萬光明 王明陽

視網(wǎng)膜下腔是位于視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)層和感光細(xì)胞層之間的潛在腔隙。視網(wǎng)膜下注射是將治療藥物輸送到視網(wǎng)膜下腔的一種給藥方式。雖然玻璃體內(nèi)注射是目前大多數(shù)眼底疾病的常用給藥方式,但受限于內(nèi)界膜和Müller 細(xì)胞的屏障效應(yīng),藥物注入玻璃體后對RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞等的作用有限,使其治療效果受到影響[1]。而視網(wǎng)膜下注射使藥物直接進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔,接觸感光細(xì)胞層和RPE層,能更直接地發(fā)揮作用[1]。視網(wǎng)膜下注射技術(shù)起始于20世紀(jì)90年代,有人將含有綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體由鞏膜途徑注射到小鼠視網(wǎng)膜下腔中,觀察到基因在RPE細(xì)胞中的有效表達(dá),初步證實(shí)視網(wǎng)膜下注射的可行性[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步與眼科手術(shù)器械的不斷更新迭代,最初使用的33G針頭現(xiàn)在已被專用的38G和41G視網(wǎng)膜下注射針頭取代,視網(wǎng)膜下注射技術(shù)趨于成熟并達(dá)到高度安全和可靠。近年來,視網(wǎng)膜下注射技術(shù)已成為重要的眼底給藥方式之一,在多種眼底疾病的藥物及手術(shù)治療中發(fā)揮著越來越顯著的作用[3-5]。

1 視網(wǎng)膜下注射的臨床應(yīng)用

1.1 基因治療

遺傳性視網(wǎng)膜疾病(IRD)是由遺傳缺陷引起的、以RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞進(jìn)行性退化為特征的一類遺傳性眼病,具有高度臨床和遺傳學(xué)異質(zhì)性,主要包括視網(wǎng)膜色素變性、Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)、 Leber先天性黑矇(LCA)、青少年黃斑營養(yǎng)不良(Stargardt病)、先天性無脈絡(luò)膜癥(CHM)等50余種類型[6]?；蛑委熓菢O具前景的一種治療方式,越來越多的IRD基因治療方法正處于基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中。以病毒載體或非病毒載體介導(dǎo)的基因替代療法是其中一種重要的治療方式,它利用病毒或非病毒載體將特定基因拷貝遞送到該基因缺陷患者的視網(wǎng)膜細(xì)胞中,從而幫助患者提高或恢復(fù)視功能[7]。通過視網(wǎng)膜下注射的方式進(jìn)行載體與目標(biāo)基因的遞送是目前首選的給藥途徑,相較于玻璃體內(nèi)注射和脈絡(luò)膜上腔注射等其他給藥方式,視網(wǎng)膜下注射遞送效率更高,加之視網(wǎng)膜下腔具有免疫豁免,更有利于降低機(jī)體對病毒的潛在免疫反應(yīng)[8-9]。2017年,美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)Luxturna?用于治療RPE65基因突變相關(guān)的視網(wǎng)膜變性疾病,以單劑量視網(wǎng)膜下注射的方式進(jìn)行基因遞送,這是第一個(gè)直接糾正缺陷基因的療法,使得基因治療在眼科領(lǐng)域迅速發(fā)展[10]。此后,多種基因突變相關(guān)IRD,如LHON、LCA、CHM、Stargardt病等也開始了視網(wǎng)膜下注射基因治療的研究與臨床試驗(yàn)[11-13]。

除IRD外,以視網(wǎng)膜下注射作為遞送方式的基因治療也逐漸應(yīng)用到與單一遺傳缺陷無關(guān)的眼底疾病中,如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。RGX-314和ADVM-022是以腺相關(guān)病毒為載體攜帶編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單抗基因片段的基因治療藥物,用以抑制新生血管形成、滲漏。在單次進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射RGX-314和ADVM-022治療新生血管性 AMD的臨床試驗(yàn)中,人們觀察到RGX-314和ADVM-022具有良好的安全性和有效性,表現(xiàn)出持久的抗VEGF效應(yīng),并顯著降低了VEGF抗體類藥物的玻璃體內(nèi)注射頻率[14-15]。目前的研究已經(jīng)表明,視網(wǎng)膜下注射已成為基因替代治療中不可或缺的一種給藥途徑。

