白文帆 郭 玉 伏等弟 羅明秀 蘆曉紅 姚 青

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥,也是導致成人視力喪失的主要原因[1],探索DR的發(fā)病機制,尋找其預防及治療方法具有重要的臨床意義。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT是一類可調(diào)控葡萄糖進入細胞內(nèi)的跨膜蛋白。目前已鑒定出GLUT家族包含14種蛋白,GLUT1是主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體,參與葡萄糖代謝[2-3];GLUT4能夠在胰島素的刺激下,通過易位作用轉(zhuǎn)運到細胞膜上調(diào)控葡萄糖進入細胞[4]。此外,Sirtuins作為一類具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙酰酶活性的蛋白,已被證明與心血管疾病、糖尿病、癌癥等有密切關系[5]。本研究探討GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達,旨在進一步研究DR的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、HE染色試劑盒 (北京索萊寶科技有限公司),BCA蛋白定量檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、ECL化學發(fā)光液(江蘇凱基生物技術股份有限公司),DAB顯色試劑盒 (上海生工生物工程股份有限公司),SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、預染蛋白Maker (上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司),SIRT1、SIRT6抗體 (美國Cell Signaling公司),β-actin、SIRT2、SIRT3和SIRT7抗體 (美國Affinityg公司),SIRT4、STRT5和GLUT1/4抗體 (武漢三鷹生物技術有限公司)。全數(shù)字彩色多普勒超聲診斷儀 (上海中躍醫(yī)療儀器公司),臺式高速冷凍型微量離心機 (北京大龍興創(chuàng)實驗儀器公司),熒光定量PCR儀 (美國Bio-Rad公司),化學發(fā)光成像儀 (美國Thermo Scientific公司),黏附載玻片、YD-14P1.5智能環(huán)保型雙吊籃生物組織脫水機、YD-6LA生物組織冷凍包埋機、RWDS700輪轉(zhuǎn)式切片機、YD-700全自動生物組織染色機 (深圳市瑞沃德生命科技有限公司),ML31生物顯微鏡(廣州市明美科技有限公司),Science數(shù)字切片掃描系統(tǒng) (山東志盈醫(yī)學科技有限公司)。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

取8周齡健康雄性SD大鼠20只,體重200～220 g(購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心)。大鼠禁食12 h后,抽取尾靜脈血測定空腹血糖,將20只血糖正常的大鼠隨機分為正常對照組和糖尿病組,糖尿病組大鼠按照60 mg·kg-1的劑量采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型,正常對照組大鼠注射等量的溶劑。3 d 后尾靜脈采血檢測血糖,空腹血糖≥ 16.7 mmol·L-1為糖尿病造模成功,每隔2周檢測大鼠體重和血糖。本實驗通過寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物倫理委員會審查并獲批準(倫理批準號:IACUC-NYLAC-2021-115)。

1.3 彩色多普勒超聲檢測大鼠視網(wǎng)膜中央動脈的血流參數(shù)

造模后12周,使用異氟烷吸入麻醉劑麻醉大鼠,固定大鼠四肢并且對大鼠眼部周圍進行脫毛,將超聲耦合劑均勻涂抹在眼部,探頭放至耦合劑表面進行探查,檢測大鼠視網(wǎng)膜中央動脈(CRA)的收縮期峰值流速(PSV)和舒張末期流速(EDV),并計算阻力指數(shù)(RI)、搏動指數(shù)(PI)。

1.4 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織病理學變化

造模后12周,用10 g·L-1戊巴比妥鈉注射液 (5 mL·kg-1) 右下腹腔注射麻醉大鼠,腹主靜脈采血后,取出眼球并放入裝有眼球固定液的離心管中進行固定,脫水,石蠟包埋,切片,蘇木素染色5 min,清洗,伊紅染色20 min,脫水,封片,在光學顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織的病理學形態(tài)。

1.5 免疫組織化學染色觀察大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1/4的表達情況

將石蠟切片放入60 ℃烤片機中烤20 min,脫蠟水化,置于修復液中煮沸后冷卻至室溫,用PBS清洗,H2O2阻斷15 min,封閉20 min后孵育一抗 (GLUT1 1：5 000,GLUT4 1：300),4 ℃過夜,PBS清洗3次,37 ℃避光孵育辣根過氧化物酶標記的二抗 (1：5 000) 1 h,再用PBS清洗后,加入DAB顯色,滴加蘇木素,脫水,封片,在光學顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1/4的表達情況。

