豆晴楠 趙麗麗 姬漢軒 王怡斌 陳婉蓉 孫曉涵 姚國(guó)琴 馬騰云

摘? 要：［目的］探究納米塑料（NPs）、鎘（Cd）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）污染對(duì)兒童腸道菌群多樣性、氨基酸代謝及短鏈脂肪酸（SCFAs）含量的影響.［方法］利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)和高效液相色譜-質(zhì)譜法LC-MS/MS分析NPs、Cd、DBP單一污染及納米塑料聚丙烯（PP）、Cd、DBP復(fù)合污染對(duì)兒童腸道細(xì)菌群落及腸道微生物代謝產(chǎn)物中短鏈脂肪酸及氨基酸含量的變化.［結(jié)果］高通量檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，在門屬水平上，單一污染的優(yōu)勢(shì)菌門屬無明顯變化，PP+Cd、PP+DBP+Cd復(fù)合污染優(yōu)勢(shì)菌門屬水平豐富度與多樣性顯著下降；LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果顯示，在腸道微生物代謝產(chǎn)物中，經(jīng)NPs與DBP暴露后，氨基酸含量呈現(xiàn)不同程度的下降，而 Cd、PP+Cd、PP+Cd+DBP處理后，大多數(shù)氨基酸的含量顯著增加；同時(shí)檢測(cè)到丁酸、戊酸的含量也發(fā)生變化.［結(jié)論］與單一污染物處理相比NPs相關(guān)復(fù)合污染物暴露處理后其腸道微生物紊亂程度更強(qiáng)，且不同污染物處理均會(huì)影響腸道微生物的氨基酸代謝和SCFAs產(chǎn)量.腸道菌群與人體健康密切相關(guān)，探究腸道菌群及代謝功能在NPs、Cd、DBP影響下的變化，從腸道菌群層面評(píng)價(jià)NPs、Cd、DBP單一暴露和復(fù)合暴露污染下的危害和風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義.

關(guān)鍵詞：納米塑料；鎘；鄰苯二甲酸二丁酯；腸道菌群；短鏈脂肪酸；氨基酸

中圖分類號(hào)：Q939.9????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-2367（2024）01-0033-10

微/納米塑料（micronanoscale plastics，MNPs）是指尺寸小于5 mm的塑料顆粒，主要受到水流、風(fēng)吹、陽光照射等外部環(huán)境的影響被破碎或降解所形成［1］，廣泛分布在淡水、海洋、土壤甚至空氣中.人體內(nèi)MNPs的攝入途徑主要是食物、水和空氣，如食用魚類、雙殼類、鹽、飲用水、飲料、蜂蜜、蔬菜等.另外，塑料是常用的食品包裝材料，其在食品生產(chǎn)、運(yùn)輸和包裝過程中與食品接觸會(huì)釋放出塑料顆粒，對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅.最近，在人類血液、肺、肝臟、母乳、胎盤、胎糞和嬰兒糞便中均發(fā)現(xiàn)了微塑料［2］.GREEN等［3］構(gòu)建了人腸道細(xì)胞模型，并使用納米聚苯乙烯顆粒暴露處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米塑料會(huì)影響細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.BROWN等［4］發(fā)現(xiàn)納米聚苯乙烯顆粒還會(huì)對(duì)人肺細(xì)胞產(chǎn)生炎癥作用.其他研究表明，微塑料口服暴露會(huì)導(dǎo)致受體肝臟炎癥、神經(jīng)毒性反應(yīng)，改變氨基酸和膽汁酸代謝，并改變微生物群組成［5］.

此外，由于MNPs比表面積相對(duì)較大，經(jīng)過磨損、風(fēng)化和氧化后MNPs帶負(fù)電荷，重金屬和持久性有機(jī)污

收稿日期：2023-06-20;修回日期：2023-09-18.

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)（2018YFD0200200）；新鄉(xiāng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目（GG2020006）；新鄉(xiāng)市重大科技專項(xiàng)（22ZD001）.

作者簡(jiǎn)介（通信作者）：趙麗麗（1984-），女，河南新鄉(xiāng)人，河南師范大學(xué)講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)，E-mail：zhaolili@htu.edu.cn.

