羅 丹 李 凱 高衛(wèi)萍

干眼是由于淚膜失穩(wěn)、淚液高滲、眼表炎癥損傷及神經(jīng)感覺異常等引起的眼表多因素疾病[1]。其主要癥狀包括眼干澀、異物感、視物疲勞及視力波動等,嚴重影響患者的工作及生活。目前對于干眼的發(fā)病機制尚未完全闡明,但已有越來越多的證據(jù)表明,淚液高滲及眼表炎癥是導致干眼發(fā)生的主要原因[2]。人工淚液局部滴眼作為當前治療干眼的一線療法,往往只能暫時緩解癥狀,無法有效根治干眼,且容易造成病情反復;糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物的長期使用,會造成眼壓升高、重復感染等不良反應,對眼表有一定的損害作用,不利于病情恢復[3]。研究表明,基因療法對于干眼的治療具有潛在的應用價值[4]。隨著轉(zhuǎn)錄組學技術在眼科領域的廣泛應用,人們對干眼關鍵基因的表達調(diào)控機制有了更深入的了解。本文就轉(zhuǎn)錄組學在干眼研究中的應用展開綜述,探討干眼的發(fā)病機制,以期為臨床上干眼的治療提供新思路,為干眼新藥的研發(fā)提供潛在靶點。

1 轉(zhuǎn)錄組學概述

1.1 轉(zhuǎn)錄組學定義

轉(zhuǎn)錄組學是一門在整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科[5]。轉(zhuǎn)錄組學從RNA水平研究基因的表達,它是研究細胞表型和功能的一個重要手段。Velculescu等[6]在研究酵母細胞基因表達時首次提出了轉(zhuǎn)錄組這一概念。狹義轉(zhuǎn)錄組僅指細胞在特定環(huán)境下負責編碼蛋白質(zhì)的信使RNA (mRNA);廣義轉(zhuǎn)錄組是指在特定細胞、組織或整個生物體中表達的所有類別RNA總和,包括mRNA 以及一些在基因表達和發(fā)展過程中起調(diào)控作用的非編碼RNA(ncRNA),例如轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)及微小RNA(miRNA)等[7]。轉(zhuǎn)錄組包含了特定組織細胞類型、特定發(fā)育階段及特定生理或病理條件下基因組轉(zhuǎn)錄的所有RNA的完整信息[8]。轉(zhuǎn)錄組分析為揭示觸發(fā)人類疾病的關鍵生物過程提供了有利的證據(jù),不僅有助于發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的潛在機制,更能為疾病的分子診斷和臨床治療提供新方向[9]。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學技術

轉(zhuǎn)錄組學技術經(jīng)過不斷的發(fā)展革新,目前主要包括微陣列基因芯片技術和轉(zhuǎn)錄組測序技術。前者以雜交技術為基礎,利用目標RNA與標記探針雜交進行定性、定量分析,檢測細胞基因組中基因表達水平,但因其雜交背景高噪音,無法檢測出低豐度基因,僅適用于已知序列基因片段檢測,在新基因的探索方面存在一定局限性[10]?；跍y序技術的轉(zhuǎn)錄組測序技術目前已更迭到第三代,第一代的Suger測序和第二代RNA測序(RNA-seq)技術是將待測樣本中mRNA片段反轉(zhuǎn)錄后進行測序,發(fā)展到第三代的單細胞測序技術已經(jīng)可以對RNA全長進行直接測序分析[11],轉(zhuǎn)錄組分析由此進入一個高通量、高靈敏度、高精確性和低成本的新時代。目前,轉(zhuǎn)錄組學技術在新基因發(fā)掘[12]、基因差異表達[13]、分子生物標志物篩選[14]及中醫(yī)藥作用機制研究[15]等方面均有廣泛應用。

2 轉(zhuǎn)錄組學在干眼研究中的應用

2.1 轉(zhuǎn)錄組學在干眼發(fā)病機制研究中的應用

目前人們普遍認為淚液高滲及眼表炎癥損傷是導致干眼發(fā)生的主要因素,但仍未完全闡明其發(fā)病的核心機制。轉(zhuǎn)錄組學技術對于lncRNA、circRNA和miRNA等ncRNA在干眼相關基因調(diào)控中的研究取得了突破性進展,有助于認識干眼發(fā)生、發(fā)展過程中關鍵基因的調(diào)控規(guī)律,為干眼發(fā)病的復雜分子機制研究提供新方向。

2.1.1 lncRNA

lncRNA是長度大于 200個核苷酸且無法翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA分子,起到調(diào)控基因表達的作用,lncRNA通常直接或間接參與各種生物過程和信號通路,其強大的多功能調(diào)節(jié)網(wǎng)絡可能與干眼的發(fā)生相關[16]。研究證明,lncRNA MIAT是Caspase-1依賴性細胞焦亡及凋亡的關鍵介質(zhì),對細胞活力和細胞增殖呈負調(diào)控作用,參與高滲應激誘導下干眼患者角膜上皮細胞的炎癥反應[17]。Yang等[18]利用全轉(zhuǎn)錄組測序技術分析了干眼小鼠lncRNA表達譜,發(fā)現(xiàn)了3353個差異表達的lncRNA,其中Chrnb2和Gabarap12變化最顯著;該研究結(jié)果還表明神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路是干眼發(fā)病中最重要的通路,證實此信號通路是通過分泌神經(jīng)遞質(zhì)參與干眼的炎癥損傷過程。Tang等[19]通過微陣列技術檢測并分析了干眼小鼠角膜上皮細胞中l(wèi)ncRNA及mRNA的表達情況,構建了lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡,得到差異基因的表達譜;他們推測NONMMUT047964.2可能通過調(diào)控miR-671-5p/Egr-1軸在干眼眼表炎癥損傷過程中發(fā)揮重要作用。

