蔡夢霞 魏婷婷 朱凌鵬 姚 勇

年齡相關(guān)性黃斑變性 (AMD) 常侵及視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域,導致進行性中心視力喪失[1]。其特征是中央視網(wǎng)膜進行性退化,優(yōu)先累及黃斑區(qū)感光細胞、視網(wǎng)膜色素上皮 (RPE) 細胞、Bruch膜或脈絡(luò)膜微循環(huán)[2]。臨床上,AMD分為干性(或稱萎縮性、非滲出型)和濕性(或稱新生血管性、滲出型) 兩種類型。干性AMD的患病率較濕性AMD高,而且干性AMD在晚期有可能向濕性AMD發(fā)展。玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物在治療濕性AMD方面效果顯著,但對于干性AMD目前仍無有效的治療手段[3]。退行性疾病的發(fā)生與細胞衰老有關(guān)。細胞衰老是一種生理機制,當受到損傷或應(yīng)激刺激時,增殖細胞經(jīng)歷不可逆的細胞周期停滯狀態(tài),并引起分泌表型,影響多種生理和病理過程[4]。越來越多的研究表明,細胞衰老在干性AMD的疾病進展中起著重要作用。本文就近年來細胞衰老在干性AMD中的作用展開綜述,為干性AMD的發(fā)病機制和治療方案提供新思路。

1 AMD的臨床現(xiàn)狀及發(fā)病機制

AMD是全球老年人失明的主要原因之一。隨著人口老齡化,預計到2040年,全球?qū)⒂?.88億人受到AMD的影響[5]。AMD有多種危險因素,包括年齡、性別、遺傳、種族、體重指數(shù)、吸煙、飲酒、慢性光損傷、高血壓和高脂血癥等,其中年齡是AMD最主要的危險因素[1]。AMD的病理特征主要為黃斑部玻璃膜疣、RPE萎縮、脈絡(luò)膜新生血管 (CNV)、神經(jīng)感覺性視網(wǎng)膜脫離和盤狀瘢痕[2]。AMD分為早期、中期和晚期三個臨床階段。玻璃膜疣是干性AMD早期的臨床特征,大多數(shù)患者中心性視力喪失發(fā)生在AMD的中晚期。干性AMD進展到晚期可分為兩類:新生血管性AMD和地理性萎縮 (GA)。新生血管性AMD的特征是CNV穿過Bruch膜進入視網(wǎng)膜,導致RPE層或視網(wǎng)膜滲出、出血和脫離,引起嚴重的視力喪失。GA的特征是黃斑中的RPE細胞、感光細胞和脈絡(luò)膜毛細血管 (CC) 緩慢惡化,導致進行性視力喪失[6]。干性AMD患者由于視網(wǎng)膜細胞衰老表現(xiàn)出代謝功能和自噬活性改變,加速玻璃膜疣沉積,誘發(fā)炎癥反應(yīng),進一步導致RPE細胞和感光細胞功能障礙、CC萎縮、CNV形成,最終促使AMD疾病進展[7]。

2 細胞衰老的作用機制

目前,細胞衰老被定義為一種細胞在某些生理過程中或受到應(yīng)激性損傷時引發(fā)的不可逆的細胞周期停滯狀態(tài),具有典型的大分子損傷、細胞周期停滯、衰老相關(guān)分泌表型(SASP)及代謝紊亂4大特征[8]。細胞衰老的主要機制包括DNA損傷、端?？s短、氧化應(yīng)激和細胞周期阻滯;隨著年齡的增長,衰老細胞在各種人體組織中積累,表達SASP,引起年齡相關(guān)性疾病[9]。

最廣泛使用的細胞衰老標志物包括β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 活性增加,脂褐素積蓄,細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子p16INK4a、p21CIP1、p53和pRB表達增加,SASP因子表達增加,端粒誘導的功能障礙灶、衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶和其他染色質(zhì)修飾的積累等[10]。

細胞衰老可由各種來源的DNA損傷、端粒過度縮短、遺傳毒性因素、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、致癌基因激活等多種應(yīng)激因素引起。這些因素激活p53/p21CIP1和p16INK4a/RB這兩條信號通路,調(diào)節(jié)細胞周期的G1期,導致不可逆的細胞周期阻滯。在p53/p21CIP1通路中,p53在受到DNA損傷刺激后通過磷酸化(p-p53)被激活,上調(diào)p21CIP1的瞬時表達,抑制細胞周期蛋白E-CDK2復合體;在p16INK4a/RB通路中,當INK4a/ARF遺傳位點激活時,p16INK4a直接抑制細胞周期蛋白D-CDK4/6復合體。這兩條通路均可使RB去磷酸化,抑制E2F (促進細胞周期從G1期過渡到S期的轉(zhuǎn)錄因子) 活性,從而阻止細胞周期,最終導致細胞衰老[11]。