引用本文：豆晴楠，趙麗麗，姬漢軒，等.納米塑料-重金屬-塑化劑聯(lián)合暴露對(duì)兒童腸道微生物菌群及代謝的影響［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，52（3）：33-42.（Dou Qingnan，Zhao Lili，Ji Hanxuan，et al.Effect of combined exposure of nanoplastics-heavy metal-plasticizer on gut microbiota and metabolism in children［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2024，52（3）：33-42.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.06.20.0003.）

染物容易在MNPs表面黏附和積累，然后在環(huán)境中遷移并進(jìn)入人體內(nèi)［5-6］.鎘（cadmium，Cd）是環(huán)境中最常見的有毒金屬污染物之一，廣泛存在于土壤、水生生態(tài)系統(tǒng)中，具有環(huán)境毒性大、易積累、降解性差等特點(diǎn).有研究報(bào)道，長(zhǎng)期低劑量Cd2+暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)沉積和肝功能障礙［7］.此外，LIU等［8］發(fā)現(xiàn)小鼠暴露于Cd2+污染物下會(huì)降低小鼠腸道總細(xì)菌的豐度及結(jié)腸中短鏈脂肪酸的水平.而MNPs對(duì)Cd的吸附可能會(huì)進(jìn)一步改變其環(huán)境行為、歸宿、生物利用度和毒性，從環(huán)境轉(zhuǎn)移到食物鏈甚至人體，這可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類健康造成更嚴(yán)重的破壞.將草魚暴露在聚苯乙烯納米塑料和Cd2+的復(fù)合環(huán)境中96 h后，相較于單一Cd2+處理組來說，納米微塑料的添加急劇增加了Cd2+的毒性，且隨著濃度的增加，協(xié)同作用隨之增強(qiáng)［9］.環(huán)境中的微塑料在制造過程中不與聚合物碳鏈聚合，降解時(shí)可能會(huì)發(fā)生一系列變化，導(dǎo)致一些具有生物毒性的塑料添加劑釋放到環(huán)境中，形成二次污染物，如鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）.在生殖能力毒性風(fēng)險(xiǎn)測(cè)評(píng)中，DBP被分類為生殖毒性第3類有毒化合物［10］.作為增塑劑，DBP被廣泛應(yīng)用于兒童玩具、醫(yī)療器械、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和各種包裝.最近的一項(xiàng)研究在母體和臍帶血清樣本中發(fā)現(xiàn)了12種鄰苯二甲酸酯代謝物［11］.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠暴露于DBP時(shí)，盲腸內(nèi)容物中腸道微生物群的組成和結(jié)構(gòu)在門和屬水平上均發(fā)生了變化.DBP暴露可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)并擾亂肝臟脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)積累，從而造成肝臟炎癥［12］.

越來越多的證據(jù)證明，環(huán)境污染物可以改變生物體內(nèi)腸道微生物的生物組成和多樣性，腸道菌群參與宿主生理功能的調(diào)節(jié)，在維持宿主健康、免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育和活動(dòng)中有重要作用.由于腸道微生物群失調(diào)會(huì)引起各種與年齡相關(guān)的疾病，生態(tài)失調(diào)已被視為全球死亡的重要原因之一［13］.我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，納米塑料（nanoplastics，NPs）、Cd，DBP均可影響植物乳桿菌的生長(zhǎng)，且質(zhì)量濃度分別為100.0、2.5、600.0 μg/mL時(shí)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響最大；聚丙烯（polypropylene，PP）與聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）相比，本文所采用的納米塑料類型中PP對(duì)植物乳桿菌的影響更大［14］，因此，本實(shí)驗(yàn)選用PP為Cd和DBP的復(fù)合污染物.然而，目前的研究大多集中在MNPs及其他污染物單一污染的危害，而MNPs的復(fù)合污染可能會(huì)造成更嚴(yán)重的健康影響，并且動(dòng)物與人體腸道菌群存在差異，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究為復(fù)合污染對(duì)動(dòng)物和水生生物的毒性影響，很少有人考慮其對(duì)人類健康的影響，因此，有必要研究MNPs、MNPs添加劑和重金屬復(fù)合污染對(duì)人體健康造成的共同危害.本文建立了腸道微生物體外培養(yǎng)體系，研究100.0 μg/mL的NPs、2.5 μg/mL的重金屬Cd和600.0 μg/mL的塑化劑DBP共同暴露時(shí)兒童腸道菌群及代謝的變化.微塑料類型主要采用PP、PE、PVC等3種常見的NPs類型.考察在Cd、DBP單一暴露污染及PP、Cd、DBP復(fù)合污染下，兒童腸道細(xì)菌群落多樣性及氨基酸代謝、短鏈脂肪酸含量的變化.本研究旨在為NPs、Cd和DBP對(duì)兒童腸道的共同作用提供理論依據(jù)，并警示人們NPs污染的風(fēng)險(xiǎn).