1.2 細(xì)胞治療

視網(wǎng)膜退行性疾病是以RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞進(jìn)行性減少為主要特征的一大類眼病,主要包括AMD、IRD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑營養(yǎng)不良等,可導(dǎo)致視力進(jìn)行性下降甚至失明,臨床治療主要是對癥及緩解疾病進(jìn)展。細(xì)胞治療在視網(wǎng)膜退行性疾病的治療中具有很大的應(yīng)用前景,通過視網(wǎng)膜下細(xì)胞移植,使具有特定功能的細(xì)胞遷移到視網(wǎng)膜層并存活,刺激視網(wǎng)膜細(xì)胞再生或補(bǔ)充,替代并修復(fù)丟失或受損的視網(wǎng)膜細(xì)胞以恢復(fù)視網(wǎng)膜功能,達(dá)到治療目的[16-17]。由于視網(wǎng)膜下腔相對于玻璃體腔具有獨(dú)特的免疫赦免作用,視網(wǎng)膜下注射成為細(xì)胞治療的優(yōu)選給藥方式,是一個(gè)直接、有效和安全的移植途徑[18]。移植治療所采用的細(xì)胞通常包括自體或異體細(xì)胞、干細(xì)胞以及干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞或成熟細(xì)胞。

目前已開展了十余項(xiàng)視網(wǎng)膜下注射細(xì)胞移植療法的臨床試驗(yàn),用于治療視網(wǎng)膜退行性疾病,包括AMD和IRD等。其中,美國先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司率先啟動(dòng)了胚胎干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮(embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial,ESC-RPE)細(xì)胞視網(wǎng)膜下移植治療AMD的臨床研究。隨訪中,未發(fā)現(xiàn)移植的ESC-RPE細(xì)胞異常增殖和患者出現(xiàn)自身的免疫排斥反應(yīng),同時(shí)患者的視力均略有提高[19]。我國ESC-RPE細(xì)胞移植治療干性AMD的臨床研究也居世界前沿,目前國內(nèi)由中國科學(xué)院動(dòng)物研究所和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院聯(lián)合開展的ESC-RPE細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植治療干性AMD的相關(guān)臨床試驗(yàn)已經(jīng)取得階段性成果(注冊號(hào):ChiCTR-OCB-15007054)[20-21]。

1.3 黃斑下出血的輔助治療

黃斑下出血(SMH)是一種眼底病變,可能導(dǎo)致視力下降甚至失明。出血的原因可能全身性病變和局部病變。全身性病變?nèi)缣悄虿∫暰W(wǎng)膜病變、高血壓性視網(wǎng)膜病變、腎病性視網(wǎng)膜病變等,而局部病變則主要指的是眼底本身的病變,如視網(wǎng)膜中央或分支靜脈阻塞、視網(wǎng)膜血管炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎等[22]。SMH可繼發(fā)于多種眼部病理因素,如濕性AMD、息肉狀脈絡(luò)血管病變、眼外傷、病理性近視或視網(wǎng)膜微動(dòng)脈瘤破裂等[22]。盡早清除積血,減少血凝塊對黃斑的損害是治療SMH的關(guān)鍵。