細胞衰老的另一個關(guān)鍵特征是分泌SASP,包括生長因子、促炎細胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等。SASP介導了衰老細胞的許多病理生理效應(yīng),其既是衰老細胞的標志,也可以通過自分泌和旁分泌方式誘發(fā)低度炎癥,驅(qū)動鄰近細胞衰老,與年齡相關(guān)性疾病的病理發(fā)展有關(guān)[12]。

因此,細胞衰老被認為是干性AMD發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。

3 細胞衰老在AMD發(fā)病機制中的作用

各種視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織細胞,包括RPE細胞、小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞的衰老變化,與先天性細胞和適應(yīng)性細胞的系統(tǒng)免疫衰老同步,已成為AMD發(fā)生和發(fā)展的重要因素[7]。

3.1 RPE細胞衰老與干性AMD

RPE細胞是由排列在視網(wǎng)膜最外層的單層正多邊形細胞形成,外側(cè)與Bruch膜和脈絡(luò)膜相連,內(nèi)側(cè)與感光細胞的外節(jié)相連,是視網(wǎng)膜的基本組成部分,在視覺功能中發(fā)揮重要的作用[13]。RPE細胞主要負責將營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)礁泄饧毎?并吞噬其脫落的外節(jié),防止玻璃膜疣的形成,維持視覺周期和感光細胞健康。RPE 細胞的其他功能包括維持血-視網(wǎng)膜屏障、吸收多余的光、處理類視黃醇以進行光轉(zhuǎn)導、排出視網(wǎng)膜下液、視覺色素的運輸和再生、調(diào)節(jié)鄰近組織中的離子濃度等,這對維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[13]。

RPE細胞功能障礙與AMD的發(fā)病機制密切相關(guān),由于DNA損傷、端?？s短、氧化應(yīng)激等導致的RPE細胞衰老是AMD發(fā)生發(fā)展的重要因素。

不同類型的內(nèi)源性和外源性因素會導致 DNA 損傷,形成DNA雙鏈和單鏈斷裂[14]。持續(xù)的DNA損傷激活了DNA損傷反應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng),主要通過激活和募集ATM和ATR,磷酸化Chk1和Chk2,激活p53/p21CIP1通路,誘導細胞衰老[15]。氧化應(yīng)激是AMD發(fā)病機制中公認的因素,香煙煙霧濃縮物、過氧化氫(H2O2)和光產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可導致活性氧(ROS)水平和DNA損傷明顯增加,誘導RPE細胞過早衰老。N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 作為一種ROS清除劑,可減少衰老標志物,保護RPE細胞免受香煙煙霧誘導的氧化損傷[16]。巖藻黃質(zhì)是一種類胡蘿卜素,能夠逆轉(zhuǎn) RPE細胞受氧化應(yīng)激誘導的過早衰老,并減少碘酸鈉誘導的AMD動物視網(wǎng)膜感光細胞的丟失[17]。

端粒由位于染色體末端(TTAGGG)的nDNA重復序列和相關(guān)蛋白質(zhì)組成,維持染色體穩(wěn)定和細胞增殖。端粒隨著細胞分裂而縮短,連續(xù)幾輪的細胞復制和端?？s短暴露了染色體末端,細胞將其感知為內(nèi)源性DNA損傷,主要以雙鏈斷裂的形式激活DNA損傷反應(yīng)途徑,誘導細胞復制性衰老[18]。此外,氧化應(yīng)激也與端粒的加速縮短和功能障礙有關(guān)[19]。而端粒酶可以在染色體末端增加端粒重復序列使端粒延長,抵消由于末端復制問題或氧化損傷而導致的端粒序列丟失,維持基因組穩(wěn)定性,預防衰老[20]。研究表明,體外培養(yǎng)的人RPE細胞系RPE-340顯示出端?？s短和衰老;但是用編碼人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的載體轉(zhuǎn)染可延長端粒,減少SA-β-gal表達,增加細胞壽命[21]。隨著年齡的增長,脂褐素在RPE細胞中積累。N-視黃醇-N-視黃醇胺 (A2E,脂褐素的熒光團) 的光敏化增加了端粒脫保護和缺失,誘導RPE細胞衰老,還可通過NF-κB途徑表達IL1B、IL13RA2和CXCR4等促炎因子來影響視網(wǎng)膜的微環(huán)境,促使視網(wǎng)膜變性。而端粒酶的過表達挽救了A2E介導的RPE細胞衰老,阻止AMD進展[22]。Dow等[23]報道了口服端粒酶激活劑-65能夠激活端粒酶并改善早期AMD患者的黃斑功能。以上研究表明,端粒功能障礙在RPE細胞衰老中起重要作用,保護端粒是治療AMD的有效策略。