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試劑與藥品

無菌脫纖維綿羊血（南京亞松生物科技有限公司）；澄清瘤胃液（艾禮生物科技上海有限公司）；樹脂厭氧培養(yǎng)瓶（河南美凱生物科技有限公司）；100 nm NPs顆粒（聚丙烯PP、聚乙烯PE、聚氯乙烯PVC）（新鄉(xiāng)智寶生物科技有限公司）；鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）標(biāo)準(zhǔn)溶液、Cd鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液（北京索萊寶科技有限公司）；正丁酸、正戊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙腈、甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）.

1.1.2? 儀器

安捷倫1260液相色譜儀（美國(guó)，安捷倫）與三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)，布魯克）；低溫高速離心機(jī)Heraeus Fresco 21（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；全自動(dòng)氮吹儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；渦旋儀MI01002（美國(guó)FOUR E′S-廣西王河科技有限公司）.

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 樣品采集及處理

樣品來源于15名（8男7女）10歲以下健康供體的新鮮糞便，均無任何消化性疾病，在樣品采集前一周之內(nèi)未服用過任何藥物.排便后立即用無菌袋收集，置于冰袋上30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室并充氮?dú)夂笤? ℃下短暫保存.參考向情儒等［15］的方法處理樣品，并略加修改.從15份樣品中分別取0.5 g混合均勻，按照1∶10的體積比重懸于PBS緩沖液中，用渦旋儀充分混合5 min后使用3層無菌醫(yī)用紗布過濾，得到10%的糞便接種物，置于4 ℃冰箱備用.

1.2.2? 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)使用樹脂厭氧培養(yǎng)瓶，實(shí)驗(yàn)共分為8種不同處理，分別為PP、PE、PVC納米塑料，Cd、DBP單一污染，PP+Cd、PP+DBP、PP+Cd+DBP復(fù)合污染，在培養(yǎng)瓶中加入5 mL無菌脫纖維綿羊血，5 mL澄清瘤胃液，0.5 mL糞便接種物以及不同處理的污染物，其中NPs、Cd、DBP的終質(zhì)量濃度分別為100.0、2.5、600.0 μg/mL.相同條件下，不加任何污染物的處理為空白對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù).將處理后的培養(yǎng)瓶置于37 ℃下培養(yǎng)48 h后收集樣品，以供下一步分析.

1.2.3? 16S rRNA高通量測(cè)序

樣品總DNA提取和高通量測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行.取1 mL培養(yǎng)好的樣品離心10 min（4 ℃，6 000 r/min）取上清于離心管中并使用液氮速凍，將處理合格的樣品保存于干冰中至公司進(jìn)行總DNA提取，使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）細(xì)菌通用引物對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus Fluorometer（Promega，USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量.使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行建庫，利用Illumina公司平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）.

1.2.4? 短鏈脂肪酸的測(cè)定

取1 mL培養(yǎng)好的樣品離心10 min（4 ℃，13 000 r/min）取上清于離心管中并用0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶待測(cè).設(shè)定丙酸、丁酸、戊酸質(zhì)量濃度為0、5、10、25、50、100、200 μg/L，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過DataAnalysis軟件分析數(shù)據(jù)并記錄峰面積，采用線性回歸分析法計(jì)算不同處理對(duì)腸道細(xì)菌產(chǎn)物短鏈脂肪酸含量的影響.色譜條件：色譜柱為XDB-C18液相色譜柱，使用梯度洗脫的方法.流動(dòng)相：A（含體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的水）；B（含體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的乙腈），其中進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃.流動(dòng)相洗脫梯度見表S1.質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，MRM的正離子模式，氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣［16］；主要參數(shù)設(shè)置包括：毛細(xì)管電壓4.5 kV；端板偏移電壓0.5 kV；離子源溫度220 ℃；噴霧器電壓5.0 kV；干燥氣體條件9.0 L/min；質(zhì)荷比范圍50～1 300 m/z.

1.2.5? 氨基酸代謝產(chǎn)物的測(cè)定

按照1.2.4中的方法進(jìn)行樣品處理及檢測(cè)，根據(jù)不同種類氨基酸的分子式與相對(duì)分子質(zhì)量與樣品特征峰比對(duì)，以確定氨基酸種類并利用特征峰面積計(jì)算氨基酸含量（附錄圖S1）.