目前視網(wǎng)膜下注射組織型纖溶酶原激活物(t-PA)已廣泛應(yīng)用于SMH的手術(shù)治療中,術(shù)中應(yīng)用視網(wǎng)膜下注射針頭于黃斑區(qū)視網(wǎng)膜下出血灶的合適部位穿刺,并在視網(wǎng)膜下腔注入t-PA,可促進(jìn)血凝塊溶解,有助于積血的排出,還可降低血栓在清除過程中對光感受器造成醫(yī)源性損傷的風(fēng)險(xiǎn)[23-24]。視網(wǎng)膜下注射的部位通常選擇在遠(yuǎn)離黃斑中心凹的出血區(qū)域視網(wǎng)膜下間隙。另外,盡管視網(wǎng)膜下注射t-PA可直接溶解血凝塊,但視網(wǎng)膜下的積血仍可對視網(wǎng)膜產(chǎn)生損傷,因此通常需要聯(lián)合玻璃體切除并借助氣體的頂壓作用,將溶解的積血驅(qū)散出黃斑區(qū)并促進(jìn)其吸收。

1.4 其他治療

由于視網(wǎng)膜下注射針頭較細(xì),對視網(wǎng)膜及病灶周圍組織損傷較小,針頭拔出后視網(wǎng)膜穿刺孔自行閉合,一般無須激光等特殊處理,因而在臨床中也可用于視網(wǎng)膜下殘留重水的取出。玻璃體切除手術(shù)后視網(wǎng)膜下殘留重水嚴(yán)重影響患眼視力,盡早取出視網(wǎng)膜下殘留重水小滴有助于視功能的恢復(fù)[25]。García-Arumí等[26]采用帶有抽吸系統(tǒng)的50G針頭進(jìn)入視網(wǎng)膜下間隙,抽吸視網(wǎng)膜下重水。萬光明等[27]通過38G針頭對3例視網(wǎng)膜下重水小滴殘留患者進(jìn)行處理,均成功取出殘留重水小滴,術(shù)后視網(wǎng)膜復(fù)位良好。應(yīng)用視網(wǎng)膜下注射針頭取出視網(wǎng)膜下重水拓展了視網(wǎng)膜下注射技術(shù)的應(yīng)用范圍。

此外,視網(wǎng)膜下注射技術(shù)正在用于多種眼底疾病的手術(shù)治療中。如通過在黃斑區(qū)不同象限中利用平衡鹽溶液(BSS)預(yù)制視網(wǎng)膜下水泡,誘導(dǎo)有限的視網(wǎng)膜脫離來治療黃斑皺褶,或解除感光細(xì)胞層和RPE層之間發(fā)生的二次粘連,甚至可使難治性和復(fù)發(fā)性黃斑裂孔閉合[3,28]。視網(wǎng)膜下注射BSS還有助于促進(jìn)頑固性黃斑水腫的吸收[29]。通過視網(wǎng)膜血管注射t-PA等藥物,可幫助視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞患者改善其視力預(yù)后[30]。

2 視網(wǎng)膜下注射的方法與技巧

視網(wǎng)膜下注射的入路途徑包括內(nèi)路和外路,內(nèi)路和外路視網(wǎng)膜下注射目前均有專用的注射針頭可以選用。外路是經(jīng)鞏膜入路通過脈絡(luò)膜到達(dá)視網(wǎng)膜下腔,這種途徑不需要進(jìn)入眼內(nèi),也不需要穿透玻璃體和視網(wǎng)膜。但目前臨床使用較多的是內(nèi)路途徑。通常來說,經(jīng)內(nèi)路注射是在鞏膜三切口的玻璃體切除手術(shù)中進(jìn)行的。術(shù)中建立常規(guī)23G/25G/27G經(jīng)睫狀體平坦部玻璃體切割三通道,切除玻璃體后進(jìn)一步確定具體的最佳注射部位,使用38G 及以上視網(wǎng)膜下微注射針頭于視網(wǎng)膜下注射載體溶液或治療藥物[31]。注意在進(jìn)入玻璃體腔之前,必須清除注射針頭及注射器內(nèi)任何氣泡并確認(rèn)針頭的通透性。注射方法可以是手動(dòng)注射或者機(jī)器輔助注射,手動(dòng)注射通常是術(shù)者固定注射器和針頭后由操作熟練的助手緩慢推動(dòng)注射器進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔給藥,機(jī)器輔助注射是通過使用玻璃體切割機(jī)的腳踏板控制注射壓力和輸注速度來進(jìn)行自動(dòng)化的視網(wǎng)膜下注射。機(jī)器輔助視網(wǎng)膜下注射具有精準(zhǔn)壓力緩慢注射等優(yōu)點(diǎn),但需應(yīng)用微量自動(dòng)注射器連接硅油管件,這些物品均需要額外的費(fèi)用。而手動(dòng)注射助手協(xié)助的方法也是安全、可行的。藥物注射完畢后應(yīng)停留針頭數(shù)秒,以盡量減少液體反流入玻璃體腔。

