肇莉莉 王 萍 孫連義 馬為梅 張 樂 喻 磊

濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(wAMD)是一種累及視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的眼病之一,在老年人群中具有較高的發(fā)病率[1-2]。脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是wAMD的典型病變,也是導(dǎo)致患者視力喪失的主要原因[3]。目前,雖然玻璃體內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑在治療wAMD方面取得了一定療效[4],然而,抗VEGF藥物存在耐藥性問題[5],并且會引起眼壓升高[6]、眼部感染[7]等并發(fā)癥,因此,仍需要開發(fā)AMD的新型治療手段。免疫微環(huán)境失衡是導(dǎo)致wAMD的始發(fā)因素,wAMD病變部位出現(xiàn)大量巨噬細胞浸潤,這些巨噬細胞通過分泌VEGF和炎性因子促進血管內(nèi)皮細胞增殖并引起新生血管滲漏,導(dǎo)致wAMD形成[8]。巨噬細胞具有可塑性,可極化為M1和M2型,其中M2型極化可導(dǎo)致脈絡(luò)膜血管形成[9-10]。因此,調(diào)控巨噬細胞表型是治療wAMD的有效途徑。HtrA絲氨酸肽酶3(HTRA3)是2003年首次報道的一個蛋白質(zhì)編碼基因,位于染色體4p16.1上[11]。HTRA3與HTRA1類似,都能抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β家族蛋白介導(dǎo)的信號通路[12]。據(jù)報道,HTRA1基因啟動子里的一個單核苷酸多態(tài)性與AMD有關(guān)聯(lián),含有HTRA1多態(tài)性的人群發(fā)生AMD的危險度比正常人高10倍[13-14]。HTRA3在AMD小鼠視網(wǎng)膜中表達升高,提示HTRA3很可能參與AMD病變的進展[15]。另外,HTRA3可能調(diào)節(jié)免疫細胞功能[16]。本研究旨在揭示HTRA3基因?qū)NV和M2型巨噬細胞極化的影響,從而開發(fā)AMD的新型治療靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

慢病毒載體由吉瑪基因合成。RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號:22400105)購自美國Gibco公司。氯化鈷(CoCl2)(貨號:C8661)購自美國Sigma公司。Lipofectamine2000(貨號:11668027)購自美國Invitrogen公司。Matrigel(貨號:356234)購自美國BD Biosciences公司。蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(貨號:C0105S)、TRIzol(貨號:R0016)、RIPA裂解液(貨號:P0013B)、ECL試劑盒(貨號:P0018S)購自碧云天生物技術(shù)研究所。熒光素鈉(貨號:A833)購自美國Thermo Fisher公司。Prime Script RT Master Mix試劑盒(貨號:RR036A)購自日本TaKaRa公司。SYBR Green Master Mix(貨號:4367659)購自美國ABI公司。HTRA3(貨號:ab227463)、VEGFA(貨號:ab46154)、核因子κB(NF-κB)p65(貨號:ab288751)、Lamin B(貨號:ab32535)和β-actin(貨號:ab8226)一抗以及HRP標(biāo)記的IgG二抗(貨號:ab205718)購自英國Abcam公司。

1.1.2 實驗細胞和動物

恒河猴脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞系(RF/6A)購自美國ATCC。60只SPF級雄性老齡C57BL/6J小鼠(18～20個月齡,體重35～40 g)由西北大學(xué)提供[SYXK(陜)2021-004]。小鼠在25 ℃、55%相對濕度、12 h循環(huán)照明環(huán)境中使用標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料和純凈水飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本收集

2019年1月至2022年8月期間,收集西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)就診的30例wAMD患者為wAMD組,其中男16例,女14例,年齡51～78(68.81±6.09)歲,參考wAMD國際診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]對患者進行診斷。剔除伴有其他視網(wǎng)膜疾病、惡性腫瘤、心腦血管系統(tǒng)疾病、器官病變及接受治療的wAMD患者。收集同期來院體檢的健康者30例為健康組,其中男15例,女15例,年齡53～81(70.43±6.42)歲。健康組與wAMD組受試者的年齡、性別比例相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。收集兩組受試者的空腹靜脈血,qRT-PCR檢測血清HTRA3 mRNA水平。本研究通過西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)倫理委員會審批(審批號:201901170025),受試者均知情同意。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染處理