1.6 Western blot檢測大鼠視網(wǎng)膜GLUT1/4和Sirtuins蛋白的表達情況

將眼球沿著角鞏膜緣剪開,取出視網(wǎng)膜后置于裂解液中,用研缽充分粉碎組織。離心,取上清。通過BCA試劑盒檢測樣本蛋白濃度,將蛋白通過 SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,用100 g·L-1的脫脂牛奶封閉2 h后孵育一抗 (β-actin 1：5 000,SIRT1-7 1：1 000,GLUT1 1：4 000,GLUT4 1：2 000)。放搖床中4 ℃孵育過夜。次日,用TBST洗膜后孵育二抗 (1：5 000),配置ECL發(fā)光液,在凝膠成像系統(tǒng)曝光,檢測灰度值,計算GLUT1/4和Sirtuins蛋白相對表達量。

1.7 qRT-PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜中Sirtuins mRNA的表達水平

采用Trizol一步法提取視網(wǎng)膜總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后從GenBank獲得目的基因mRNA的全長序列,利用Primer 5.0設計引物序列,Sirtuins及β-actin的引物序列見表1。采用qRT-PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜中Sirtuins mRNA的表達水平。

表1 Sirtuins及β-actin的引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析,使用Graphpad Pism 9.5制圖。計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用獨立樣本t檢驗進行分析。檢驗水準:α=0.05。

2 結果

2.1 兩組大鼠體重和血糖的變化

與正常對照組相比,糖尿病組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕等癥狀。造模8周后糖尿病組大鼠體重顯著低于正常對照組(均為P<0.05);鏈脲佐菌素注射2周后,糖尿病組大鼠血糖顯著高于正常對照組 (均為P<0.05) (圖1)。

與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001。圖1 兩組大鼠造模后不同時間體重和血糖的變化

2.2 兩組大鼠CRA的血流參數(shù)

造模后12周,與正常對照組相比,糖尿病組大鼠CRA的PSV和EDV均顯著降低 (均為P<0.001);RI與PI無明顯改變(均為P>0.05) (表2)。

表2 造模后12周兩組大鼠CRA血流參數(shù)

2.3 兩組大鼠視網(wǎng)膜HE染色結果

HE染色結果顯示,正常對照組大鼠視網(wǎng)膜組織各層結構清晰,細胞排列緊密、規(guī)則,未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變;糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織厚度變薄,各層界限模糊,結構紊亂,細胞數(shù)量減少 (圖2)。

GCL:神經(jīng)節(jié)細胞層;IPL:內(nèi)叢狀層;INL:內(nèi)核層;OPL:外叢狀層;ONL:外核層;RCL:光感受器層;PEL:色素上皮層。圖2 造模后12周兩組大鼠視網(wǎng)膜HE染色結果(×400)

2.4 兩組大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1/4的表達情況

免疫組織化學染色結果顯示,在大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1主要位于視網(wǎng)膜色素上皮層,GLUT4位于神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層及光感受器層;與正常對照組相比,糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1及GLUT4的表達減少(圖3A);Western blot檢測結果也表明,糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1 及GLUT4蛋白相對表達量均低于正常對照組(均為P<0.05) (圖3B,表3)。

A:免疫組織化學染色結果(×400);黑色箭頭示色素上皮層,紅色箭頭示神經(jīng)節(jié)細胞層,黃色箭頭示內(nèi)叢狀層,綠色箭頭示光感受器層。B:Western blot檢測結果。圖3 兩組大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1/4的表達情況

表3 兩組大鼠視網(wǎng)膜中GLUT1 及GLUT4蛋白相對表達量

2.5 兩組大鼠視網(wǎng)膜中Sirtuins 蛋白表達情況

Western blot檢測結果顯示,糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中SIRT1-SIRT7蛋白相對表達量均低于正常對照組(均為P<0.05)(表4)。

表4 兩組大鼠視網(wǎng)膜中Sirtuins蛋白相對表達量

2.6 兩組大鼠視網(wǎng)膜中Sirtuins mRNA的表達情況

qRT-PCR檢測結果顯示,與正常對照組相比,糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中的SIRT1-SIRT7 mRNA相對表達量均下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)(表5)。