視網(wǎng)膜下注射前對于注射位置的合理設(shè)計(jì)以及術(shù)中輔助工具的應(yīng)用也很重要。術(shù)前通過對眼底和光學(xué)相干斷層掃描圖像分析評估,選擇最佳的注射位置,盡量避開視網(wǎng)膜萎縮、視網(wǎng)膜前膜、視網(wǎng)膜血管等區(qū)域進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔,同時(shí)最大限度地提高功能效益。距黃斑中心凹大于2 PD的顳側(cè)血管弓區(qū)域、視網(wǎng)膜病灶的升高區(qū)域是常選用的注射部位,可以最大限度地減少術(shù)中潛在的醫(yī)源性視網(wǎng)膜損傷。術(shù)中進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射時(shí),注射壓力和進(jìn)針深度的確定對保障整個(gè)注射過程的安全至關(guān)重要,所施加的注射壓力必須大于神經(jīng)視網(wǎng)膜與RPE層之間的黏附力。注射壓力不宜過高,否則可能增加機(jī)械性視網(wǎng)膜損傷。研究顯示,注射壓力在12～18 PSI(1 PSI=6.895 kPa)時(shí),視網(wǎng)膜整體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)較為穩(wěn)定[32-33]。也有學(xué)者建議剝除內(nèi)界膜,并將注射壓力從12 PSI減至6 PSI,以便更安全地進(jìn)針[34]。利用可調(diào)節(jié)壓力的微量注射器或黏性流體控制系統(tǒng)有助于保證更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定的藥物注射量[35-36]。此外,術(shù)中還可通過光學(xué)相干斷層掃描顯示進(jìn)針深度并觀察視網(wǎng)膜的拉伸情況以及預(yù)制視網(wǎng)膜下水泡的情況,輔助視網(wǎng)膜下注射的順利進(jìn)行[37]。

對于RPE萎縮程度較輕、視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與RPE層較易分離的患者,可直接進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射,這樣既可以提高注射成功率,也可盡量減少對組織的損傷。而對于干性AMD、視網(wǎng)膜色素變性及先天性無脈絡(luò)膜癥等患者,由于其RPE層與神經(jīng)視網(wǎng)膜難以分離,可通過預(yù)制BSS視網(wǎng)膜下水泡,再進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射藥物,以減輕進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔的阻力[31]。預(yù)制視網(wǎng)膜下水泡有助于觀察針頭的定位,保證注射過程中針頭始終位于視網(wǎng)膜下。此外,預(yù)制水泡提供了一個(gè)緩沖區(qū)間,可降低藥物反流至玻璃體腔中繼發(fā)炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)并可減少視網(wǎng)膜下注射期間藥物的丟失。在基因治療中,預(yù)制水泡還可通過稀釋局部病毒載體的滴度,降低病毒載體毒性所帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)[31]。需要注意的是,預(yù)制水泡的大小會(huì)影響輸送至視網(wǎng)膜下腔的藥物量,若預(yù)制水泡過大,可能無法使足量的藥物遞送入視網(wǎng)膜下腔,并會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜過度拉伸,增加黃斑裂孔形成的風(fēng)險(xiǎn)。此種情況下,術(shù)中輔助應(yīng)用重水有助于減少黃斑裂孔形成,確保注射過程中視網(wǎng)膜下水泡緩慢形成,使中心凹區(qū)域的應(yīng)力最小化[38]。對于是否需要?jiǎng)兂齼?nèi)界膜,由于視網(wǎng)膜下注射操作本身會(huì)造成局限性視網(wǎng)膜脫離,注射前也可不進(jìn)行黃斑部內(nèi)界膜的剝除,術(shù)畢注射孔也無須行激光封閉處理。