將RF/6A細胞培養(yǎng)在添加體積分數(shù)10%胎牛血清和10 g·L-1雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃和含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至對數(shù)期后用于實驗。將RF/6A細胞隨機分為對照組、NC-sh組和HTRA3-sh組,6孔板中接種RF/6A細胞并培養(yǎng)至80%融合,按照試劑盒說明,使用Lipofectamine2000將NC-shRNA和HTRA3-shRNA慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染到NC-sh組和HTRA3-sh組RF/6A細胞。對照組細胞不進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后,通過qRT-PCR和Western blot檢測HTRA3的轉(zhuǎn)染效率。每組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.3 細胞分組及處理

驗證HTRA3轉(zhuǎn)染效率后,將RF/6A細胞隨機分為N組、H組、H+NC-sh組和H+HTRA3-sh組。其中,H+NC-sh組和H+HTRA3-sh組細胞分別轉(zhuǎn)染NC-shRNA和HTRA3-shRNA;N組RF/6A細胞在完全RPMI 1640培養(yǎng)基中進行常氧培養(yǎng),其他組細胞在添加200 mmol·L-1CoCl2的RPMI 1640培養(yǎng)基中進行低氧培養(yǎng)。每組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.4 小管形成測定

使用Matrigel(每孔80 μL)包被96孔板,室溫靜置30 min,加入1.2.3分組處理后的細胞30 μL(每孔5×104個RF/6A細胞),培養(yǎng)6 h后在顯微鏡下觀察小管形成情況,Image-Pro Plus 6.0軟件計算閉合管腔數(shù)量。每組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.5 激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型

使用復(fù)方托吡酰胺滴眼液對小鼠進行散瞳,10 g·L-1苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠(10 mL·kg-1)。圍繞視盤用氬激光(激光波長350 nm,輸出功率350 mW,曝光時間0.1 s,光斑直徑75 μm)對小鼠雙眼發(fā)射四個激光點。光凝后有白色氣泡產(chǎn)生證實Bruch膜破裂,表明建模成功。

1.2.6 動物分組及處理

將小鼠隨機分為對照組、CNV組、CNV+NC-sh組和CNV+HTRA3-sh組,每組12只。對照組為未建模的小鼠,其他組為CNV建模成功的小鼠。使用鹽酸奧布卡因進行表面麻醉,然后使用30G穿刺針頭向CNV+NC-sh組和CNV+HTRA3-sh組小鼠玻璃體內(nèi)分別注射1 μL滴度為1×1011TU·mL-1的NC-shRNA和HTRA3-shRNA慢病毒載體,對照組和CNV組小鼠玻璃體內(nèi)注射PBS,均為雙眼注射。注射后給予左氧氟沙星滴眼液抗感染。

1.2.7 熒光素眼底血管造影

注射后7 d,所有小鼠均行熒光素眼底血管造影(FFA)檢查。使用復(fù)方托吡酰胺滴眼液對各組小鼠進行散瞳,10 g·L-1苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠(10 mL·kg-1)。然后經(jīng)腹腔注射0.05 mL 100 g·L-1熒光素鈉,2～3 min后拍攝眼底照片,在480 nm激發(fā)光和525 nm發(fā)射光下使用濾光片獲取圖像。使用ImageJ軟件計算CNV的平均熒光強度。

1.2.8 樣本收集

所有小鼠FFA檢查結(jié)束后處死,摘取雙眼眼球,取雙眼中任意一只眼球行40 g·L-1多聚甲醛固定,用于HE染色;另一只眼球在顯微鏡下冰上小心去除結(jié)締組織和肌肉,去除眼前節(jié),分離出脈絡(luò)膜組織,與生理鹽水混合并研磨勻漿,用于qRT-PCR和Western blot檢測。