3.2 小膠質(zhì)細胞活化與干性AMD

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括視網(wǎng)膜)的常駐免疫細胞。在早期發(fā)育過程中,小膠質(zhì)細胞遷移到視網(wǎng)膜,轉(zhuǎn)化為高度分支的表型,并不斷監(jiān)測視網(wǎng)膜組織微環(huán)境,在維持視網(wǎng)膜和大腦的正常功能方面起著關(guān)鍵作用。任何可能危害神經(jīng)元和威脅組織完整性的動態(tài)平衡紊亂均可激活小膠質(zhì)細胞,釋放細胞因子、趨化因子和生長因子,導致病理性改變[24]。

健康的小膠質(zhì)細胞主要呈分枝狀,多分布在視網(wǎng)膜內(nèi)層,具有快速運動和細胞遷移的動態(tài)行為,作為視網(wǎng)膜中的吞噬細胞,負責清除損傷部位的病原體、死細胞和蛋白質(zhì)聚集體,是免疫監(jiān)視和組織修復的關(guān)鍵。然而,隨著年齡的增長,衰老的小膠質(zhì)細胞體積變小、分支減少、運動速度減慢,并能夠遷移到視網(wǎng)膜下腔,因此,其維持免疫監(jiān)視和組織修復的能力下降,表型多樣性和吞噬能力受損,導致蛋白質(zhì)聚集體和髓鞘碎片逐漸積累,進一步誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性,促進AMD的發(fā)展[24-25]。

AMD的病理生理特征與小膠質(zhì)細胞相關(guān)炎癥有關(guān)。CX3CL1-CX3CR1是小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元串擾的關(guān)鍵信號通路,CX3CL1在神經(jīng)元中豐富表達,而小膠質(zhì)細胞是視網(wǎng)膜中唯一表達 CX3CR1 的細胞[26]。在AMD患者的視網(wǎng)膜中,CX3CR1突變誘導小膠質(zhì)細胞向視網(wǎng)膜下腔的遷移,導致玻璃膜疣形成和感光細胞變性[27]。β淀粉樣蛋白(Aβ)是玻璃膜疣的主要成分。有研究表明,小鼠玻璃體內(nèi)注射Aβ1-40通過上調(diào)PFKFB3 (糖酵解的主要調(diào)節(jié)酶)誘導小膠質(zhì)細胞活化,增加IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18等炎性細胞因子的釋放,從而導致RPE細胞功能紊亂和感光細胞凋亡[28]。而敲除PFKFB3可以抑制RPE細胞功能紊亂,挽救視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能。因此,調(diào)節(jié)PFKFB3介導的小膠質(zhì)細胞糖酵解和活化是治療AMD的一種有效策略[29]。研究發(fā)現(xiàn),在AMD慢性模型中使用米諾環(huán)素可通過減少小膠質(zhì)細胞的增殖、減少細胞因子和一氧化氮合酶的產(chǎn)生來抑制小膠質(zhì)細胞的活化,減少視網(wǎng)膜神經(jīng)元丟失,改善視覺功能[30]。因此,抑制衰老相關(guān)的小膠質(zhì)細胞活化可緩解AMD的進展。

3.3 脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞丟失與干性AMD

脈絡(luò)膜是RPE下方的血管床,位于Bruch膜和鞏膜之間。CC是視網(wǎng)膜外層(RPE和感光細胞)的主要血供,為高度代謝活躍的視網(wǎng)膜供氧,CC內(nèi)皮細胞的丟失是AMD發(fā)生的關(guān)鍵因素[31]。