3 視網(wǎng)膜下注射的優(yōu)勢與風(fēng)險(xiǎn)

當(dāng)進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射時(shí),藥物可能在玻璃體腔中被稀釋,使外層視網(wǎng)膜的藥物劑量無法到達(dá)治療濃度,而視網(wǎng)膜下注射使藥物與感光細(xì)胞、RPE細(xì)胞直接接觸并作用,在保證達(dá)到起效藥物濃度的同時(shí)允許以小劑量進(jìn)行視網(wǎng)膜下給藥,藥物作用時(shí)間也更長[39]。與玻璃體腔相比,視網(wǎng)膜下腔是一個(gè)更安全的區(qū)域,因?yàn)樗诮馄蕦W(xué)上是封閉的,同時(shí)具有免疫赦免特權(quán),能夠?qū)⒚庖吲懦馀c炎癥風(fēng)險(xiǎn)最小化[39]。進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射的專用針頭外徑很細(xì),對視網(wǎng)膜組織損傷較小,注射時(shí)安全、可靠,注射后視網(wǎng)膜穿刺孔部位可自閉愈合。這些優(yōu)勢使視網(wǎng)膜下注射成為眼科繼玻璃體內(nèi)注射后又一重要的給藥途徑。我們在視網(wǎng)膜下注射的臨床操作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),對于一些透明玻璃體的患者,如果僅僅是為了視網(wǎng)膜下注射操作,經(jīng)評估后甚至可不進(jìn)行玻璃體切除或僅切除后極部玻璃體而直接進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射,這樣可在保證注射操作順利進(jìn)行的前提下最大程度地減少對眼內(nèi)內(nèi)環(huán)境的干擾。然而,視網(wǎng)膜下注射技術(shù)也具有一定的風(fēng)險(xiǎn)并可能引起并發(fā)癥,如持續(xù)性視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜出血,注射部位視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮,眼內(nèi)炎等;此外,進(jìn)針過深可導(dǎo)致脈絡(luò)膜上腔給藥、脈絡(luò)膜出血;進(jìn)針過淺可導(dǎo)致視網(wǎng)膜劈裂;注射量及注射壓力控制不當(dāng)可引起黃斑裂孔、視網(wǎng)膜撕裂;若注射藥物或病毒載體反流入玻璃體腔還可引發(fā)免疫反應(yīng)[40-42]。為了避免術(shù)中及術(shù)后出現(xiàn)上述并發(fā)癥,在視網(wǎng)膜下注射前應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的手術(shù)設(shè)計(jì)與規(guī)劃,術(shù)中操作做到精準(zhǔn)、穩(wěn)定,術(shù)后注意觀察患者的眼底情況,若出現(xiàn)并發(fā)癥應(yīng)給予及時(shí)處理。

4 結(jié)束語

視網(wǎng)膜下注射是一種極具潛力的給藥方式,目前對于注射方法的標(biāo)準(zhǔn)與流程也在不斷改進(jìn)與規(guī)范,這將進(jìn)一步提高治療的安全性和有效性。當(dāng)前,多項(xiàng)通過視網(wǎng)膜下注射方式進(jìn)行基因治療或干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜退行性病變的臨床試驗(yàn)正在開展,視網(wǎng)膜下注射技術(shù)的臨床應(yīng)用范圍也在不斷拓寬,今后也會(huì)使更多的患者受益。同時(shí),對于視網(wǎng)膜下注射可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)與并發(fā)癥也需提高警惕,注意完善術(shù)前準(zhǔn)備,術(shù)中規(guī)范操作,出現(xiàn)并發(fā)癥時(shí)應(yīng)及時(shí)干預(yù)與治療。