1.2.9 眼球HE染色

40 g·L-1多聚甲醛固定眼球24 h。常規(guī)制成4 μm厚的石蠟切片,根據(jù)試劑盒說明進行HE染色。

1.2.10 qRT-PCR檢測

通過qRT-PCR檢測wAMD患者和健康體檢者的血清中HTRA3 mRNA水平,并檢測RF/6A細胞或各組小鼠脈絡(luò)膜組織中HTRA3、類幾丁質(zhì)酶3樣蛋白3(Ym-1)、精氨酸酶1(Arg-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)和VEGFA mRNA水平。TRIzol試劑提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后在ABI Prism 7900HT型熒光定量PCR儀上使用SYBR Green Master Mix進行擴增。擴增程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,循環(huán)40次。引物序列見表1。GAPDH為內(nèi)參基因。通過2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 引物序列

1.2.11 Western blot檢測

通過RIPA裂解液提取RF/6A細胞或小鼠脈絡(luò)膜組織總蛋白,然后在100 g·L-1SDS-PAGE上分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉30 min。然后與1：5 000稀釋的HTRA3、VEGFA、NF-κB p65、Lamin B和β-actin一抗在4 ℃下孵育過夜。然后將膜與1：5 000稀釋的HRP標(biāo)記的IgG二抗在室溫下孵育2 h。ECL顯影,ImageJ軟件測定條帶灰度值。Lamin B作為核蛋白內(nèi)參,β-actin 作為總蛋白內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件行統(tǒng)計分析,定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異比較采用t檢驗或單向方差分析。檢驗水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 wAMD患者和健康體檢者的血清HTRA3 mRNA水平

與健康組(1.00±0.33)比較,wAMD組患者的血清中HTRA3 mRNA水平(2.41±0.57)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.804,P<0.001)。

2.2 下調(diào)HTRA3抑制缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細胞小管形成

RF/6A細胞轉(zhuǎn)染后,與對照組和NC-sh組比較,HTRA3-sh組RF/6A細胞的HTRA3 mRNA和蛋白表達水平均降低(均為P<0.05)(表2和圖1)。缺氧處理后,與N組比較,H組RF/6A細胞的閉合管腔數(shù)量、HTRA3和VEGFA的mRNA和蛋白表達水平均增加(均為P<0.05);與H+NC-sh組比較,H+HTRA3-sh組RF/6A細胞的閉合管腔數(shù)量、HTRA3和VEGFA的mRNA和蛋白表達水平均減少(均為P<0.05);H組與H+NC-sh組RF/6A細胞的閉合管腔數(shù)量、HTRA3和VEGFA的mRNA和蛋白表達水平相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(表3、圖2、表4和圖3)。

圖1 Western blot檢測各組RF/6A細胞HTRA3蛋白表達

圖2 Western blot檢測各組RF/6A細胞HTRA3蛋白表達

A:各組RF/6A細胞的小管形成圖;B:各組RF/6A細胞的VEGFA蛋白條帶。圖3 下調(diào)HTRA3對缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細胞小管形成和VEGFA蛋白表達的影響

表2 各組RF/6A細胞的HTRA3 mRNA和蛋白相對表達量

表3 各組RF/6A細胞HTRA3 mRNA和蛋白相對表達量

表4 各組RF/6A細胞的閉合管腔數(shù)量、VEGFA mRNA和蛋白相對表達量

2.3 下調(diào)HTRA3抑制CNV小鼠脈絡(luò)膜血管生成

與對照組比較,CNV組小鼠的HTRA3 mRNA和蛋白表達水平均增加(均為P<0.05);與CNV+NC-sh組比較,CNV+HTRA3-sh組小鼠的HTRA3 mRNA和蛋白表達水平均減少(均為P<0.05);CNV組與CNV+NC-sh組小鼠的HTRA3 mRNA和蛋白表達水平相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(表5和圖4)。對照組小鼠脈絡(luò)膜形態(tài)正常;CNV組和CNV+NC-sh組小鼠脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)紊亂,脈絡(luò)膜增生,Bruch膜破裂,血管生成增加;CNV+HTRA3-sh組小鼠脈絡(luò)膜病變減輕,脈絡(luò)膜增生和血管生成減少(圖5)。與對照組比較,CNV組小鼠的CNV相對熒光強度升高(P<0.05);與CNV+NC-sh組比較,CNV+HTRA3-sh組小鼠的CNV相對熒光強度降低(P<0.05);CNV組與CNV+NC-sh組小鼠的CNV相對熒光強度相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表5和圖5)。