早期干性AMD患者的脈絡(luò)膜血管中沉積著大量補體途徑的膜攻擊復合物,導致脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞丟失、CC變性和RPE萎縮。研究發(fā)現(xiàn),衰老恒河猴的脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出由細胞骨架調(diào)節(jié)因子 Rac 和 Rho活性上調(diào)介導的高水平SA-β-gal活性和異常的細胞骨架收縮力[32]。細胞硬度受 Rho 調(diào)節(jié),Rho 通過其下游靶標 ROCK(Rho 相關(guān)激酶)調(diào)節(jié)基于肌動蛋白/肌球蛋白的細胞骨架張力和皮質(zhì)肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成。衰老導致脈絡(luò)膜血管僵硬并增加了CC對膜攻擊復合物誘導的內(nèi)皮細胞死亡和血管功能障礙的敏感性[32-33]。因此,脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞的衰老以及由此導致的血管功能障礙在AMD進展中發(fā)揮著重要作用。

3.4 線粒體功能障礙與干性AMD

線粒體功能障礙與衰老細胞中氧化應(yīng)激的增加有關(guān)。衰老細胞表現(xiàn)出線粒體質(zhì)量控制、膜電位和線粒體形態(tài)的變化。沉默線粒體調(diào)節(jié)蛋白以及抑制線粒體功能的化學抑制劑均可能會引發(fā)衰老[34]。

AMD患者的RPE細胞顯示線粒體功能障礙。氧化應(yīng)激可以誘導ARPE-19細胞線粒體功能障礙,外源性線粒體移植可改善線粒體功能,延緩細胞衰老[35]。Humanin是一種線粒體編碼的肽,通過磷酸化STAT3和抑制caspase-3的激活來保護RPE細胞免受氧化應(yīng)激誘導的細胞死亡,恢復線粒體功能,并直接防止衰老[36]。青蒿素通過激活p38和ERK1/2通路,抑制H2O2誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)元RGC-5細胞ROS的積聚,使線粒體膜電位升高,細胞凋亡減少。玻璃體內(nèi)注射青蒿素可以逆轉(zhuǎn)干性AMD大鼠視網(wǎng)膜的光暴露損傷[37]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α (PGC-1α) 是一種參與線粒體代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與細胞衰老和許多與年齡相關(guān)的疾病相關(guān),包括AMD。高脂飼料喂養(yǎng)的PGC-1α基因沉默小鼠在其RPE和視網(wǎng)膜形態(tài)和功能上呈出AMD樣改變,包括玻璃膜疣沉積、Bruch增厚、RPE和感光細胞變性、線粒體活性降低、ROS水平增加、自噬動力學/通量降低以及視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)增加[38]。PGC-1α通過上調(diào)抗氧化酶和DNA損傷反應(yīng)保護RPE細胞免受氧化應(yīng)激影響,從而緩解AMD進展[38]。以上研究表明,線粒體功能障礙在RPE細胞衰老中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

3.5 溶酶體自噬功能失調(diào)與干性AMD

自噬是由自噬小體的雙膜小泡隔離細胞成分(異常蛋白質(zhì)、受損細胞器或病原體) 并運送到溶酶體進行降解的一種生理過程。除蛋白質(zhì)聚集體、受損細胞器和感染因子外,自噬還可以被營養(yǎng)饑餓、生長因子剝奪、缺氧、ROS和DNA損傷等刺激激活[39]。自噬受眾多因素調(diào)控,包括自噬相關(guān)蛋白(ATG)、哺乳動物雷帕霉素靶標(mTOR)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(ULK1)、FIP200、p62(SQSTM1)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)[40]。自噬在衰老及衰老相關(guān)疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自噬增強可以延緩衰老,延長壽命;而自噬功能失調(diào)則導致突變和錯誤折疊的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)積累,這是神經(jīng)退行性疾病和其他衰老相關(guān)疾病出現(xiàn)和發(fā)展的基礎(chǔ)[41]。