1.2.6? 方法驗(yàn)證與數(shù)據(jù)分析

從線性、檢出限（LOD）兩方面評(píng)估液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定氨基酸代謝產(chǎn)物、短鏈脂肪酸含量的準(zhǔn)確性.分別繪制不同氨基酸和短鏈脂肪酸濃度下的峰面積（Y）與濃度（X）之間的關(guān)系，氨基酸和短鏈脂肪酸在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限（LOD）以3倍信噪比計(jì)算.不同氨基酸的線性相關(guān)系數(shù)為0.997 0～0.999 1，檢出限為3.12～11.40 ng/L；短鏈脂肪酸的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 3，檢出限為0.8～1.0 ng/L，表明該方法具有較高的靈敏度.使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2（QIIME 2）分析得到的序列數(shù)據(jù)，DADA 2對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量過濾、修剪、去噪和合并，并用GreenGenes（版本13.8）參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類分析，R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)清洗和檢驗(yàn)；利用Excel進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），利用SPSS 21.0軟件，單因素分析方法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；氨基酸代謝產(chǎn)物、短鏈脂肪酸含量數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 2018；冗余分析利用Canoco進(jìn)行，使用Canoco for Windows指定分析的數(shù)據(jù)和排序模型，CanoDraw繪制排序圖；利用R語言生成物種相關(guān)性矩陣，相關(guān)性|r|＞0.6、p＜0.05挑選物種進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖分析［17］，網(wǎng)絡(luò)圖繪制使用Gephi軟件.

2? 結(jié)? 果

2.1? 不同污染對(duì)兒童腸道菌群門屬水平的影響

不同污染物暴露下兒童腸道菌群門水平變化情況見附錄圖S1，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù).兒童腸道微生物菌群在門分類水平上共鑒定出9個(gè)門，其中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），占總比例的99%～100%.與對(duì)照相比經(jīng)不同類型的NPs、DBP、Cd單一污染及PP+DBP復(fù)合污染后，Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria豐度無明顯變化，門水平細(xì)菌群落組成無顯著性差異；經(jīng)PP+Cd、PP+DBP+Cd聯(lián)合暴露后厚壁菌門的相對(duì)豐度分別升高至99.83%和94.96%，門水平多樣性明顯降低.不同污染物暴露下兒童腸道菌群屬水平變化情況如圖1所示.

圖1（a）和圖1（b）均選擇樣本中相對(duì)豐度大于0.05%的前47和46個(gè)屬，與對(duì)照相比，單一污染及PP+DBP復(fù)合污染的優(yōu)勢(shì)菌屬無明顯變化，主要為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、巨型球菌屬（Megasphaera）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus），其中Bifidobacterium，Streptococcus豐度下降.菌屬多樣性增加，新增多爾氏菌屬（Dorea）、布勞特氏菌屬（Blautia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等.與單一污染相比，在PP+Cd和PP+DBP+Cd復(fù)合污染組中優(yōu)勢(shì)菌屬有顯著差異，其中乳桿菌屬的相對(duì)豐度分別升高至97.50%和83.45%，PP+Cd樣品屬水平多樣性顯著下降.以上結(jié)果表明，在不同污染物暴露下均會(huì)使腸道菌群發(fā)生一定程度的紊亂，其中PP+Cd和PP+DBP+Cd復(fù)合污染暴露下的菌群紊亂程度最強(qiáng)，且乳桿菌屬對(duì)這2組樣品污染物耐受性最強(qiáng).

2.2? 不同污染與兒童腸道菌群相關(guān)性分析

為了了解環(huán)境變量NPs，Cd和DBP不同污染方式與兒童腸道菌群物種分類水平間的變化（每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)），運(yùn)用Canoco進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2），數(shù)據(jù)分析的4個(gè)軸的最大梯度為2.369，因此進(jìn)一步分析采用基于線性模型的RDA直接排序法.

