孫平 高可欣 包鴻蓉 孫成 張靜 王大治

【摘要】 目的：檢測(cè)乳腺癌患者血清和癌組織內(nèi)富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-richalpha-2glycoprotein1，LRG1）的表達(dá)并分析其臨床意義。方法：選取2021年6月—2022年3月就診于牡丹江市腫瘤醫(yī)院的86例女性乳腺癌患者，86例乳腺小葉增生或纖維瘤患者作為良性病變組，21例健康志愿者作為對(duì)照組。比較三組血清LRG1的表達(dá)差異，分析其與患者年齡、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床因素的關(guān)系。免疫組化染色檢測(cè)癌組織和癌旁組織內(nèi)LRG1表達(dá)的平均灰度值。結(jié)果：乳腺癌組和良性病變組血清內(nèi)LRG1的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，乳腺癌組LRG1表達(dá)明顯高于良性病變組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡組乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)低于Ⅲ+IV期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清內(nèi)LRG1表達(dá)明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。乳腺癌組織內(nèi)LRG1平均灰度值明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：LRG1在乳腺癌患者血清和癌組織內(nèi)明顯升高，并與臨床因素緊密相關(guān)，可作為乳腺癌診斷的潛在生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 富亮氨酸α2糖蛋白1 乳腺癌 臨床分期 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

Application of Serum LRG1 Expression Level in Diagnosis of Breast Cancer/SUN Ping， GAO Kexin， BAO Hongrong， SUN Cheng， ZHANG Jing， WANG Dazhi. //Medical Innovation of China， 2024， 21（12）： 0-043

[Abstract] Objective： To detect leucine-richalpha-2-glycoprotein 1 （LRG1） of breast cancer patients in serum and in cancer tissues， respectively， and to analyze their clinical significance. Method： A total of 86 female patients with breast cancer treated in Mudanjiang Tumor Hospital from June 2021 to March 2022 were selected， 86 patients with lobular hyperplasia or fibroma of the breast were selected as the benign group， and 21 healthy volunteers were selected as the control group. Difference of serum LRG1 expression among the three groups were compared， and then their relationship with clinical factors such as patients' age， clinical stage and lymph node metastasis were analyzed. Mean gray value of LRG1 expression was detected by immunohistochemical staining in breast cancer tissues and the adjacent tissues， respectively. Result： Level of serum LRG1 in breast cancer group and benign group was much higher than that in control group， and LRG1 expression in breast cancer group was significantly higher than that in benign group， the differences were significant difference （P<0.05）. There was significant difference in serum LRG1 expression in patients with different age （P<0.05）. Serum LRG1 expression in patients with stage Ⅰ+Ⅱ was significantly lower than that of patients with stage Ⅲ+Ⅳ， the difference was statistically significant （P<0.05）. Serum LRG1 expression in lymph node metastasis group statistically was higher than that of no lymph node metastasis group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Mean gray value in breast cancer tissues was significantly lower than that in the adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Serum LRG1 is significantly elevated in serum and cancer tissues of breast cancer patients， and closely related to clinical factors， which can be used as a potential biomarker for diagnosis of breast cancer.

[Key words] Leucine-richalpha-2-glycoprotein 1 Breast cancer Clinical stages Lymph node metastasis

First-author's address： Department of Anatomy， Basic Medicine School of Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.12.010

乳腺癌是全球女性罹患的各種癌癥中發(fā)病率最高，導(dǎo)致女性死亡的第二大癌癥[1-2]。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)（American cancer society，ACS）最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，2022年美國(guó)新發(fā)乳腺癌病例34萬(wàn)，有4萬(wàn)女性死于乳腺癌，其中浸潤(rùn)性乳腺癌占80%以上[3]。在我國(guó)，乳腺癌每年新發(fā)病例也呈逐年上升趨勢(shì)，據(jù)國(guó)家癌癥中心報(bào)告，2020年中國(guó)新發(fā)乳腺癌患者33萬(wàn)，預(yù)計(jì)2025年將持續(xù)增加到36萬(wàn)。乳腺癌不同于肝癌、肺癌等其他癌癥，乳腺位于體表臟器較淺位置，形成腫塊易被患者早期察覺(jué)。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可將早期乳腺癌患者的生存率提高到90%以上[4]。目前臨床乳腺癌的確診主要依靠穿刺活檢或腫瘤切除后病理檢查，費(fèi)用高、創(chuàng)傷大，患者不易接受。此外，臨床確診的乳腺癌患者中，仍有接近30%的乳腺癌患者死于遠(yuǎn)處器官腦、肺、骨的多發(fā)轉(zhuǎn)移[5-6]。因此，尋找新的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物，探索乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，既有助于乳腺癌的早期篩查，也利于制訂新的治療方案預(yù)防乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。