圖4 Western blot檢測各組小鼠脈絡(luò)膜組織中HTRA3蛋白表達

表5 各組小鼠脈絡(luò)膜組織中的HTRA3 mRNA和蛋白相對表達量以及CNV相對熒光強度

2.4 下調(diào)HTRA3對CNV小鼠脈絡(luò)膜組織中巨噬細胞極化的影響

與對照組比較,CNV組小鼠脈絡(luò)膜組織中M2型巨噬細胞標(biāo)志物Ym-1和Arg-1 mRNA水平升高,M1型巨噬細胞標(biāo)志物iNOS和COX-2 mRNA水平降低(均為P<0.05);與CNV+NC-sh組比較,CNV+HTRA3-sh組小鼠脈絡(luò)膜組織中Ym-1和Arg-1 mRNA水平降低,iNOS和COX-2 mRNA水平升高(均為P<0.05);CNV組與CNV+NC-sh組小鼠脈絡(luò)膜組織中Ym-1、Arg-1、iNOS和COX-2 mRNA水平相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(表6)。

表6 各組小鼠脈絡(luò)膜組織中Ym-1、Arg-1、iNOS和COX-2的mRNA相對表達量

2.5 下調(diào)HTRA3對CNV小鼠脈絡(luò)膜組織NF-κB信號通路的影響

對照組、CNV組、CNV+NC-sh組和CNV+HTRA3-sh組小鼠脈絡(luò)膜組織中的細胞核NF-κB p65蛋白相對表達量依次為1.00±0.05、3.41±0.27、3.39±0.35、1.87±0.11(F=315.393,P<0.001)。與對照組比較,CNV組小鼠的脈絡(luò)膜組織中細胞核NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05);與CNV+NC-sh組比較,CNV+HTRA3-sh組小鼠的脈絡(luò)膜組織中細胞核NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05);CNV組與CNV+NC-sh組小鼠脈絡(luò)膜組織中細胞核NF-κB p65蛋白表達水平相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 Western blot檢測各組小鼠脈絡(luò)膜組織中的細胞核NF-κB p65蛋白表達

3 討論

CNV是wAMD患者視力喪失的主要原因,雖然抗VEGF治療可以抑制CNV形成,但也可能引起多種并發(fā)癥[6-7],因此,仍需要開發(fā)新型wAMD治療手段和治療靶點。HtrA家族是一種熱休克誘導(dǎo)的蛋白酶家族,在進化過程中非常保守,該家族成員不僅參與調(diào)節(jié)細胞存活、線粒體穩(wěn)態(tài)、胎盤發(fā)育等多種生理功能,而且參與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、關(guān)節(jié)炎等多種病理過程的發(fā)生和發(fā)展[18]。目前,HtrA家族成員中HTRA1的研究較多。據(jù)報道,HTRA1多態(tài)性與AMD的發(fā)生相關(guān)[13-14]。CNV患者房水中的HTRA1水平高于白內(nèi)障患者,并且經(jīng)雷珠單抗玻璃體內(nèi)注射治療后HTRA1水平降低[19]。HTRA-1調(diào)節(jié)血管生成功能,HTRA-1的升高與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)[20]。然而,HTRA3在wAMD中的研究較少。本研究觀察到wAMD患者的血清HTRA3 mRNA水平較健康人明顯升高,提示HTRA3可能參與了AMD的發(fā)病過程。由于HTRA3與HTRA1具有高度同源性和結(jié)構(gòu)相似性,這兩種酶在人體組織中的表達模式相似,提示它們可能具有相似的生物學(xué)活性和互補的生理功能[12]。據(jù)報道,HTRA3在AMD小鼠視網(wǎng)膜中表達升高[15]。