表5 兩組大鼠視網(wǎng)膜中Sirtuins mRNA相對表達量

3 討論

目前,我國糖尿病的發(fā)病率為13%,DR作為糖尿病患者最常見的眼部并發(fā)癥,其發(fā)病率約占糖尿病患者總數(shù)的40%,是導致成人視力喪失的主要原因,預計到2030年全球DR患者數(shù)可能達到1.91億[6-8]。DR的發(fā)病機制復雜,現(xiàn)有的臨床治療手段無法有效控制病情。因此,探索DR的發(fā)病機制,尋找預防及治療DR安全且有效的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

DR的主要病理改變包括視網(wǎng)膜缺血、血管滲透性增加和神經(jīng)元異常等。本研究顯示,糖尿病組大鼠CRA的PSV和EDV均下降,說明視網(wǎng)膜血流速度下降,供血減少。病理組織學結果顯示,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織各層變薄、結構紊亂、細胞大量丟失,表明糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能和結構發(fā)生紊亂。GLUT是一類跨膜蛋白,可轉(zhuǎn)運葡萄糖進入細胞內(nèi),根據(jù)其序列相似性和底物親和力可將GLUT分為三類:I類GLUTs (1-4、14) 可促進葡萄糖的攝取,II 類 GLUT(5、7、9、11)是果糖轉(zhuǎn)運蛋白,III 類 GLUT (6、8、10、12、13)是結構上非典型成員[9]。GLUT1是一類廣泛分布于各個組織器官的葡萄糖轉(zhuǎn)運體,是葡萄糖通過血-視網(wǎng)膜屏障的載體,主要定位于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞和色素上皮細胞層,是維持視網(wǎng)膜葡萄糖供給平衡的重要因素,在高糖環(huán)境中視網(wǎng)膜細胞GLUT1出現(xiàn)異常,將會導致視網(wǎng)膜的糖代謝紊亂[10]。GLUT4是骨骼肌和脂肪組織中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體,在胰島素刺激下,GLUT4通過將葡萄糖由細胞外轉(zhuǎn)位至細胞中,而發(fā)揮降血糖的作用。有研究表明,上調(diào)GLUT4可改善高糖合并缺血缺氧心肌細胞的糖代謝異常狀態(tài)[11]。本研究結果顯示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織GLUT1和GLUT4蛋白表達水平下降。

Sirtuins是一類具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙酰酶活性的蛋白質(zhì),主要與DNA修復、細胞周期、代謝和衰老的調(diào)節(jié)有關,該家族由7種亞型組成,其中SIRT1和SIRT2位于細胞核及細胞質(zhì)中。研究表明,白內(nèi)障、青光眼和DR等眼部病變都與SIRT1的表達有關,SIRT1可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、炎癥和氧化應激改善DR[12];SIRT2可通過調(diào)節(jié)胰島素的作用來改善細胞狀態(tài),下調(diào)SIRT2會加重胰島素抵抗[13];SIRT3、SIRT4和SIRT5主要位于線粒體基質(zhì)中,SIRT3可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子表達及促進細胞自噬從而預防DR[14];SIRT4是維持胰島素分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關鍵參與者[15];SIRT5可通過對視神經(jīng)磷酸酶去琥珀酰化保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免受DR引起的損傷[16];SIRT6定位于細胞核,可抑制血管內(nèi)皮生長因子表達,改善DR小鼠的炎癥反應、氧化應激且能緩解視網(wǎng)膜細胞凋亡[17-18];SIRT7主要位于核仁中,可通過p53去乙?；种萍毎蛲龊途徑鈓iR-335-5p誘導的內(nèi)皮細胞功能障礙[19-20]。本研究結果顯示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT1-SIRT7蛋白及mRNA均呈低表達狀態(tài),提示Sirtuins在DR中可能發(fā)揮正向調(diào)控的作用。

4 結論

糖尿病可引起大鼠視網(wǎng)膜組織中GLUT1/4和Sirtuins的表達發(fā)生改變,GLUT1/4和Sirtuins可能參與了DR的發(fā)生與發(fā)展。