶解產(chǎn)糖效率。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance for orthogonal experiments

2.4 B 淀粉酶解前后掃描電鏡分析

利用掃描電鏡對酶解前后小麥B 淀粉進行分析，結(jié)果如圖6 所示。從圖6a 中可以觀察出，酶解前的小麥B 淀粉以小顆粒為主，還含有較大的損傷淀粉顆粒。圖6b 是經(jīng)α-淀粉酶和糖化酶酶解后的樣品，從圖中可以觀察到淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生了明顯變化，球形淀粉顆粒觀察不到，在α-淀粉酶和糖化酶作用下淀粉被完全水解[36]。

圖6 小麥B 淀粉酶解前后電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy (SEM) of wheat B starch before and after enzymatic hydrolysis

2.5 使用小麥B 淀粉酶解糖液酒精發(fā)酵

使用釀酒酵母對小麥B 淀粉酶解液發(fā)酵，酶解液中葡萄糖初始濃度29.343 g/L（表5），隨著發(fā)酵時間地進行，葡萄糖含量逐漸下降，酒精濃度逐漸升高，最終酒精濃度達到12.761 g/L，酒精原料得率為31.90%±0.28%，如表5 及圖7 所示。該結(jié)果證明了利用一步酶解發(fā)酵小麥B 淀粉生產(chǎn)酒精的潛力，為B 淀粉廢棄資源利用提供了參考價值。

圖7 釀酒酵母發(fā)酵小麥B 淀粉酶解液生產(chǎn)酒精糖降解及酒精生成情況Fig.7 Fermentation of wheat B starch hydrolysate by brewing yeast to produce alcoholic sugar degradation and alcohol production

表5 利用小麥B 淀粉酶解液發(fā)酵生產(chǎn)酒精Table 5 Alcohol production by fermentation using enzyme digest of wheat B starch

3 結(jié)論

本研究采用一步酶解法水解小麥B 淀粉，系統(tǒng)考察了酶添加量、酶解時間、pH、料液比、溫度對還原糖得率的影響。利用正交工藝進行參數(shù)優(yōu)化，采用價格比較便宜的中溫α-淀粉酶和糖化酶酶解淀粉得出了最佳工藝條件：α-淀粉酶用量48 U/g，糖化酶用量300 U/g，pH5，酶解溫度60 ℃，料液比1:25 g/mL，酶解時間時間10 h。在該條件下，DE 值為94.6%。使用釀酒酵母菌株發(fā)酵酶解液生產(chǎn)酒精乙醇可獲得12.76 g/L，酒精原料得率可達31.28%。本研究開發(fā)了一步酶解制備可發(fā)酵糖用于生產(chǎn)酒精的簡便方法，不僅可以減少資源浪費，提高經(jīng)濟效益，同時也可以拓寬酒精生產(chǎn)原料。

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