選取了相對(duì)豐度大于0.005%的前44個(gè)菌屬，Cd與乳球菌屬（Lactococcus）、Lactobacillus、薩特氏菌屬（Sutterella）、小桿菌屬（Dialister）、Enterobacteriaceae、摩根氏菌屬（Morganella）、柯林斯菌屬（Collinsella）呈正相關(guān)，與擬桿菌屬（Bacteroides）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）等呈負(fù)相關(guān)；PVC與Cd呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)；PP、PP+Cd與梭菌屬（Clostridium）、Ruminococcus、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、Parabacteroides等呈正相關(guān)；DBP、PP+DBP、PP+DBP+Cd與梭菌目（Clostridiales）、腸球菌屬（Enterococcus）、Streptococcus、不動(dòng)菌屬（Acinetobacter）、芽殖菌屬（Gemmiger）等呈正相關(guān)，與布勞特氏菌屬（Blautia）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、巨型球菌屬（Megasphaera）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）等呈負(fù)相關(guān)；PE與DBP、PP+DBP、PP+DBP+Cd呈相反的趨勢(shì).

2.3? 不同污染對(duì)兒童腸道細(xì)菌群落影響的網(wǎng)絡(luò)分析

探索納米塑料、重金屬、塑化劑與兒童腸道細(xì)菌類群之間的關(guān)聯(lián)，圖3（a）和圖3（b）分別顯示了單一污染（PP、PE、PVC、Cd、DBP處理組）和復(fù)合污染（PP+Cd、PP+DBP、PP+Cd+DBP處理組）下微生物之間的相互關(guān)系，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù).由圖3可以看出，單一污染和復(fù)合污染中細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)第一優(yōu)勢(shì)菌門均是厚壁菌門，分別為85.29%和84.38%；圖3（a，b）均以正相關(guān)關(guān)系為主，正相關(guān)比例分別為77.65%和90.91%.通過計(jì)算分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征參數(shù)描述菌群之間復(fù)雜的相互關(guān)系，圖3（a）中節(jié)點(diǎn)數(shù)為34，連接數(shù)為85，其中糞球菌屬連通數(shù)最高（7），與其他節(jié)點(diǎn)多為負(fù)相關(guān)關(guān)系；圖3（b）中節(jié)點(diǎn)數(shù)為32，連接數(shù)為88，Lactobacillus，Parabacteroides，Phascolarctobacterium，Megasphaera，Veillonella，Collinsella，Bacteroides，Sutterella，Clostridium的連接數(shù)最高（均為8），除Lactobacillus外與周圍節(jié)點(diǎn)均為正相關(guān)關(guān)系；并且這9個(gè)節(jié)點(diǎn)之間相互作用，Lactobacillus與其他8個(gè)節(jié)點(diǎn)以競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系互作；與圖3（a）相比，圖3（b）的邊數(shù)、平均度、平均聚類系數(shù)、連接部件和圖密度均較高，模塊化指數(shù)和網(wǎng)絡(luò)直徑較低，但兩者模塊化指數(shù)大于0.4，說明網(wǎng)絡(luò)均具有模塊化結(jié)構(gòu).

兩組細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)第一優(yōu)勢(shì)菌門均是Firmicutes，分別為85.29%和84.38%，由此說明，單一污染物細(xì)菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中物種更豐富、互作關(guān)系更復(fù)雜；復(fù)合污染中Collinsella，Clostridium，Megasphaera，Collinsella等致病菌在復(fù)合污染中以共生關(guān)系與周圍細(xì)菌互作；Lactobacillus與周圍節(jié)點(diǎn)均為負(fù)相關(guān)關(guān)系（100%），說明Lactobacillus多以競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系與周圍細(xì)菌互作.本研究構(gòu)建的兩個(gè)分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中均為正相關(guān)關(guān)系占優(yōu)勢(shì)（77.65%、90.91%），表明合作關(guān)系大于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系.

2.4? 不同污染處理對(duì)兒童腸道代謝的影響

2.4.1? 對(duì)腸道微生物氨基酸代謝的影響

使用LC-MS/MS測(cè)定腸道微生物培養(yǎng)系統(tǒng)中19種氨基酸的含量，并將測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入Origin，數(shù)據(jù)經(jīng)Z評(píng)分進(jìn)行歸一化處理后繪制熱圖，用來表達(dá)不同污染物單一處理及復(fù)合污染等8種不同處理方式對(duì)腸道微生物氨基酸代謝的影響，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù).如圖4（a）所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)NPs與DBP單一暴露后，除甘氨酸、纈氨酸和蘇氨酸外，其他氨基酸含量均有不同程度的下降，其中亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸下降最明顯；Cd單一暴露、PP+Cd、PP+Cd+DBP復(fù)合暴露后，大多數(shù)氨基酸的含量顯著增加.由此說明，不同污染物處理均會(huì)影響氨基酸代謝.