2.1.2 circRNA

circRNA是一類具有多種生物學功能的新型ncRNA,可招募其他類型RNA,并通過與miRNA的結(jié)合,影響特定mRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯[20]。它們能直接調(diào)節(jié)基因表達及表觀遺傳修飾,circRNA表達失調(diào)可導致眼部疾病的發(fā)生[21]。有研究采用RNA-seq技術發(fā)現(xiàn),circRNA(hsa-circRNA-001264、hsa-circRNA-104121和hsa-circRNA-045355)可能通過與下游miRNA結(jié)合,在原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)病中發(fā)揮潛在作用[22]。Liu等[23]通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學綜合技術對水通道蛋白5敲除干眼小鼠淚腺組織進行分析,發(fā)現(xiàn)了差異表達的30個circRNA和515個mRNA;在對其中的circRNA進行GO分析和KEGG分析后,又發(fā)現(xiàn)上調(diào)circRNA主要參與RNA磷酸二酯酶及核糖核酸酶活性調(diào)節(jié),下調(diào)circRNA主要參與高壓門控鈣通道活性的正調(diào)節(jié)等。這些證據(jù)表明,水通道蛋白5的缺乏可能導致circRNA的差異表達,進而調(diào)控與吞噬體相關的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡,導致干眼發(fā)生。

2.1.3 miRNA

miRNA是目前研究最廣泛的一類內(nèi)源性ncRNA,可調(diào)節(jié)多種生物基因組的表達。近年來,已有研究證實,miRNA通過與其靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)堿基互補配對阻斷mRNA翻譯,從而抑制蛋白質(zhì)的合成[24]。Pucker等[25]對人體淚液中的細胞外囊泡進行RNA測序后,明確了這些囊泡中含有與炎癥相關的差異性表達miRNA,其中9種在干眼患者淚液中表達上調(diào),這提示細胞外囊泡內(nèi)的miRNA可能是促進干眼炎癥反應分子機制中的重要環(huán)節(jié)。Kim等[26]同樣也證明了miRNA在干燥綜合征患者淚液中存在差異性表達,并闡明miRNA可能通過調(diào)節(jié)免疫細胞的發(fā)育及分化參與干燥綜合征的發(fā)病。這些發(fā)現(xiàn)有望對干眼的病理機制作出解釋。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學在干眼診斷中的應用

干眼相關差異性表達基因的轉(zhuǎn)錄組學研究,有望發(fā)現(xiàn)潛在的分子生物標志物,作為診斷干眼的重要輔助手段,為干眼的進一步研究和臨床診斷提供科學依據(jù)。

2.2.1 干眼差異性表達基因

同一生物體的細胞具有幾乎相同的基因型,但大量的證據(jù)表明細胞間存在差異表達的基因[27],轉(zhuǎn)錄組學技術可分析并篩選出與干眼相關的差異性表達基因。Kessal等[28]通過對東莨菪堿誘導干眼小鼠模型(EDE-1)及淚腺切除干眼小鼠模型(EDE-2)進行轉(zhuǎn)錄組學分析,發(fā)現(xiàn)兩組模型鼠在角膜(13個)及結(jié)膜(6個)中只有少數(shù)共同表達的基因,而EDE-1(角膜55個,結(jié)膜37個)和EDE-2(角膜51個,結(jié)膜65個)存在多個差異性表達基因。另一項研究[29]利用RNA-seq技術分析老年(2歲)和年輕(3個月)C57BL/6小鼠瞼板腺轉(zhuǎn)錄組中的差異性表達基因,發(fā)現(xiàn)77個基因在年輕小鼠中高表達,418個基因在老年小鼠中高表達。這些差異表明不同的細胞信號信息都有其特定的基因調(diào)節(jié)。

2.2.2 干眼分子生物標志物

目前在干眼臨床診斷及監(jiān)測中,患者主觀癥狀及客觀檢查是評估干眼最主要的指標,然而這些指標缺乏特異性、靈敏性及明顯的相關性,常導致診療的延誤。隨著轉(zhuǎn)錄組學技術的快速發(fā)展以及對干眼研究的不斷深入,干眼差異表達產(chǎn)物中越來越多的分子生物標志物被發(fā)現(xiàn),可作為診斷干眼的重要輔助方法,指導干眼治療。