富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）家族的創(chuàng)始成員，早期作為炎癥反應(yīng)產(chǎn)物從人類血清中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞早期分化標(biāo)志物，與多種炎癥性疾病活動(dòng)度密切相關(guān)[7-8]。作為急性期反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體受到微生物感染或炎癥因子刺激時(shí)，血清中LRG1水平急劇增加，在獲得性免疫激活之前負(fù)責(zé)原始免疫反應(yīng)，與疾病的嚴(yán)重程度直接相關(guān)[9-11]。目前，臨床乳腺癌常用癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作為早期篩查的標(biāo)志物，但由于特異性較差，還需尋找新的分子標(biāo)志物。有關(guān)LRG1作為乳腺癌早期診斷標(biāo)志物的相關(guān)研究報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究。本研究采用ELISA分別檢測(cè)乳腺癌、乳腺良性病變和健康人群血液內(nèi)LRG1蛋白的表達(dá)，并分析其與患者年齡、臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移等臨床因素的相關(guān)性；同時(shí)采用免疫組化染色法檢測(cè)乳腺癌組織和癌旁組織內(nèi)LRG1的表達(dá)，分析LRG1在乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá)，并探討血清LRG1表達(dá)在乳腺癌患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年6月—2022年3月就診于牡丹江市腫瘤醫(yī)院的86例女性乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合乳腺癌的臨床診斷指標(biāo)；（2）就診時(shí)未接受放療、化療、內(nèi)分泌的治療；（3）乳腺癌初診；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他腫瘤疾病；（2）乳腺癌復(fù)發(fā)或乳腺癌術(shù)后；（3）合并有心、肝、腎、腦系統(tǒng)疾?。唬?）妊娠期或哺乳期；（5）臨床資料不全?；颊咝g(shù)后切除癌組織和癌旁組織放入10%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組化染色。術(shù)前采集腫瘤患者外周血。86例乳腺小葉增生或纖維瘤患者作為良性病變組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)B超或X線確診的乳腺小葉增生或纖維瘤；（2）年齡>18歲；（3）未接受藥物治療；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝、腎功能異常；（2）對(duì)研究依從性不佳；（3）合并其他乳腺疾病。21例健康志愿者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)

B超或X線確診乳腺形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常；（2）年齡>18歲；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝、腎功能異常；（2）對(duì)研究依從性不佳；（3）長(zhǎng)期應(yīng)用激素藥物?；颊吆图覍倬炇鹬橥鈺?shū)。本研究經(jīng)牡丹江市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 方法

（1）所有受試對(duì)象均于清晨空腹采血5 mL，

2 000 r/min離心10 min后，靜置30 min后收集上層血清，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)各組血清內(nèi)LRG1的表達(dá)。ELISA試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，于450 nm處檢測(cè)各組樣品的吸光度（OD）值，操作步驟按說(shuō)明書(shū)規(guī)范進(jìn)行。（2）所有腫瘤患者組織標(biāo)本采用免疫組化染色，經(jīng)固定、包埋后制成3 μm厚的石蠟組織連續(xù)切片，覆于防脫載玻片上；經(jīng)脫蠟、脫水，枸櫞酸高壓緩沖液修復(fù)10 min后室溫冷卻，PBS沖洗3次；3%H2O2抗原修復(fù)10 min，PBS沖洗3次；滴加一抗為小鼠抗人LRG1單克隆抗體（1︰100） 于4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次；滴加二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB染色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用ELISA法檢測(cè)乳腺癌組、乳腺良性病變組及對(duì)照組患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)，比較各組LRG1表達(dá)的差異。采用免疫組化DAB染色，檢測(cè)86例乳腺癌患者組織切片內(nèi)LRG1的表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性。利用Image J圖像軟件測(cè)量細(xì)胞內(nèi)LRG1表達(dá)的平均灰度值，平均灰度值=背景灰度值-實(shí)測(cè)灰度值，染色越深，平均灰度值越小。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（x±s），比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組基線資料比較