視網(wǎng)膜缺氧是wAMD的主要病因之一[21],缺氧可誘導(dǎo)CNV形成[22-23]。本研究通過轉(zhuǎn)染HTRA3-shRNA慢病毒下調(diào)了RF/6A細胞中的HTRA3,然后對RF/6A細胞進行缺氧處理,結(jié)果表明,下調(diào)HTRA3抑制了缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細胞小管形成,并下調(diào)了VEGFA的表達。另外,激光誘導(dǎo)CNV是一種模擬了人類wAMD的動物建模方法[24]。本研究建立了激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型,然后對小鼠玻璃體內(nèi)注射HTRA3-shRNA慢病毒,結(jié)果表明,下調(diào)HTRA3減輕了CNV小鼠脈絡(luò)膜病變,抑制了血管生成和CNV生成。Nie等[25]報道,HTRA3是一種含有胰島素樣生長因子(IGF)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新型絲氨酸蛋白酶,在小鼠胎盤形成過程中在母胎界面選擇性表達,HTRA3在介導(dǎo)血管和胎盤形成中起著關(guān)鍵作用。本研究證實,HTRA3水平影響RF/6A細胞小管形成及血管生成因子VEGFA的表達水平。據(jù)報道,HTRA3是一種調(diào)節(jié)腦內(nèi)皮細胞特異性應(yīng)答的基因,與前腦血管發(fā)育有關(guān)[26]。敲除HTRA3抑制了滋養(yǎng)層細胞的侵襲和血管生成[27]。這些結(jié)果說明HTRA3可促進血管生成和CNV形成。

wAMD發(fā)病過程中免疫微環(huán)境失衡,大量巨噬細胞浸潤是免疫微環(huán)境失衡的重要因素,因為巨噬細胞可促進血管內(nèi)皮細胞增殖并引起新生血管滲漏[8]。wAMD發(fā)病過程中巨噬細胞主要通過M2型極化誘導(dǎo)CNV形成[9-10]。巨噬細胞發(fā)生M2型極化后可分泌包括VEGF在內(nèi)的多種促血管生成因子。本研究結(jié)果表明,下調(diào)HTRA3降低了CNV小鼠脈絡(luò)膜組織中M2型巨噬細胞標(biāo)志物(Ym-1和Arg-1)的表達,上調(diào)了M1型巨噬細胞標(biāo)志物(iNOS和COX-2)的表達,抑制了M2型巨噬細胞極化。有學(xué)者研究表明,HTRA家族的基因突變影響巨噬細胞的存活率[28]。另外,HTRA3與胃癌的免疫細胞浸潤程度相關(guān)[16]。HTRA3的高表達與獲得性免疫細胞(Th17細胞、T輔助細胞、T中央記憶細胞等)呈負相關(guān),與天然免疫細胞(NK細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、未成熟樹突狀細胞等)呈正相關(guān)[16]。因此我們推測,HTRA3可能通過促進M2型巨噬細胞極化參與了wAMD發(fā)病過程。

NF-κB信號通路參與激活wAMD患者脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜中的炎癥反應(yīng)[29],NF-κB信號通路的激活與CNV形成有關(guān)[30],NF-κB信號通路的激活在包括wAMD在內(nèi)的多種疾病中起到促進血管生成作用[31-32]。因此,抑制NF-κB信號通路是治療wAMD的有效策略[33]。其他學(xué)者報道,HTRA3高表達可能激活NF-κB通路[16]。本研究結(jié)果表明,下調(diào)HTRA3抑制CNV小鼠脈絡(luò)膜組織NF-κB的核轉(zhuǎn)位。據(jù)報道,NF-κB p65可直接與HTRA1啟動子(氨基酸347)結(jié)合,阻斷HTRA1可顯著抑制NF-κB信號通路[34]?？紤]到HTRA3與HTRA1具有高度同源性和結(jié)構(gòu)相似性,并且表達模式相似[12],我們推測,HTRA3可能與NF-κB p65具有結(jié)合位點,下調(diào)HTRA3對CNV形成的抑制作用也可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

4 結(jié)論

HTRA3可促進血管生成和CNV形成,可能通過促進M2型巨噬細胞極化參與了wAMD的發(fā)病過程,通過下調(diào)HTRA3可抑制CNV形成和M2型巨噬細胞極化,該作用可能與NF-κB信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果提示,HTRA3可能是防治wAMD的重要潛在靶點。