我國的一項研究采用微陣列基因芯片技術初步分析了干眼患者淚液中miRNA的表達譜,發(fā)現(xiàn)健康人和干眼患者間存在32個差異性表達的miRNA,其中4個上調(diào),28個下調(diào),最終明確了淚液中的3個miRNA(miR-450b-5p、miR-1283和miR-3671)表達水平與干眼的嚴重程度顯著相關,其結(jié)果進一步表明,通過檢測淚液中的miRNA表達可作為診斷干眼的分子生物標志物,對干眼的無創(chuàng)性鑒別診斷具有潛在意義,并對評估角膜損傷風險具有重要價值[30]。Corrales等[31]第一個提出將膜相關黏蛋白MUC1作為干眼診斷標志物;在該研究中,中度至重度干眼患者結(jié)膜上皮中MUC1、MUC2、MUC4和MUC5AC的表達水平均較健康受試者群體顯著降低,其中,MUC1在所有測試的基因中表現(xiàn)出最大的靈敏度(83.3%)和特異度(87.5%),將MUC1作為干眼診斷標志物不僅提高了診斷的準確性,而且有助于開發(fā)治療干眼的有效藥物。

2.3 轉(zhuǎn)錄組學在干眼治療中的應用

目前臨床上主要應用人工淚液暫時緩解干眼患者的眼表不適癥狀,無法有效根治干眼,轉(zhuǎn)錄組學技術有望為干眼的臨床治療提供新思路及新靶點。Daull等[32]通過對環(huán)孢霉素A治療的干眼小鼠進行轉(zhuǎn)錄組學分析,發(fā)現(xiàn)環(huán)孢霉素A可顯著調(diào)節(jié)干眼相關基因表達譜,并可通過調(diào)節(jié)炎癥反應有效減輕干眼小鼠角膜上皮病變。有趣的是,該團隊發(fā)現(xiàn)在干眼的發(fā)生過程中,角膜、結(jié)膜和淚腺存在不同的炎癥基因表達,說明干眼對角膜、結(jié)膜和淚腺的轉(zhuǎn)錄組學特征有不同的影響。Wang等[33]采用GO和RNA-seq對人角膜上皮細胞及小鼠角膜進行分析,發(fā)現(xiàn)褪黑素對血紅素氧合酶-1具有顯著的調(diào)節(jié)作用,可以通過減少過量活性氧的產(chǎn)生維持線粒體功能,保護角膜上皮細胞免受氧化損傷,并可減輕炎癥反應。最近的一項研究表明,miR-328的過度表達可通過抑制角膜細胞增殖促進其凋亡,最終導致干眼的發(fā)生,而抗miR-328寡核苷酸可促進實驗動物角膜再上皮化,減少角膜上皮細胞及基質(zhì)細胞的凋亡,并可有效防止瞼板腺的阻塞,該團隊推測抗miR-328寡核苷酸可能是干眼的一種新的治療方法[34]。

淚腺導管類器官及生物工程替代物的發(fā)現(xiàn)有望指導干眼的治療。Bannier等[35]通過建立來源于小鼠及人類組織的淚腺導管類器官,并對其進行單細胞測序,揭示了淚腺上皮(LGE)細胞的異質(zhì)性,并表明淚腺導管類器官中的神經(jīng)遞質(zhì)暴露后會產(chǎn)生水液分泌,提示淚腺導管類器官可以用作干眼淚液誘導劑的篩選平臺。Hirayama等[36]同時對小鼠和人的淚腺組織進行微陣列分析,確定了LGE細胞的基因表達譜,發(fā)現(xiàn)其中富集的3種特異性轉(zhuǎn)錄因子(PAX6、FOXC1和SIX1)過表達可促進人胚胎干細胞分化為LGE樣細胞;這是首次從人類細胞中誘導出LGE樣細胞,這項研究提示了從人類多能干細胞再生LGE細胞的可能性。這些發(fā)現(xiàn)是未來干眼功能性生物工程器官替代治療的第一步,將為人類干眼提供一種可能的治療策略。在此之前,該團隊還證實了生物工程淚腺替代物可以恢復淚腺的生理功能,通過將生物工程淚腺體胚芽原位植入成人眼眶外的導管,可產(chǎn)生足夠量的淚液保護眼表[37]。

3 結(jié)束語

干眼的致病機制復雜,治療棘手,轉(zhuǎn)錄組學技術可對干眼差異表達基因進行篩選分析,鑒定相關特異性生物標志物,從分子層面闡明干眼的發(fā)生發(fā)展機制,為干眼的早期診斷及精準治療提供全新的思路。雖然轉(zhuǎn)錄組學在干眼研究領域的應用前景廣闊,但目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先,轉(zhuǎn)錄組學分析主要應用于干眼的基礎研究,尚未在臨床中推廣,研究仍處于起步階段,如何將其發(fā)展完善并廣泛應用于臨床實踐是目前亟待解決的難題之一。其次,單一的轉(zhuǎn)錄組學方法難以全面闡述干眼致病機制,有必要聯(lián)合代謝組學、蛋白組學等多組學進行整合分析,加深對干眼關鍵功能基因表達及調(diào)控規(guī)律的了解,實現(xiàn)干眼的精準診療。相信轉(zhuǎn)錄組學技術的廣泛應用將極大地推動干眼研究領域的進步。