乳腺癌組年齡32～75歲，平均（44.32±6.16）歲；良性病變組年齡28～69歲，平均（43.18±5.21）歲；對(duì)照組年齡為33～73歲，平均（43.27±5.09）歲。三組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組血清內(nèi)LRG1的表達(dá)

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組血清LRG1為（38.03±1.22）ng/mL，乳腺癌組和良性病變組血清LRG1分別為（129.58±3.45）ng/mL和（73.93±7.52）ng/mL。與對(duì)照組相比，乳腺癌組和良性病變組血清LRG1的表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。乳腺癌組和良性病變組相比，血清LRG1的表達(dá)水平也明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1表達(dá)的臨床意義

不同年齡組乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲ+Ⅳ期38例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)低于Ⅲ+Ⅳ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 乳腺癌組織和癌旁組織內(nèi)LRG1的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，LRG1在乳腺癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，而癌旁組織內(nèi)LRG1的表達(dá)不明顯。乳腺癌組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LRG1的平均灰度值為（31.02±6.81），明顯低于癌旁組的（89.54±9.83），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-45.381，P<0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討論

乳腺癌早期篩查和正確診斷對(duì)指導(dǎo)患者制訂治療方案，提高患者的生存率，改善患者預(yù)后具有重要意義。近年來(lái)，血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)在乳腺癌的診斷和分期中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。血清腫瘤標(biāo)志物由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到血液循環(huán)中，以糖類、激素、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物形式存在的一類物質(zhì)，可在某種程度上反映腫瘤的生長(zhǎng)情況。由于其具有快速、無(wú)創(chuàng)、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，常用于腫瘤的早期篩查和治療方案的評(píng)估[12]。CEA作為一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物，常用于乳腺癌的輔助診斷和監(jiān)測(cè)患者的病情發(fā)展[13]。但CEA作為一種起源于消化系統(tǒng)癌癥的多糖復(fù)合物，在乳腺癌的診斷中還存在敏感度不夠，特異度差等缺點(diǎn)，因此，需要尋求新的腫瘤標(biāo)志物提高對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)能力。

LRG1屬于一種血清分泌蛋白，包裹于胞漿的囊泡中，由腫瘤細(xì)胞分泌到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)功能。已有研究證實(shí)，LRG1可作為血清腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤的早期篩查中[14-15]。如國(guó)內(nèi)學(xué)者陳周峰等[16]檢測(cè)直腸癌患者血清中LRG1的表達(dá)水平明顯高于良性腫瘤組和健康對(duì)照組，并隨腫瘤分期增加，LRG1的表達(dá)水平明顯升高。國(guó)外Yammoto等[17]檢測(cè)了184例胃癌患者血清內(nèi)LRG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LRG1高表達(dá)組的總生存率明顯低于LRG1低表達(dá)組，總體生存率的Cox多變量分析顯示LRG1表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組LRG1的表達(dá)水平明顯高于良性病變組和對(duì)照組，可作為乳腺癌的鑒別診斷參考指標(biāo)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LRG1的表達(dá)會(huì)隨著腫瘤分期增加表達(dá)上調(diào)，表明LRG1與乳腺癌病程進(jìn)展、嚴(yán)重程度有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑，臨床患者多因自查發(fā)現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)腫大而就診，淋巴結(jié)是否腫大是鑒別乳腺腫塊良、惡性的重要體征之一[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組LRG1的表達(dá)明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，意味著乳腺癌患者血清內(nèi)LRG1的升高與癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為早期判斷癌細(xì)胞是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評(píng)估指標(biāo)。此外，本研究通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，LRG1在乳腺癌組織內(nèi)呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，而癌旁組織基本不表達(dá)，表明LRG1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用?？梢?jiàn)，作為乳腺癌衍生的血液標(biāo)志物，LRG1的血清水平可作為乳腺癌診斷的潛在生物標(biāo)志物，值得今后臨床高度重視。

綜上所述，本研究表明LRG1的血清水平可作為乳腺癌患者潛在的診斷標(biāo)志物。當(dāng)然，腫瘤細(xì)胞并不是LRG1的唯一來(lái)源，在腫瘤微環(huán)境（tumor microenviroment，TME）中，包括內(nèi)皮細(xì)胞和髓細(xì)胞在內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞也有助于LRG1的產(chǎn)生。因此，LRG1聯(lián)合其他腫瘤分子標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，或許更有助于提高乳腺癌早期診斷率，這有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1] LIBSON S，LIPPMAN M.A review of clinical aspects of breast cancer[J].Int Rev Psychiatry，2014，26（1）：4-15.