2.4.2? 對(duì)兒童腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的影響

如圖4（b）所示，研究了不同污染對(duì)兒童腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs的影響，鑒定了腸道微生物培養(yǎng)體系中丁酸和戊酸的含量（每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)）.與對(duì)照組相比，腸道微生物產(chǎn)生丁酸的量在PP、PVC、DBP暴露下有所升高，而在PE處理下含量基本不變.在Cd、PP+DBP、PP+Cd、PP+DBP+Cd等4個(gè)處理組中，丁酸含量均為0.在PP、PE、PVC、DBP和PP+Cd組中，戊酸的含量大幅度增加，與對(duì)照相比有極顯著性差異；而Cd、PP+DBP、PP+DBP+Cd組的戊酸含量降低.以上述結(jié)果可知，添加納米塑料、重金屬、塑化劑后對(duì)腸道微生物代謝產(chǎn)物SCFAs的含量均有一定程度的影響.

3? 討? 論

腸道菌群是生物體內(nèi)一個(gè)非常重要的微生態(tài)系統(tǒng)，主要依靠宿主生物的腸道生存并發(fā)揮相應(yīng)的功能.人體微生物群落組成和多樣性與人體健康密切相關(guān).本項(xiàng)研究中利用高通量測(cè)序和液相質(zhì)譜聯(lián)用分析了納米塑料、重金屬和塑化劑在單一污染和復(fù)合污染時(shí)對(duì)兒童腸道細(xì)菌群落組成、分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)特征、氨基酸和短鏈脂肪酸產(chǎn)物的影響，是研究?jī)和⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)及其代謝功能響應(yīng)的關(guān)鍵.研究結(jié)果表明，經(jīng)不同污染物暴露后，兒童腸道菌群發(fā)生紊亂的程度也具有差異性.與PP+Cd、PP+Cd+DBP復(fù)合污染相比，單一污染的門屬水平變化較小，可能是因?yàn)閺?fù)合污染時(shí)微塑料會(huì)將Cd2+吸附在表面，共同作用于人體，對(duì)腸道菌群造成更嚴(yán)重的危害，其中NPs-PP與Cd聯(lián)合暴露后，腸道菌群門水平數(shù)量顯著減少，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度增加，這與JIN等［18］在NPs對(duì)斑馬魚腸道菌群影響的研究結(jié)果一致.Firmicutes和Bacteroidetes是腸道微生物群中的2種主要細(xì)菌，病理學(xué)上，F(xiàn)irmicutes可誘導(dǎo)肥胖和肝脂肪變性，并促進(jìn)TNF-α mRNA水平的升高，F(xiàn)irmicutes可能參與了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制，并且膽石病患者、多發(fā)性硬化癥患者［19］Firmicutes的數(shù)量均顯著增加.Firmicutes與Bacteroidetes的比值（F/B）與炎癥狀況密切相關(guān)，如炎癥性腸?。↖BD）和肥胖個(gè)體都存在較高的比值.本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照相比PP、PVC、DBP、PP+Cd、PP+Cd+DBP實(shí)驗(yàn)組的F/B增加，從20.8分別增加至25.5、21.0、82.6、1 836.3、91.6；LOUIS等［20］為16名肥胖患者實(shí)施了一項(xiàng)減肥計(jì)劃，結(jié)果顯示肥胖患者的F/B比率高于健康組.然而與PP+Cd相比，PP+Cd+DBP復(fù)合污染時(shí)Firmicutes豐度相對(duì)略有降低，Bacteroidetes豐度及門水平數(shù)有所回升，可能是因?yàn)镈BP與Cd共同存在下呈現(xiàn)出拮抗作用.