細胞自噬能力降低與AMD的發(fā)病機制有關(guān)。暴露于氧化應(yīng)激下的RPE細胞自噬失活,使聚集蛋白和受損細胞器的去除減少,導致視網(wǎng)膜下沉積物的形成和積累[42]。mTOR是自噬的重要負性調(diào)節(jié)因子,抑制了ULK1-ATG13-RB1CC1/FIP200復合體形成。研究表明,mTOR抑制劑雷帕霉素逆轉(zhuǎn)H2O2誘導的ARPE-19細胞自噬活性降低、ROS和脂褐素樣顆粒的積累[43]。Yao等[44]敲除小鼠的Rb1cc1基因后發(fā)現(xiàn),RPE中顯著的自噬缺陷,如LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化減少,自噬靶向前體積累,伴炎癥和氧化損傷蛋白及視網(wǎng)膜下玻璃膜疣的沉積。在RPE細胞中,依賴SQSTM1/p62的Keap1選擇性自噬激活NFE2L2/Nrf2抗氧化程序,從而抑制炎癥并防止氧化應(yīng)激[45]。RPE細胞衰老下調(diào)Nrf2的表達并削弱Nrf2和p62之間的相互作用,導致自噬功能失調(diào),促使脂褐素和玻璃膜疣積累,加速細胞衰老并驅(qū)動活躍的炎癥反應(yīng)[46]。芹菜素作為一種具有顯著抗氧化活性的黃酮類化合物,以Nrf2依賴的方式上調(diào)p62和LC3-II的表達,減輕了干性AMD小鼠的視網(wǎng)膜氧化損傷[47]。GATA4是細胞衰老的關(guān)鍵調(diào)控因子。衰老抑制了GATA4通過p62介導的選擇性自噬降解,因此,GATA4可能是AMD發(fā)病機制中衰老與自噬相關(guān)的候選基因,抑制GATA4通路可能為治療或干預AMD提供新途徑[48]。以上研究表明,增強溶酶體自噬功能可以延緩AMD進展。

3.6 慢性炎癥與干性AMD

衰老引發(fā)的SASP是細胞衰老中典型的慢性炎癥反應(yīng)的主要來源。SASP介導衰老和年齡相關(guān)性疾病相關(guān)的低水平炎癥過程[12]。在復制性衰老或過早衰老誘導的人RPE細胞研究中發(fā)現(xiàn),IL- 6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、單核細胞趨化蛋白-1、TNF-α、VEGF、MMP-9、干擾素-γ、補體因子B、TGF-β等炎癥因子含量增加。同時發(fā)現(xiàn)多種炎性細胞因子在AMD患者血清或房水中局部升高,特別是IL-6、IL-8、IL-12、單核細胞趨化蛋白-1、TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-17[7]。

過度氧化應(yīng)激和DNA損傷可以觸發(fā)炎癥小體活化,激活NF-κB和IL-1β介導的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。在衰老細胞的染色質(zhì)中,NF-κB和C/EBPβ被激活和富集,誘導SASP的關(guān)鍵炎性因子 (如IL-6或IL-8) 的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)SASP成分。進一步,IL-6和IL-8通過正反饋通路增強NF-κB和C/EBPβ的活性并促進SASP信號轉(zhuǎn)導[49]。研究表明,衰老的內(nèi)皮細胞分泌IL-1β,上調(diào)p21/p53的表達,增強SASP并促進細胞衰老。NOD樣受體家族含吡咯結(jié)構(gòu)域3 (NLRP3) 炎癥小體通過產(chǎn)生ROS介導IL-1β分泌,促進細胞衰老[50]。RPE細胞中NLRP3炎癥小體在干性AMD的發(fā)病機制中起著重要作用,提示可以通過抑制促炎分子機制或改善炎癥來延緩AMD。

cGAS/干擾素基因刺激因子(STING)通路與促炎因子分泌相關(guān),其經(jīng)典功能是促進I型干擾素和免疫因子的產(chǎn)生,與自身免疫性疾病、癌癥和衰老的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[51]。激活的STING介導TBK1下游信號通路:干擾素調(diào)控因子3和NF-κB,誘導I型干擾素和其他炎性細胞因子,促進SASP[52]。有研究顯示,干性AMD患者黃斑區(qū)視網(wǎng)膜中STING-RNA上調(diào),cGAS和STING在啟動子周圍染色質(zhì)可及性增加。氧化應(yīng)激誘導的小鼠視網(wǎng)膜變性中檢測到cGAS/STING激活,并伴有感光細胞中受損DNA的胞質(zhì)滲漏。JQ1 (BRD4抑制劑) 在表觀遺傳學上抑制了STING轉(zhuǎn)錄,并促進了自噬依賴性的胞質(zhì)DNA清除,可減少受損視網(wǎng)膜中的cGAS-STING激活、炎癥和感光細胞退化[53]。因此,cGAS/STING通路是衰老相關(guān)DNA損傷的傳感器和早期AMD炎癥的觸發(fā)因素,抑制STING可能是抵抗AMD細胞衰老的潛在策略。

4 結(jié)束語

細胞衰老在干性AMD的病程發(fā)展中起著重要作用,因此,延緩細胞衰老在治療干性AMD方面具有巨大潛力。進一步深入研究細胞衰老在干性AMD發(fā)病機制中的作用至關(guān)重要,可為臨床治療AMD提供新的理論依據(jù)。