[2] KATSURA C，OGUNMWONYI I，KANKAM H K，et al.Breast cancer： presentation， investigation and management[J].Br J Hosp Med （Lond），2022，83（2）：1-7.

[3] GIAQUINTO A N，SUNG H，MILLER K D，et al.Breast cancer statistics，2022[J].CA Cancer J Clin，2022，72（6）：524-541.

[4] W?RMANN B.Breast cancer： basics， screening， diagnostics and treatment[J].Med Monatsschr Pharm，2017，40（2）：55-64.

[5] DESAI P，AGGARWAL A.Breast cancer in women over 65 years- a review of screening and treatment options[J].Clin Geriatr Med，2021，37（4）：611-623.

[6] REN G H，HAO X Y，YANG S Y，et al.An efficient or methodical review of immunotherapy against breast cancer[J/OL].J Biochem Mol Toxicol， 2019， 33（8）：e22339.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31157481/.

[7] LUND A W，DE PALMA M.Targeting LRG1 boosts immunotherapy[J].Med（N，Y）， 2021，2（11）：1195-1197.

[8] JAVAID F，PILOTTI C，CAMILLI C，et al.Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1 （LRG1） as a novel ADC target[J].RSC Chem Biol，2021，2（4）：1206-1220.

[9] WANG Y，XING Q，CHEN X，et al.The clinical prognostic value of LRG1 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Curr Cancer Drug Targets，2019，19（9）：756-763.

[10] SINGHAL M，GENGENBACHER N，ABDUL PARI A A，et al.

Temporal multi-omics identifies LRG1 as a vascular niche instructor of metastasis[J].Sci Transl Med，2021，13（609）：eabe6805.

[11] CAMILLI C，HOEH A E，DE ROSSI G，et al.LRG1： an emerging player in disease pathogenesis[J].J Biomed Sci，2022，29（1）：6.

[12]王一祥，郭亞民，王蕾，等. 血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)胰腺癌早期診斷及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].世界華人消化雜志，2022，30（22）：978-983.

[13]陽(yáng)金豆，李建浩，周夏，等.MSCT 聯(lián)合血清 CAA199、CEA 檢查對(duì)結(jié)直腸癌及轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值[J].分子影像學(xué)雜志，2022，45（6）：842-846.

[14] HOEFSMIT E P，V?LLMY F，ROZEMAN E A，et al.Systemic LRG1 expression in melanoma is associated with disease progression and recurrence[J].Cancer Res Commun，2023，3（4）：672-683.

[15] CAI D，CHEN C，SU Y，et al.LRG1 in pancreatic cancer cells promotes inflammatory factor synthesis and the angiogenesis of HUVECs by activating VEGFR signaling[J].J Gastrointest Oncol，2022，13（1）：400-412.

[16]陳周峰，黃智銘，金瑞放.LRG1 在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（26）：1-3.

[17] YAMAMOTO M，NAKAO T，OGAWA W，et al.Overexpression of leucine-rich α2-glycoprotein-1 is a prognostic marker and enhances tumor migration in gastric cancer[J].Cancer Sci，2017，108（10）：1206-1219.

[18] MARINO M A，AVENDANO D，ZAPATA P，et al.Lymph node imaging in patients with primary breast cancer： concurrent diagnostic tools[J/OL].Oncologist，2020，25（2）：e231-e242.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32043792/.

[19] CHANG J M，LEUNG J W T，MOY L，et al.Axillary nodal evaluation in breast cancer： state of the art[J].Radiology，2020，295（3）：500-515.

[20] ZHAO R， JIANG H， CAO J，et al.Prediction of axillary lymph node metastasis in invasive breast cancer by sound touch elastography[J].Ultrasound Med Biol，2022，48（9）：1879-1887.

（收稿日期：2023-10-20） （本文編輯：白雅茹）