在屬水平上，經(jīng)污染物暴露后Bifidobacterium、鏈球菌屬（Streptococcus）相對(duì)豐度降低.Bifidobacterium豐度降低會(huì)使小鼠體重增加、脂肪堆積并降低葡萄糖耐量，引起代謝紊亂［21］，這些益生菌豐度的下降會(huì)破壞腸道微生態(tài)平衡，降低腸道免疫能力及健康程度.另外，不同污染物暴露后新增多爾氏菌屬（Dorea）、Blautia，Ruminococcus、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅氏菌屬（Roseburia），其豐度均與慢性疾病包括炎癥性腸病、結(jié)腸癌、肥胖等密切相關(guān)［22］.有實(shí)驗(yàn)研究了不同胃腸道疾病患者腸道菌群的變化，其中腸易激綜合征會(huì)導(dǎo)致Faecalibacterium豐度升高，潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)使Blautia，Roseburia豐度升高，克羅恩病會(huì)使Ruminococcus豐度升高［23］.PP+Cd、PP+DBP+Cd復(fù)合污染時(shí)，菌群多樣性降低，優(yōu)勢(shì)菌群由Enterobacteriaceae變?yōu)長(zhǎng)actobacillus，Lactobacillus相對(duì)豐度增高至97.50%和83.45%.ZHAI等［24］研究表明乳酸菌對(duì)重金屬鎘具有強(qiáng)的耐受能力，且在二價(jià)金屬Cd離子存在下，會(huì)促使細(xì)胞表面分泌物增多，細(xì)胞發(fā)生聚集形成生物膜.段莉陽等［25］的研究表明，在重金屬和微塑料等脅迫條件下，具有相應(yīng)耐受能力的微生物會(huì)與微塑料黏附，并得以富集生長(zhǎng).所以本實(shí)驗(yàn)中，Lactobacillus豐度升高可能是由于PP+Cd、PP+Cd+DBP共同污染時(shí)，Lactobacillus為抵御不良環(huán)境，與PP發(fā)生黏附，使細(xì)胞聚集形成生物膜，造成豐度升高，說明乳酸菌有較強(qiáng)的耐受性.總之，不同的污染物暴露下都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌群落在門屬水平上的多樣性和豐富度呈現(xiàn)明顯差異，并且與單一污染相比復(fù)合污染的差異性更強(qiáng)，因此，腸道菌群對(duì)于維持宿主的健康非常重要.

網(wǎng)絡(luò)分析與腸道菌群的多樣性分析相比，網(wǎng)絡(luò)分析更便于體現(xiàn)微生物之間的相互作用以及結(jié)構(gòu)變化.在分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)圖中，正相關(guān)通常代表生態(tài)位一致性或共生關(guān)系，負(fù)相關(guān)代表競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系.在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，復(fù)合污染時(shí)Lactobacillus以競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系與周圍細(xì)菌互作，Lactobacillus豐度的增加使腸道菌群多樣性降低.本研究構(gòu)建的兩個(gè)分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中均為正相關(guān)關(guān)系占優(yōu)勢(shì)，表明整體上合作關(guān)系大于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但復(fù)合污染更能促進(jìn)微生物之間的共生關(guān)系.同時(shí)，與單一污染相比，復(fù)合污染具有較短的平均路徑長(zhǎng)度（1）和較高的平均聚類系數(shù)（0.928）.平均路徑長(zhǎng)度表示物質(zhì)、信息、能量在微生物之間的傳遞效率，平均聚類系數(shù)表示節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接程度［26］.由此說明，復(fù)合污染下微生物之間的關(guān)系更密切，網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)之間的響應(yīng)速度和傳遞效率更高，群落結(jié)構(gòu)更易發(fā)生變化.復(fù)合污染的連接數(shù)和平均度均較高，說明復(fù)合污染下細(xì)菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中物種互作關(guān)系更復(fù)雜；單一污染的節(jié)點(diǎn)數(shù)較高，說明單一污染下物種更豐富.

腸道微生物群在氨基酸消化和吸收過程中起著至關(guān)重要的作用，氨基酸代謝的多樣性可能會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生有益或不利的影響.Clostridium、Bacteroides、Bifidobacterium豐度與氨基酸代謝能力密切相關(guān)，而復(fù)合污染時(shí)它們的豐度降低，使氨基酸的分解與利用率下降，在人體腸道大量積累.研究表明，克羅恩病患者糞便中高水平的氨基酸，如丙氨酸、β-丙氨酸和苯丙氨酸，部分原因可能是這些患者的炎癥引起的吸收不良，或反映了產(chǎn)生細(xì)菌的增加［27］.微生物群衍生分子（如SCFAs）作為微生物群和宿主之間的重要分子信號(hào)或調(diào)節(jié)宿主代謝的代謝底物［28］.復(fù)合污染時(shí)，氨基酸代謝產(chǎn)物丙酸、丁酸含量為0，丁酸作為腸道上皮細(xì)胞線粒體呼吸的主要能量來源，在組蛋白去乙?；^程中起到重要作用，廣泛影響腸道上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的繁殖和代謝［29］.戊酸含量大幅上升，可能是因?yàn)長(zhǎng)actobacillus，Ruminococcus豐度的升高.丁酸對(duì)糖尿病有較大的有益作用，并在構(gòu)建腸道粘膜結(jié)構(gòu)和腸道免疫屏障中起重要作用［30］.NPs暴露會(huì)降低腸道中雙歧桿菌的豐度，并顯著降低腸道菌群中雙歧桿菌/大腸桿菌（B/E）值，其中PP+Cd的B/E值為0，腸道定植能力明顯減弱，影響腸道微生物的代謝功能，降低短鏈脂肪酸的含量.另外，由于本實(shí)驗(yàn)是將人體糞便細(xì)菌進(jìn)行體外培養(yǎng)和暴露，缺少了腸道內(nèi)環(huán)境的相互作用.所以，目前的結(jié)果對(duì)污染物人體健康效應(yīng)的意義有限，沒有辦法直接外推至人體.關(guān)于NPs、Cd、DBP單一污染和復(fù)合污染對(duì)兒童腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的改變還需要更多的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究.

4? 結(jié)? 論

本實(shí)驗(yàn)研究了NPs（PP、PE、PVC）、Cd、DBP單一污染和復(fù)合污染對(duì)兒童腸道細(xì)菌群落、短鏈脂肪酸含量和氨基酸代謝能力的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一方面，在腸道菌群多樣性分析上，不同處理均會(huì)使腸道菌群發(fā)生不同程度的紊亂，細(xì)菌群落的多樣性和豐富度都呈現(xiàn)明顯差異，且復(fù)合污染時(shí)差異更明顯.單一污染時(shí)優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes，優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Megasphaera、Bifidobacterium.而PP+Cd、PP+DBP+Cd復(fù)合污染時(shí)Firmicutes占比較大，乳桿菌顯示出對(duì)污染物更強(qiáng)的耐受性.同時(shí)，在腸道菌群相互關(guān)系上，復(fù)合污染時(shí)也比單一污染時(shí)微生物互作關(guān)系更復(fù)雜.另一方面，在腸道微生物代謝分析上，納米塑料與重金屬、塑化劑復(fù)合污染時(shí)會(huì)影響氨基酸的代謝及短鏈脂肪酸的合成，氨基酸比例失衡使腸道黏膜受損，短鏈脂肪酸合成能力下降會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及免疫防御能力，危害人體健康.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.06.20.0003）.

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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Effect of combined exposure of nanoplastics-heavy metal-plasticizer on gut microbiota and metabolism in children

Dou Qingnan1， Zhao Lili1， Ji Hanxuan2， Wang Yibin1， Chen Wanrong1， Sun Xiaohan1， Yao Guoqin1， Ma Tengyun1

（1. College of Life Science， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China; 2. Whole-process Teaching Base， Xinxiang Medical College， Xinxiang 453003， China）

Abstract： ［Objective］ To explore the effects of nano-plastics（NPs）， cadmium（Cd） and dibutyl phthalate（DBP） on intestinal flora diversity， amino acid metabolism and short-chain fatty acid content in children. ［Methods］ The effects of single and combined pollution of nano-plastics（polypropylene，PP）， Cd and DBP on the contents of short-chain fatty acids and amino acids in intestinal bacterial communities and intestinal microbial metabolites in children were analyzed by high throughput sequencing technology of 16S rRNA and high performance liquid chromatogen-mass spectrometry（LC-MS/MS）. ［Results］ The high-throughput test results showed that， compared with the control， at the phylum genus level， the dominant bacteria with single pollution had no significant change， and the diversity of the dominant bacteria with PP+Cd， PP+DBP+Cd combined pollution significantly decreased. The results of LC-MS/MS test showed that the amino acid content of intestinal microbial metabolites decreased to varying degrees after exposure to NPs and DBP， while the content of most amino acids increased significantly after Cd， PP+Cd， PP+Cd+DBP treatment. The content of butyric acid and valerate also changed. ［Conclusion］ Compared with the single pollutant treatment， the intestinal microbial disorder is stronger after exposure to nano-plastics-related complex pollutants， and different pollutant treatments could affect the amino acid metabolism and SCFAs production of intestinal microorganisms. Intestinal flora is closely related to human health. It is of great significance to explore the changes of intestinal flora and metabolic function under the influence of NPs， Cd and DBP， and to evaluate the hazards and risks of single exposure and combined exposure to NPs， Cd and DBP from the level of intestinal flora.

Keywords： nano-plastics; cadmium; dibutyl phthalate; gut microbiota; short-chain fatty acids; amino acid

［責(zé)任編校? 劉洋? 楊浦］

附? 錄